专利名称：：一种高效液相色谱－荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法
技术领域：
：本发明属于分析化学领域，涉及一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法。
背景技术：
：目前国内外报道的检测Tyr和Trp的方法较多，包括高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)、质谱法(MS)等。HPCE分析时间较短，分离能力较强，但检测限(紫外吸收检测器)不及HPLC，且重复性较差；质谱技术亦有操作复杂、重复性较差的不足之处；相对来说，HPLC应用较广泛。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)具有吲哚结构，自身能产生荧光，故可采用荧光法检测。国内外已有采用HPLC-荧光法(HPLC-FD)或HPLC-紫外法(HPLC-UV)分别单独检测血清中Tyr和Trp的报道，有采用HPLC-UV同时测定Tyr和Trp的报道，也有采用高效液相色谱法测定脑脊液中Tyr和Trp含量的报道，但目前尚未有采用HPLC-FD同时测定血清中的Tyr和Trp的报道。近来，Sanchez-Machado等用HPLC-FD同时测定虾废料中的Tyr和Trp含量，但是线性范围窄，虽能满足虾废料中氨基酸的检测需要，但不能满足临床血清样本的检测要求。
发明内容本发明的目的是提供一种高效液相色谱_荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本发明分析时间短，试剂消耗少，灵敏度高，特异性好，能满足临床血清样本的检测要求。本发明可以通过以下技术方案实现。本发明采用的检测仪器是510色谱泵、2475型荧光检测器(Waters公司)、HS2000色谱数据工作站(杭州英谱科技开发有限公司)、Rheodyne7725手动进样器(带20iiL进样环)。0.22iim滤膜及其抽滤器(Millipore公司);Milli-Q纯水器(Millipore公司)；TGLL218台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机厂)；SB2200型超声去气仪(上海必信能有限公司)。本发明的主要试剂有Tyr、Trp、5_羟色胺(5_HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)和肌酐(Cr)均购自Sigma公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国Tedia公司；醋酸锌、冰醋酸等均为国产分析纯，高氯酸为国产优级纯。本发明采用的检测条件是其中色谱柱MegresC18柱(250mmX4.6mmi.d.，5ym，江苏汉邦科技有限公司);流动相10%(v/v)乙腈；流速1.2mL/min;荧光检测波长0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm;5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm;进样量20y1;室温下测定。本发明的检测原理色氨酸和酪氨酸可以产生自然荧光，利用荧光检测器可调波长的性质选择色氨酸和酪酸的最佳检测波长，在最佳色谱条件下使色氨酸和酪氨酸分离，色谱分离后的两种氨基酸经过荧光检测器和色谱数据工作站的检测和处理，作出色谱图，然后根据色谱图完成氨基酸的含量分析和测定。本发明包括以下步骤a、采用MegresC18柱250mmX4.6mmi.d.，5um色谱柱；b、流动相的组成:10%(V/V)乙腈;c、流速为1.2ml/min，进样量20iU，室温下测定;d、利用荧光检测器扫描确定色氨酸和酪氨酸的最大激发光波长和发射光波长，进而使得两种物质均在其最佳波长下得到检测。可调波长设定为0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm;5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm;e、对建立方法进行方法学评价混合标准品和血清样品的检测、标准曲线和检测限、精密度的评价、回收率的考察和干扰试验。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1、本发明首次成功建立了一种HPLC-FD同时测定人血清中Tyr和Trp的方法。Tyr和Trp具有自然荧光，本发明利用荧光检测器自动转换激发光与发射光波长的优势，选择Trp和Tyr的最佳波长，使Trp和Tyr的色谱峰峰面积最大，检测灵敏度增加；与已报道方法比较，本发明分析时间短，试剂消耗少，灵敏度高，特异性好，能满足临床血清样本的检测要求。2、本发明原理简单、操作简便、快速(9min可完成检测)、可行性高。3、本发明灵敏度高、特异性好、能满足血清标本酪氨酸和色氨酸含量测定要求，适合于临床和科研应用。方法学评价显示，在一定范围内，两种物质的标准曲线的线性关系良好(rX).990)，线性范围宽；在该方法下两种物质的检测限低。色氨酸为回收率为88.8%-97.2%，酪氨酸回收率为90.5%-108.8%，色氨酸和酪氨酸的日内和日间精密度均小于5%，苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)、犬尿喹啉酸(Kyna)、5_羟色胺(5-HT)和肌酐(Cr)对测定无干扰。图1为混合标准品的色谱图；峰序号Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸；图2为本发明测定的血清样本的色谱图；峰序号Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸。具体实施例方式以下实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例l，试剂的配制和血清样本的收集处理1.标准溶液的配制准确称取TrplO.Omg、TyrlO.Omg用2.5%(v/v)的高氯酸溶液溶解并稀释至10.OmL，混匀，分别制成4900ymol/LTrp标准储备液和5500ymol/LTyr标准储备液，分装后置于-3(TC冰箱中备用。使用前分别取2种标准储备液加2.5%的高氯酸配成标准工作液(含Trp24.5umol/L，Tyr55umol/L)。2.蛋白质沉淀剂用超纯水配制5%(v/v)的高氯酸溶液作血清蛋白质沉淀剂。3.流动相的配制用超纯水配制10%(v/v)的乙腈溶液，再用0.22m微孔滤膜过滤，使用前超声脱气20min。4.干扰试验用样本溶液用2.5%(v/v)的高氯酸溶液分别配制一定浓度Phe(610ymol/L)、5-HT(114iimol/L)、Kyn(1.96iimol/L)、Kyna(26.17nmol/L)禾PCr(88.14iimol/L)的标准液。5.血清样本的收集处理将受试者空腹静脉血2mL置于洁净促凝管内，3000g离心分离血清，取100y1血清于Eppendorf管内，加入等体积5%(v/v)高氯酸溶液，加盖后于旋涡混匀器上混匀，室温下放置10min以充分沉淀血清中的蛋白质，10000g离心10min(4°C)后将上清液转入另一Enpendorf管内，相同条件下再离心lOmin，取上清液20yL进样分析。实施例2，色谱条件的优化1.检测波长的选择用流动相稀释一定浓度的Tyr和Trp标准溶液，以流动相空白调零，在2475型荧光检测器上，通过对Tyr和Trp的激发光谱和发射光谱扫描，分别得到最大激发光波长入exTyr=228nm、入exTrp=285nm;最大发身寸光波长入emTyr=306nm、入emTrp=353nm。2.流动相中有机物的比例对保留时间的影响配制不同乙腈含量(5%、8%、10%、12%)的流动相，以标准液作为样本进行分析。随着乙腈含量的增加，Tyr和Trp的峰保留时间相应縮短，且Tyr和Trp峰面积响应值也相应的增大；当乙腈含量为5%、8%时，单个样本的分析时间太长；但当乙腈含量为12%时，血清样本Tyr峰与前面的杂峰相融合，影响定量的准确性。综合考虑以上因素，本研究采用乙睛含量为10%的流动相。3.流速对分离效果的影响分别选用流速O.8、1.0、1.2、1.5mL/min进行实验。当流速为1.5mL/min时，Tyr和Trp的保留时间虽縮短，但峰面积响应值相应的减小，色谱系统的后压加大；流速为0.8、1.OmL/min时，分析时间太长，色谱峰变宽。为了使柱效达到最高，使Tyr和Trp两峰达到完全分离，本研究采用流速为1.2mL/min。实施例3，标准品及血清样本的检测1.标准品和血清样本的色谱分离图混合标准品(含Trp24.5iimol/L，Tyr55iimol/L)、混合血清样本去蛋白上清液20iiL进样测定。检测条件是其中色谱柱MegresC18柱(250mmX4.6mmi.d.，5ym);流动相10%(v/v)乙腈；流速1.2mL/min;荧光检测波长0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm;5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm;进样量20y1;室温下测定。图1、图2分别是混合标准品和正常人血清样本的色谱分离图。Tyr和Trp保留时间分别为3.4min、7.6min左右，峰型稳定，基线平稳，无杂质干扰峰，二者分离效果良好，9min内即可完成测定。2.Tyr、Trp定性定量分析Tyr和Trp均采用峰保留值比较法和叠加法进行定性分析，即比对混合标准液和血清样品在相同条件下的色谱峰和相对保留时间；在血清样品中分别加入适量的各种标准物质，比较相同色谱条件下不加标准品及加标准品的色谱图。试验结果表明，在血清样品中加入标准品前后，Tyr和Trp的出峰位置是一致的。用外标法测定峰面积进行定量分析。即在相同色谱条件下测定混合标准品和血清样品，把混合标准品中Tyr和Trp的色谱峰面积和血清样品中Tyr和Trp色谱峰面积进行比较求得血清样品中三种物质的含量。用公式表示为丁xC"2血清Tyr(Trp)浓度=^;注Au=血清中Tyr(Trp)峰面积；As=混合标准液中Tyr(Trp)峰面积；Cs=混合标准液中Tyr(Trp)浓度。3.标准曲线和检测限取Tyr和Trp标准储存液，用2.5%的高氯酸溶液配制一系列浓度的标准混合液，每个样本进样3次，取其平均值用最小二乘法进行相关与回归分析。二者回归分析结果见表l。其中，Y代表峰面积(yVXs)，X代表被分析物的进样浓度(ymol/L)。以流动相为空白，按信噪比为3求出检测限。二者的峰面积与进样浓度线性关系良好，线性范围宽，最低检测限低，灵敏度高。表1Tyr和Trp的回归分析结果及最低检测限项目HI线性范围(|imol/L")謂艮Y=121937X+4619S0.99920.275-275O細T。Y=130731X+45149O养，0.0054.精密度的考察上述的色谱条件下，取混合血清进行日间和日内测定精密度的试验，结果见表2。Tyr和Trp日内(20次)和日间(20d)测定值的标准偏差(RSD)均低于5%，可以满足常规血清样本分析要求。表2Tyr和Trp的日间和日内测定的精密度测娜质日内测定值(jimol/L)日间测定值5S.0S±0.991.7157.91±1.S33.16Tip44.93±1.513.3743.95±2.074.705.回收率的考察取混合血清样品1.6mL平均分为4组，第1组加入0.lmL超纯水作为基础样品，第2、3、4组分别加入高、中、低3种浓度的混合标准液0.lmL;按照上述方法对样品进行处理和分析测定，每组平行测定3次，取其平均值计算回收率。结果见表3。表3Tyr和Trp的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.干扰实验为探讨人体内一些物质是否干扰Tyr、Trp的测定，取Phe、Kyna、Kyn、5_HT、Cr干扰试验用样本溶液，先分别进样分析，再混合制成混合样本进样分析。结果表明以上几种物质均对本法无干扰。表4干扰试验检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注-代表未检测出。权利要求一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a、采用MegresC18柱250mm×4.6mmi.d.，5μm色谱柱；b、流动相10％(v/v)乙腈；c、流速为1.2ml/min，进样量20μl，室温下测定；d、荧光检测波长设定为0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm，5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm。全文摘要本发明涉及一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本方法包括以下步骤采用MegresC18柱250mm×4.6mmi.d.，5μm色谱柱；10％(v/v)乙腈作为色谱流动相；流速为1.2ml/min；荧光检测波长0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm；5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm；进样量20μl；室温下测定。本发明方法简单快速、准确、灵敏度高、可行性高，能满足临床血清样本的检测要求。文档编号G01N21/64GK101750459SQ20101030044公开日2010年6月23日申请日期2010年1月19日优先权日2010年1月19日发明者任亚萍,周前选,唐爱国,项忠元申请人:中南大学湘雅二医院