专利名称：一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法
技术领域：
一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
塑化剂(Plasticizer),是一种增加材料的柔软性或是材料液化的添加剂。其中最常见的塑化剂是邻苯二甲酸酯类物质(Phthalate Esters, PAEs),是邻苯二甲酸的酯化衍生物。邻苯二甲酸酯塑化剂是具些许芳香气味或无气味的无色液体，中等黏度、高稳定性、低挥发性、成本低廉、低水溶解度，但 易溶于多数有机溶剂中。邻苯二甲酸酯类在日常及工业上被广泛使用，以邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)为最大宗，占塑化剂产量的四分之三，其次是邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。邻苯二甲酸酯类塑化剂被归类为疑似环境荷尔蒙，其生物毒性主要属雌激素与抗雄激素活性，会造成内分泌失调，阻害生物体生殖机能，包括生殖率降低、流产、天生缺陷、异常的精子数、睪丸损害，还会引发恶性肿瘤、造成畸形儿。目前我国对邻苯二甲酸酯塑化剂的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC/MS)、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器分析方法是邻苯二甲酸酯塑化剂检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。目前常见的方法是在邻苯二甲酸酯的苯环上引入活性氨基然后与载体蛋白偶联，暴露出邻苯二甲酸酯类的侧链基团为抗原决定簇，此种方法得到的完全抗原通过免疫后，只对特定的邻苯二甲酸酯物质产生较好的抑制效果，交叉反应率较小，得到的抗体无法用于邻苯二甲酸酯类的通用检测。本发明从邻苯二甲酸酯类分子的侧链着手，合成了邻苯二甲酸酯类通用半抗原，暴露出邻苯二甲酸酯类共同的苯环和部分侧链基团，作为抗原决定簇，将半抗原与载体蛋白偶联最后形成人工抗原。

发明内容
本发明的目的:针对现有邻苯二甲酸酯类抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的邻苯二甲酸酯类半抗原以及人工抗原的合成方法，使得制备通用的、能用于多残留检测的邻苯二甲酸酯类单克隆抗体成为可能。本发明提供的邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原化合物，具有式I所示分子结构:
权利要求
1.一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，其特征在于:以邻苯二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，半抗原通过1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原，步骤如下: (1)邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的制备 取0.5 Ig邻苯二甲酸，lmL6-(芴甲氧羰酰基-氨基)_1_己醇，钛酸四丁酯10 μ L，二环己基碳二亚胺DCC10mg，95°C反应12h，加入NaOH水溶液，中和反应液至pH7.4 8，分层后弃水相，有机相再洗涤一次，减压35°C旋蒸脱醇；在产物中加入IOmL含20%哌啶的N, N- 二甲基甲酰胺DMF溶液，室温反应20min，脱去芴甲氧羰酰基保护基团，得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原； (2)邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备 取邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原加入N，N- 二甲基甲酰胺DMF溶解，4°C下加入2.5%戊二醛溶液，半抗原:戊二醛的摩尔比为1:1.5，避光混匀搅拌反应lh，得活化的半抗原溶液； 取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N，N- 二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1 ;在0°C下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，(TC反应lh，室温下反应6h ;用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到邻苯二甲酸酯类塑化 剂通用人工抗原。
2.根据权利要求1所述免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，其特征在于:所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白0VA、人血清白蛋白HSA之一种。
3.根据权利要求1所述免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，其特征在于:邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的分子结构式如式I所示:
4.用权利要求1所述方法合成的邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的应用，其特征在于制备邻苯二甲酸酯塑化剂通用抗体，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。
5.用权利要求1所述方法合成的邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的应用，其特征在于在检测邻苯二甲酸酯类塑化剂中的应用，检测食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂残留。
全文摘要
一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤邻苯二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，再与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达160000，对DBP、DEHP，DINP的半抑制浓度IC50均小于500ng/mL，产生的抗体通用性好，灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂残留，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/02GK103204925SQ201310103419
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者胥传来, 刘丽强, 王利兵, 匡华, 徐利广, 马伟, 胡拥明 申请人:江南大学