专利名称：鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法的制作方法
技术领域：
本发明属于兽医学，具体涉及鹿布氏杆菌病的血清检测诊断方法
背景技术：
布氏杆菌病是由布氏杆菌感染引起的世界范围内的重要人畜共患传染病。它的危害程度极大，不仅影响人们的身体健康，阻碍畜牧业的发展，还可造成严重的经济损失鹿布氏杆菌病是由布氏杆菌引起的一种鹿的慢性传染病,本病主要侵害生殖系统，致使母鹿发生流产和乳腺炎，公鹿发生睾丸炎和附睾炎。自1940年鹿布氏杆菌病被首次确立以来，鹿的布病广泛发生于世界各地，给养鹿业带来了严重的经济损失。据国外报道，鹿布氏杆菌病在一些鹿群的感染率高达50 % 60 %，个别鹿群甚至更高。目前，有关鹿的布病的特异性诊断方法尚未缺乏研究。近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光(IFA)和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，本试验方法自 70年代初期由 VAN WEEMEN、SCHUARS. ENGVALL 及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。酶联免疫吸附试验法以其灵敏度高(可达ng甚至pg水平)，特异性好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用，它已迈出医药、临床领域，步入农业、渔业、畜牧业和食品加工业。1976年,Cavleson等首次应用ELISA方法检测牛布氏杆菌抗体并发现其敏感性比试管凝集试验(SAT)高10 20倍后，许多学者相继应用ELISA对人、牛等动物的布氏杆菌病抗体检测进行了研究，结果均表明=ELISA比传统的SAT、补体结合试验(CFT)敏感，且特异性高。目前，对鹿的布病检测，还停留在平板和试管凝集试验等常规的血清学方法上，并以家畜判定标准作为鹿的判定标准。其特异性，敏感性，重复性和用ELISA方法检测牛等动物布氏杆菌病抗体所得的结果相比较，差距很大。说明以往的鹿的布病检测，仍停留在较低的水平。

发明内容
本发明的目的是提供ー种鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，用于鹿布氏杆菌病诊断，提高相对现有技术的诊断水平。本发明的检测方法所用生物材料包括作为抗原的布氏杆菌猪型2号苗(S2)、酶标抗体兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清本发明的检测方法检测步骤包括1、抗原包被在酶标板上选待检血清、阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、酶标抗体对照、抗体对照孔及底物对照七种用途的培养孔；将经超声波粉碎的布氏杆菌猪型2号苗用抗原稀释液按疫苗比稀释液I : 12.5-1 50的比例稀释。等量加入试验孔、阳性血清对照孔、阴性血清对照孔及抗原对照孔中，在兔抗鹿IgG-HRP对照孔、抗体对照孔及底物对照孔中加入与前述抗原液等体积的浓度为50mg/ml的牛血清白蛋白，之后将酶标板置35°C -42°C温箱孵育2-4h ；2、洗涤取出酶标板，甩去微孔中的溶液，向全部待检血清孔和对照孔等量加入洗液，加入量为将孔加满为止，之后室温(15-25°C )下放置3min,后倒掉,如此反复三次,空干(简称3X3，)；3、加血清将被检血清加稀释液按血清比稀释液I : 50-1 200比例稀释，等量加到待检血清孔中，在阳性血清对照孔和抗体对照孔中加入用8-10倍标准阳性血清体积的稀释液稀释的阳性血清液，在阴性血清对照孔中加入用8-10倍标准阴性血清体积的稀释液稀释的阴性血清液，在抗原对照孔中加入血清稀释液，前述材料的加入量均与步骤I中每孔所加抗原液体积相同，之后置35°C _42°C，温箱中O. 25-lh后，3X3’洗涤；4、加兔抗鹿 IgG-HRP将兔抗鹿IgG-HRP用抗原稀释液按兔抗鹿IgG-HRP比稀释液I : 1600-1 6400的比例稀释，等量加入待检血清孔和对照孔中，每孔加入量与步骤I中每孔所加抗原液体积相同，之后置35°C _42°C温箱中O. 25-lh后，3X3’洗涤；5、加底物液在全部待检血清孔和对照孔中加底物液，每孔加入量与步骤I中每孔所加抗原液体积相同，置35°C _42°C温箱中O. 25-lh。6、终止反应取出反应板，在全部待检血清孔和对照孔中加的2M H2SO4，以终止反应，每孔加入量为步骤I中每孔所加抗原液体积的1/2。7、使用仪器测量完成步骤6的酶标板静止5min后，将其放在酶联免疫检测仪上，在490nm处空白调零，并测每孔的OD值，OD值> O. 32判定为阳性。以上为本发明基本方案本发明的兔抗鹿IgG-HRP的获得是先制得兔抗鹿IgG，再用兔抗鹿IgG和辣根过氧化物酶(HRP)制备兔抗鹿IgG-HRP。制备兔抗鹿IgG取来自健康鹿的血清，用50%饱和(MM)2SO4盐析一次后，再用37. 5%饱和(NH4) 2S04盐析三次，提取鹿血清IgG，充分透析至无NH4+、S042+。以O. OlM pH8. O磷酸缓冲液透析平衡， 过DEAE-32柱。以O. OlM pH8. O磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白部分，測定蛋白含量；以聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定其纯度。以鹿血清对照，若在加有过柱鹿血清IgG的凝胶管内仅有一条帯，且此带的位置恰与加鹿血清的凝胶柱上的Y -球蛋白带组中最后一条带相一致，则说明所提蛋白为鹿IgG，且纯度高。将所提鹿血清IgG浓缩，-20°C冰箱中保存备用。制备兔抗鹿IgG-HRP按下述用量或用量相等倍数变化所取的原料及过程制备将5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于O. 5ml蒸馏水中，加入新配制的O. 06M的NaIO4水溶液O. 5ml，混匀置冰箱中4°C 30min,取出后加入O. 16M的こニ醇水溶液O. 5ml，于室温放置30min后，加入含有5mg纯化兔抗鹿IgG的水溶液Iml，混匀并装入透析袋，放于800ml，O. 05M pH9. 5碳酸盐缓冲液搅拌6h，使之结合。然后，从透析袋中吸收出来，加入NaBH4溶液(5mg/ml) O. 2ml，置4°C冰箱中2h，将上述结合物混合液加入等体积pH7. O饱和(NH4) 2S04溶液,置4°C冰箱中301^11，30001'/1^11离心301^11，将得到的沉淀物溶于2 31111，0. 02M pH7. 4磷酸盐缓冲液中，并在800mlPBS中透析12h,中间换液三次,然后4000r/min离心5min,除去不溶物，即得辣根过氧化物酶(HRP)-兔抗鹿IgG结合物。最后，用PBS加至4.5ml分装。_20°C冷冻保存备用。本发明所用抗原通过以下过程预处理，用灭菌蒸馏水稀释布氏杆菌猪型2号苗，并制成100亿/ml菌液，菌液至于-20°c冷冻Ih后，放于室温融解lh，反复冻融3次，置超声波破碎器中作用15min后，12000r/min离心Imin去沉淀,其上清液装入透析袋中，以Iml菌液用800ml的比例，用生理盐水透析，浓缩和測定蛋白含量，当蛋白含量为3. 0μ g/ml吋，分装保存于冰箱中备用。本发明中使用的抗原稀释液为按碳酸钠(Na2CO3)O. 318g、碳酸氢钠(NaHCO3)O. 560g、加入去离子水IOOOml体积的用量比例取材，先用少量去离子水使固体物溶解，待完全溶化后补充加入全部去离子水后，所得到的溶液。本发明中使用的洗液为按磷酸氢ニ钠(Na2HPO4· 12H20) 2. 90g、磷酸 ニ氢钾(KH2PO4) O. 20g,氯化钠(NaCl) 8. 0g、氯化钾(KCl)O. 20g、吐温-20 (Tween-20) O. 5ml、加入去离子水 IOOOml 体积的用量比例取材，先用少量去离子水使固体物溶解，待完全溶化后补充加入全部去离子水所得到的溶液。本发明中使用的血清及酶标抗体稀释液为以每O. Ig牛血清白蛋白加本发明中制备的洗液IOOml的比例混合，溶化混匀所得到的溶液。本发明中的底物溶液为按柠檬酸O. 467g、磷酸氢ニ钠(Na2HPO4 · 12H20) I. 841g、加去离子水100ml，溶化后加邻苯ニ胺O. 04g、溶化混匀后加过氧化氢(H2O2)O. 15ml，再混合均匀，过程及材料用量比例所得到的溶液。本发明的积极效果是，以布氏杆菌猪型2号苗(S2)为抗原，兔抗鹿IgG-HRP为酶标抗体，用间接酶联免疫吸附检测诊断鹿布氏杆菌病，和以往的诊断方法相比，具有特异性、敏感性和重复性较好，诊断精确的优点。效果验证I、布氏杆菌脂多糖抗原(LPS，脂抗)，超声波破碎抗原(SA，超抗)、布氏杆菌离心抗原(SAT，离抗)三种抗原各要素条件的比较表I三种抗原ELISA各要素条件的比较
权利要求
1.鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是 (1)所用生物材料包括作为抗原的布氏杆菌猪型2号苗、酶标抗体兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清 (2)检测步骤包括 ①抗原包被 在酶标板上选定待检血清、阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、酶标抗体对照、抗体对照孔及底物对照七种培养孔；将经超声波粉碎的布氏杆菌猪型2号苗用抗原稀释液以疫苗比稀释液I : 12.5-1 50的比例稀释，等量加入待检血清孔、阳性血清对照孔、阴性血清对照孔及抗原对照孔中，在兔抗鹿IgG-HRP对照孔、抗体对照孔及底物对照孔中加入与前述抗原液等体积的浓度为50mg/ml的牛血清白蛋白，之后将酶标板置35°C _42°C温箱孵育2-4h ； ②洗漆 取出酶标板，甩去微孔中的溶液，向全部待检血清孔和对照孔加入洗液，加入量为将孔加满为止，室温下放置3min以上，然后倒掉，如此反复三次，空干； ③加血清 将被检血清加稀释液按血清比稀释液I : 50-1 200的比例稀释，等量加到待检血清孔中、在阳性血清对照孔和抗体对照孔中加入用8-10倍标准阳性血清体积的稀释液稀释的阳性血清液，在阴性血清对照孔中加用8-10倍标准阴性血清体积的稀释液稀释的阴性血清液，在抗原对照孔中加入血清稀释液，前述材料的加入量均与步骤①中每孔所加抗原液的体积相同，之后置37°C温箱中O. 25-lh后，3X3’洗涤； ④加兔抗鹿IgG-HRP 将兔抗鹿IgG-HRP用抗原稀释液按兔抗鹿IgG-HRP比稀释液I : 1600-6400的比例稀释，等量加入全部待检血清孔孔和对照孔中，每孔加入量与步骤①中每孔所加抗原液的体积相同，之后置35°C _42°C温箱中O. 25-lh后，3X3’洗涤； ⑤加底物液 在全部待检血清孔和对照孔中加底物液，每孔加入量与步骤①中每孔所加抗原液的体积相同，置35°C _42°C温箱中O. 25-lh。
⑥终止反应 取出反应板，在全部待检血清孔和对照孔中加的2M H2SO4,以终止反应，每孔加入量为步骤①中每孔所加抗原液的体积的1/2 ； ⑦使用仪器测量 完成步骤⑥的酶标板静止5min后，将其放在酶联免疫检测仪上，在490nm处空白调零，并测每孔的OD值，OD值彡O. 32判定为阳性。
2.根据权利要求I所述的鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的兔抗鹿IgG-HRP通过以下过程制备 (I)制备兔抗鹿IgG 取来自健康鹿的血清，用50%饱和(MM)2SO4盐析一次后，再用37. 5%饱和(MM)2SO4盐析三次，提取鹿血清186，充分透析至无见14+、3042+。以0.0謹pH8. O磷酸缓冲液透析平衡，过DEAE-32柱，以O. OlM pH8. O磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白部分，测定蛋白含量；以聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定其纯度，以鹿血清对照，若在加有过柱鹿血清IgG的凝胶管内仅有一条带，且此带的位置恰与加鹿血清的凝胶柱上的Y-球蛋白带组中最后一条带相一致，则说明所提蛋白为鹿IgG，且纯度高，将所提鹿血清IgG浓缩，_20°C冰箱中保存备用； (2)制备兔抗鹿IgG-HRP 按下述用量或用量相等倍数变化所取的原料及过程制备 将5mg辣根过氧化物酶溶于O. 5ml蒸馏水中，加入新配制的O. 06M的NaIO4水溶液.O.5ml,混匀置冰箱中4°C 30min，取出后加入O. 16M的乙二醇水溶液O. 5ml,于室温放置.30min后，加入含有5mg纯化兔抗鹿IgG的水溶液1ml，混匀并装入透析袋，放于800ml，.0.05M pH9. 5碳酸盐缓冲液搅拌6h，使之结合，然后，从透析袋中吸收出来，加入浓度为.5mg/ml的NaBH4溶液O. 2ml，置4°C冰箱中2h，将上述结合物混合液加入等体积pH7. O饱和(NH4)2SO4溶液，置4°C冰箱中30min，3000r/min离心30min，将得到的沉淀物溶于2 3ml，.0.02M pH7. 4磷酸盐缓冲液中，并在800mlPBS中透析12h，中间换液三次，然后4000r/min离心5min，除去不溶物，即得辣根过氧化物酶-兔抗鹿IgG结合物，最后，用PBS加至4. 5ml分装，-20°C冷冻保存备用。
3.根据权利要求I所述的鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的抗原通过以下过程预处理，用灭菌蒸馏水稀释布氏杆菌猪型2号苗，并制成100亿/ml菌液，菌液至于-20°C冷冻Ih后，放于室温融解lh，反复冻融3次，置超声波破碎器中作用.15min后，12000r/min离心Imin去沉淀,其上清液装入透析袋中，以Iml菌液用800ml的比例，用生理盐水透析，浓缩和测定蛋白含量，当蛋白含量为3. O μ g/ml时，分装保存于冰箱中备用。
4.根据权利要求I所述的鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的抗原稀释液为按碳酸钠O. 318g、碳酸氢钠O. 560g、加入去离子水得IOOOml体积的用量比例取材，先用少量去离子水使固体物溶解，待完全溶化后补充加入全部去离子水所得到的溶液。
5.根据权利要求I所述的鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的洗液为按磷酸氢二钠2. 90g、磷酸二氢钾O. 20g、氯化钠8. 0g、氯化钾O. 20g、吐温-200. 5ml、加入去离子水得IOOOml体积的用量比例取材，先用少量去离子水使固体物溶解，待完全溶化后补充加入全部去离子水所得到的溶液。
6.根据权利要求I所述的鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的血清及酶标抗体稀释液为以每O. Ig牛血清白蛋白加本发明中制备的洗液IOOml的比例混合，溶化混匀所得到的溶液。
7.根据权利要求I所述的鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，其特征是其中的底物溶液为以下按过程及材料用量比例所得到的溶液；柠檬酸O. 467g、磷酸氢二钠1.841g、加去离子水100ml，溶化后加邻苯二胺O. 04g、溶化混匀后加过氧化氢O. 15ml，再混合均匀。
全文摘要
鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法，属于兽医领域。用于鹿布氏杆菌病诊断，提高相对现有技术的诊断水平。本发明的检测方法所用生物材料包括作为抗原的布氏杆菌猪型2号苗(S2)、酶标抗体兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清检测步骤包括抗原包被、洗涤、加血清、加兔抗鹿IgG-HRP、加底物液、终止反应、用酶联检测仪在490nm处空白调零，并测每孔的OD值，OD值≥0.32判定为阳性。本发明的积极效果是，以布氏杆菌猪型2号苗(S2)为抗原，兔抗鹿IgG-HRP为酶标抗体，用间接酶联免疫吸附检测诊断鹿布氏杆菌病，和以往的诊断方法相比，具有特异性、敏感性和重复性较好，诊断精确的优点。
文档编号G01N33/535GK102621304SQ20111003181
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月30日 优先权日2011年1月30日
发明者于淼, 刁燕, 刘东旭, 刘晓, 张梦, 时坤, 李建明, 杜锐 申请人:吉林农业大学