专利名称：真空干燥蛋白的方法、制得的蛋白产品和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种真空干燥蛋白的方法和以该方法制得的蛋白产品和包含该蛋白产品的试剂盒。
背景技术：
干燥是从各种物料中去除湿分的过程，各种物料可以是固体、液体或气体，固体又可分大块料、纤维料、颗粒料、细粉料等等，而湿分一般是物料中的水分，也可以是其它溶剂。在生物药品和生物制剂中，溶剂为各种缓冲液和水分。常用的干燥法从物料温度是否变化，可以分为恒温干燥、加热干燥和低温干燥。在生物制品中，常用的为恒温干燥和低温干燥。比较常用的低温干燥主要为真空冷冻干燥。真空冷冻干燥是先将湿物料在共晶点 (三相点)温度以下冻结，使水分(液体)变成固态的冰，然后在适当的真空度下，使冰直接升华为水蒸汽，再用真空系统中的冷凝器将水蒸汽冷凝，获得干燥的制品以达到长期保存的目的。该方法具有真空和低温两个特殊的优良条件，具有多个优点，适用范围广。但是真空冷冻干燥的缺点主要是干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等。而相对于真空冷冻干燥，在保持生物样品活性的条件下，采用真空干燥，可以节省能耗，减少设备费用。真空干燥是指在负压下进行的干燥方法，原理是利用真空环境下液体沸点降低的特点来干燥物品。在化工领域和药品领域，真空干燥应用较多；而在生物制品领域，由于生物制品，尤其是蛋白，在常温下容易失去生物活性，因此鲜有人尝试真空干燥。

发明内容
本发明的目的是提供一种常温下真空干燥蛋白的方法，以及采用该方法制得的含有稳定蛋白的产品、容器和试剂盒。本发明的真空干燥蛋白的方法，包括以下步骤(1)、将蛋白与海藻糖混合，其中蛋白的量为2. 5 10 μ g，海藻糖的添加量是1 5wt% ；可以适量添加血液抗凝剂，优选地，添加Iwt%的肝素钠；O)、将样品分装至容器中，不加盖，置于真空干燥机中真空干燥，温度为20°C 30°C、优选为25°C，真空度< lOOPa、优选为2 lOOpa，干燥2小时；干燥后，取出样品置于生物安全柜里加盖密封；(3)、采用Co60在常温下对蛋白质进行辐照灭菌，辐照强度为lkGy、2kGy、4kGy或 6kGy，时间为1小时。优选地，所述步骤(1)中还包括混合有甘氨酸和/或赖氨酸，以避免辐照给蛋白带来的交联现象，其中，甘氨酸、赖氨酸的浓度均为lwt%。作为优选实施方式，混合样品分装于采血管中，采血管中没有其它添加剂。作为优选实施方式，本方法中的蛋白是结核杆菌特异性融合蛋白TB1、TB2、TB1和TB2的混合物、或伽马干扰素，其中TB1、TB2蛋白的氨基酸序列如序列号No. 1和No. 2所示。本方法提供一种用来检测潜伏性结核杆菌感染的蛋白产品，该蛋白产品包含结核杆菌特异性融合蛋白TB1、TB2、TB1和TB2的混合物，其中TB1、TB2蛋白的氨基酸序列如序列号No. 1和No. 2所示。该蛋白产品 通过以下方法真空干燥而得(1)、将蛋白、海藻糖和肝素钠混合，其中蛋白的量为2. 5 10 μ g，海藻糖的添加量是1 5wt%，肝素钠的添加量是Iwt % ；(2)、将样品分装至容器中，不加盖，置于真空干燥机中真空干燥，温度为20°C 30°C、优选25°C，真空度< lOOPa、优选2 lOOPa，干燥2小时；干燥后，取出样品加盖密封；(3)、采用Co60在常温下对蛋白质进行辐照灭菌，辐照强度为lkGy、2kGy、4kGy或 6kGy，时间为1小时。优选地，所述步骤(1)中还包括混合有甘氨酸和/或赖氨酸，以避免辐照给蛋白带来的交联现象，其中，甘氨酸、赖氨酸的浓度均为l t%。作为优选实施方式，TB1、TB2或伽马干扰素干燥在真空采血管中；TB1、TB2可以干燥在同一个真空采血管中，也可以干燥在不同的真空采血管中。本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括采用本发明方法制得的含有结核杆菌特异性融合蛋白TBI、TB2、或TBl和TB2混合物的容器、和含有伽马干扰素的容器，其中TBI、 TB2或TBl和TB2混合物或伽马干扰素通过本发明的真空干燥方法干燥在容器中；优选地， TBl和TB2干燥在同一个容器中；优选地，所述容器是没有任何添加剂的采血管；其中TBI、 TB2蛋白的氨基酸序列如序列号No. 1和No.2所示。优选地，该试剂盒用于检测潜伏性结核杆菌感染。试剂盒中的伽马干扰素用作检测时的标准品。在本发明的具体实施方式
中，采用TBl和/或TB2刺激血样，通过检测伽玛干扰素的含量来说明TBl和/或TB2蛋白的活性，主要是基于以下原理机体感染结核杆菌以后，存于血液中的记忆性淋巴细胞会在再次接触结核杆菌特异性抗原时，产生和分泌伽玛干扰素。通过对该细胞因子的定量检测，可以对疾病的感染状况进行判断。本发明的蛋白产品TB1、TB2分别包括结核杆菌的CFP-10和ESAT-6区，这两个区域在卡介苗和大多数非结核杆菌中普遍缺失，因此CFP-10和ESAT-6区编码的蛋白是不能激活卡介苗和大多数非结核杆菌感染的感染者的免疫细胞，而仅能激活带有ESAT-6和 CFP-10区的结核杆菌感染者的免疫细胞。因而应用基因工程技术将ESAT-6和/或CFP-10 区修饰后表达成为TBl和/或TB2，与新鲜采取的抗凝剂抗凝的全血充分混合后孵育，结核杆菌感染者的全血细胞中的免疫细胞被激活，释放细胞因子如伽玛干扰素等；24小时以后，收集血浆，并应用酶联免疫法检测其中的伽玛干扰素的含量，即可判断TBl和/或TB2 的活性。如果TBl和/或TB2有活性，即能刺激细胞释放伽玛干扰素，若TBl和/或TB2失活，则不能刺激细胞释放伽玛干扰素。全血刺激实验按照以下步骤进行1、收集新鲜采集的肝素钠抗凝的全血；储存于室温，并于16小时内进行样品刺激；进行每一种刺激的全血量不要少于0. 85毫升。2、全血刺激步骤(无菌操作)
1)、保持水浴箱37°C恒温状态；将肝素钠抗凝的全血上下充分混勻20次，取1毫升全血加入至含有TBl和TB2蛋白的真空采血管中，盖紧盖子；剧烈晃动采血管以充分混合刺激剂和抗凝全血，直到管壁上有泡沫出现；将混勻后的采血管放到试管架上，立即放入至 37°C的水浴箱中，并保持采血管直立向上； 2)、将采血管置于37°C水浴箱中孵育24小时；3)、将采血管中孵育后的样品倒入1. 5ml离心管中，10，000 13，OOOrpm离心5分钟；4)、将上清移入新的试管中，进行后续检测。本发明的有益之处在于真空干燥的干燥温度高、干燥速率大、节能、设备密闭防污染，能够保证物料的生物学活性，适用于生物制品的干燥；所提供的真空干燥产品和真空干燥试剂盒可以用于常温下的结核杆菌检测，方便灵活，灵敏度高，特异性高。


图1是回收的ESAT-6、CFP-10片段的凝胶电泳图；图2是质粒载体pET-28b_LFnCHis的质粒图谱。
具体实施例方式结合具体实施方式
，说明本发明，但本发明并不局限于此。实施例一 TBI、TB2基因的克降与表汰TBl蛋白由前导蛋白和结核杆菌特异性蛋白CFP-10融合而成，TB2蛋白由前导蛋白和结核杆菌特异性蛋白ESAT-6融合而成，其中前导蛋白内容参见中国发明专利 02810886. 8。1、TBI、TB2基因表达载体构建。委托DNA2. 0公司(美国)按照序列No. 3和序列No. 4合成基因CFP-10和ESAT-6， 分别连接至载体pj51中构建成质粒pj51 :8775-cfp和pj51 :8776-eSat。用StuI和XhoI双酶切上述扩增的质粒，回收ESAT-6、CFP-10片段，结果见图1。构建质粒载体pET-28b-LFnCHis。构建过程在Lfn核酸序列的5’端加上CCATG 序列，以形成NcoI (CCATGG)酶切位点，3，端加上AGGCCT序列，形成StuI (AGGCCT)酶切位点，并确保开放读码框不变。全序列合成含有NcoI和StuI酶切位点的Lfn序列。用NcoI 和StuI双酶切合成的含有NcoI和StuI酶切位点的Lfn序列，回收片段，然后与同样以StuI 和NcoI双酶切的pET-28b(+)载体连接，构建成质粒载体pET-28b-LfnCHis。构建方法为常规分子克隆操作。Lfn的核苷酸序列和氨基酸序列分别为序列号No. 5、No. 6所示序列。质粒载体pET-28b-LFnCHis的质粒图谱见图2。用StuI、XhoI双酶切载体质粒pET-28b-LFnCHis，并回收。将回收的载体片段pET-28b-LFnCHis与回收的ESAT-6或者CFP-IO用T4连接酶连接，形成质粒 pET28b-LfnCFP10和pET28b_LfnESAT6，转化大肠杆菌DH5 α。挑选阳性克隆，酶切鉴定。2、重组载体诱导表达。将含有重组质粒pET28b-LfnCFP10和pET28b_LfnESAT6的DH5 α菌种接种到 3ml的LB培养基中，在37°C下，摇床过夜摇菌培养。用OMEG质粒提取试剂盒提取质粒pET28b-LfnCFP10和pET28b_LfnESAT6，转化大肠杆菌ER2566。挑取单克隆，接种到3ml的 LB培养基中，37°C摇菌培养。到OD = 0. 6时加入IPTG，终浓度为ImM，在37°C下200rpm诱导4小时，离心收集细菌沉淀。加入50 μ 1的PBS缓冲液，重新悬浮，等体积加入50 μ 1的 2Χ浓缩的加样缓冲液，沸水浴5分钟。用12%聚丙烯酰胺胶电泳分析蛋白表达量。3、重组 蛋白纯化。通过预试验得知该蛋白为包涵体。从冻存的含有质粒pET28b-LfnCFP10和pET28b_LfnESAT6的大肠杆菌ER2566中挑取100 μ 1甘油菌接种到200ml的LB培养基中，37°C下、200rpm过夜摇菌培养。取IOOml 菌液接种到IL的发酵培养基中，37°C下、200rpm培养，当OD = 0. 8 1. 2时加入IPTG，诱导4小时，离心，收集沉淀。沉淀细菌用PBS重悬浮2次，离心收集沉淀。使用的缓冲液1)、悬浮细胞缓冲液40mM PBS, pH = 8. 0 ；2)、包涵体洗涤液含0. 5M尿素的40mM的PBS，pH = 8. 0 ；3)、包涵体溶解液含8M尿素、2% NLS、500mM NaCl的IOOmM三乙醇胺，pH = 8. 0 ；4)、IMAC 平衡液含 8M 尿素、2% NLS、5mM 咪唑、500mM NaCl 的 IOOmM 三乙醇胺， pH = 8. 0 ；5)、洗柱缓冲液同平衡液相同；6)、洗脱液1 含500mM咪唑、8M尿素和2% NLS、500mM NaCl的IOOmM三乙醇胺， pH = 8. 0 ；洗脱液2 含 500mM 咪唑、500mM NaCl 的 IOOmM 三乙醇胺，pH = 8. 0。纯化过程I、样品准备1)、重悬浮50g细胞于500ml细胞悬浮液中；2)、用APV均质仪勻浆；3)、12000rpm，4°C离心 30min ；4)、取Iml离心上清SDS-PAGE分析，并弃去上清，沉淀用300ml包涵体洗涤液洗涤；5)、重复步骤4);6)、将洗涤沉淀用IOOml包涵体溶解液，搅拌过夜溶解；7)、4°C下、12000rpm离心溶解过夜的包涵体溶解液30min ；8)、离心得到的上清用0. 45 μ m和0. 22 μ m滤膜过滤。II、蛋白的柱纯化纯化过程初步分为两步，第一步为螯合层析，使用GE Healthcare公司的螯合 SepHarese FF树脂，第二步为除热源，使用GE Healthcare公司的S印Hadex G-25树脂。其中，螯合层析的步骤为1)、用 0. 5N NaOH 洗柱；2)、用注射用水冲洗柱床；3)、用0. IN硫酸镍溶液活化树脂；
4)、用注射用水冲洗柱子；

5)、用柱平衡缓冲液平衡柱子；6)、以 0. 5ml/min 的速率上样；7)、用洗柱缓冲液冲洗柱子；8)、用洗脱液2洗脱柱子上收集的蛋白。除热源的过程为(1)、用IN NaOH浸泡柱床2h，用注射用水洗柱到流出液为中性；(2)、将预去除热源的蛋白液上样到G-25树脂柱中；(3)、用PBS缓冲液洗柱，收集洗脱液；即得到除去热源的TBl或TB2蛋白。实施例二 TBI、TB2蛋白的真空干燥(1)取洁净的离心管，将5 1%海藻糖、^^%肝素钠、1(^8181、1(^8182、^^% 甘氨酸、赖氨酸加入至离心管中，在生物安全柜里，加入Iml PBS溶解，在振荡器上混勻；(2)在生物安全柜里，将上述混合好的样品分装至无添加剂的真空采血管里。将分装好的样品，不加盖，置于上海恒一科学仪器有限公司DZF-6050B型真空干燥箱中，罩上真空罩，关紧进气阀，打开真空泵；在25°C、真空度为70Pa的条件下，真空干燥2小时。干燥完成后，打开进气阀，关掉真空泵，取出样品；在生物安全柜里，盖上采血管的帽子；(3)采用Co60对蛋白质进行辐照灭菌；辐照强度为2kGy，时间为1小时。实施例三真空干燥后的TBI、TB2蛋白的性能测定采用实施例二的方法，对9个TB1+TB2蛋白样品进行真空干燥，再刺激同一份血样。通过测量采用TB1+TB2蛋白刺激后释放到血浆中的伽马干扰素的含量，评价真空干燥时海藻糖对TB1+TB2蛋白的保护作用。其中，刺激血样样本量为1ml，未干燥的TB1+TB2蛋白作为对照。表1 未干燥的和真空干燥的TBl和TB2蛋白的性能比较
权利要求
1.一种真空干燥蛋白的方法，包括以下步骤(1)、将蛋白、海藻糖及肝素钠混合，其中蛋白的量是2. 5 10 μ g，海藻糖的添加量是 1 5wt%，肝素钠的添加量是Iwt % ；O)、将样品分装至容器中，不加盖，置于真空干燥机中真空干燥，温度为20°C 30°C， 真空度2 lOOpa，干燥2小时；干燥后，取出样品置于生物安全柜里加盖密封；(3)、采用Co60在常温下对蛋白质进行辐照灭菌，辐照强度为时间为1小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中还包括混合有甘氨酸和/或赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，真空干燥温度为25°C。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白为TBI、TB2、TBI和TB2的混合物、或伽马干扰素，其中TBl和TB2的氨基酸序列分别是序列号No. 1和No. 2所示的序列。
5.一种根据权利要求1 4任一项所述的方法制得的蛋白产品。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1 4任一项所述方法制备的含有TBI、TB2、或TBl和TB2混合物的容器、和含有伽马干扰素的容器。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有TBl和TB2混合物的容器和含有伽马干扰素的容器。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种真空干燥蛋白的方法和利用该方法制得的蛋白产品和包含该蛋白产品的试剂盒。本发明真空干燥蛋白的方法包括将蛋白与海藻糖及血液抗凝剂混合，在室温条件下真空干燥，利用Co60对干燥后的蛋白进行辐照灭菌。利用本发明的方法制得的蛋白产品包括含有结核杆菌特异性融合蛋白的试剂盒。本发明的真空干燥蛋白的方法干燥温度高、干燥速率大、节能、设备密闭防污染，能够保证物料的生物学活性，适用于生物制品的干燥；所提供的真空干燥产品和真空干燥试剂盒可以用于常温下的结核杆菌检测，方便灵活，灵敏度高，特异性高。
文档编号G01N33/569GK102408467SQ201010294090
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者吕亦晨 申请人:海口维瑅瑷生物研究院