专利名称：一种检测生物体内微囊藻毒素mc-lr的方法
技术领域：
本发明涉及微囊藻毒素检测技术领域，具体地说，是一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，尤其是涉及虾体内累积的微囊藻毒素MC-LR的定性及定量检测方法。
背景技术：
铜绿微囊藻水华是世界各国淡水、咸淡水湖泊、池塘中分布广、规模大、持续时间长的一种产毒蓝藻类水华，对多种生物都有强烈的毒害作用。铜绿微囊藻水华在我国尤为严重，2007年在我国太湖、滇池和巢湖爆发的水华，引发了极大的关注，造成了极大的负面影响，正是由这种藻类大量繁殖造成的。微囊藻的死亡分解不仅可以致使水体缺氧而发生恶臭，更为严重的是在藻细胞裂解的过程中能释放出有强烈毒性的微囊藻毒素MC-LR，是水体中危害最严重的一类。在过去10年中，有大量的研究证实，自然水体中的微囊藻毒素MC-LR对鸟类、两栖类、无脊椎动物和鱼类甚至植物都有致死作用。铜绿微囊藻产生的微囊藻毒素MC-LR对人类健康也有潜在的影响。有研究结果表明，太湖地区饮用微囊藻污染的水源与小学生肝功能损害之间具有正相关关系。微囊藻毒素MC-LR已被确定为目前已知的最强的促癌剂之一。陈隽和谢平报道，在其所研究的两种淡水食用虾，秀丽白虾和日本沼虾样品中，大约30%的虾的肌肉组织中微囊藻毒素积累浓度超过了世界卫生组织推荐的限值，而肝胰腺中微囊藻毒素的含量几乎全部超标。查广才等的实验结果显示，铜绿微囊藻能在凡纳滨对虾的养殖水体中大量爆发，形成单一优势种，种群增长快、持续时间长。其产生的铜绿微囊藻毒素的毒性表现为时间和密度双重效应。然而，到目前为止，尚未见铜绿微囊藻对虾类毒害机理以及毒素在体内的生物累积的系统报道；国内对微囊藻危害虾类的严重性关注不够，微囊藻毒素通过食物链进行传递并累积的情况鲜有报道。由于微囊藻毒素MC-LR在生物样品中的浓度通常很低，干扰物质多，因而需要建立可靠、稳定的定量分析方法，并通过有效的富集、分离和纯化过程实现高灵敏度、高专属性分析，为进一步研究微囊藻毒素MC-LR在生物体内的代谢及解毒过程奠定基础，为虾类健康养殖和食品安全管理提供科学方法。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术中微囊藻毒素MC-LR检测方法不完善的现状，提供一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，能可靠、稳定地对生物体内微囊藻毒素MC-LR进行定性定量分析。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，包括以下步骤:
(I)微囊藻毒素MC-LR的提取:称取冷冻干燥的生物组织样品于研钵中研碎，向研碎后生物组织样品中加入提取液，匀浆，超声破碎，离心，移取上清液至干净容器中避光保存，再加入提取液清洗沉淀，离心后收集上清液，合并所得上清液；所述提取液为EDTA-Na2的甲酸水溶液，EDTA-Na2的浓度为0.0l 0.05mol/L,甲酸的体积百分比浓度为1% 5% ；
(2)微囊藻毒素MC-LR的富集、分离与纯化:将步骤(I)中所得的上清液加入已预先活化的HLB固相萃取柱进行富集，先用超纯水淋洗，再用体积百分比浓度为10%的甲醇水溶液淋洗，最后用无水甲醇洗脱，收集洗脱液用氮气吹干，所得固体用甲酸-甲醇-水溶液溶解制成样品待测液，所述甲酸-甲醇-水溶液中，甲酸的体积百分比浓度为1%，甲醇的体积百分比浓度为20% ；
(3)定性分析:采用UPLC-MS联用方法，根据微囊藻毒素MC-LR标准品的保留时间和特征碎片离子峰的荷质比m/z进行定性；
色谱条件:流动相A为含体积百分比浓度为0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含体积百分比浓度为0.1%甲酸的甲醇溶液；色谱柱=C18柱，IOOmmX 2.lmm, 1.8ym ;柱温:40°C;进样体积为10 μ L ;流速为0.35mL/min ；UPLC梯度洗脱程序见表1:
表I UPLC梯度洗脱程序
权利要求
1.一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)微囊藻毒素MC-LR的提取:称取冷冻干燥的生物组织样品于研钵中研碎，向研碎后生物组织样品中加入提取液，匀浆，超声破碎，离心，移取上清液至干净容器中避光保存，再加入提取液清洗沉淀，离心后收集上清液，合并所得上清液；所述提取液为EDTA-Na2的甲酸水溶液，EDTA-Na2的浓度为0.0l 0.05mol/L,甲酸的体积百分比浓度为1% 5% ； (2)微囊藻毒素MC-LR的富集、分离与纯化:将步骤(I)中所得的上清液加入已预先活化的HLB固相萃取柱进行富集，先用超纯水淋洗，再用体积百分比浓度为10%的甲醇水溶液淋洗，最后用无水甲醇洗脱，收集洗脱液用氮气吹干，所得固体用甲酸-甲醇-水溶液溶解制成样品待测液，所述甲酸-甲醇-水溶液中，甲酸的体积百分比浓度为1%，甲醇的体积百分比浓度为20% ； (3)定性分析:采用UPLC-MS联用方法，根据微囊藻毒素MC-LR标准品的保留时间和特征碎片离子峰的荷质比m/z进行定性； 色谱条件:流动相A为含体积百分比浓度为0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含体积百分比浓度为0.1%甲酸的甲醇溶液；色谱柱=C18柱，IOOmmX 2.lmm, 1.8ym ;柱温:40°C;进样体积为10 μ L ;流速为0.35mL/min ；UPLC梯度洗脱程序见下表:
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物体为虾或大型潘。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的离心条件为3000 8000r/min，超声破碎时间3 5min，超声破碎温度O 4°C。
全文摘要
本发明公开了一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，包括微囊藻毒素MC-LR的提取、微囊藻毒素MC-LR的富集、分离与纯化、UPLC-MS定性分析和外标法定量分析步骤。本发明方法能对生物体内的微囊藻毒素MC-LR进行定性、定量检测，检测结果可靠，重现性好，灵敏度高，应用该方法能检测虾类等生物体内是否存在累积的MC-LR；本发明方法不仅适用于生物体内微囊藻毒素MC-LR的定性及定量检测，而且能为研究微囊藻毒素在生物体内的累积、传递和代谢解毒以及对水产品进行的安全性评估提供参考；该发明方法操作简单，能节省检测时间和化学试剂。
文档编号G01N30/06GK103197021SQ20131012005
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者刘利平, 苏晓明, 陈桃英 申请人:上海海洋大学