专利名称：一种早期诊断膀胱癌的试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种膀胱癌患者尿液中的肿瘤标志物的检测方法，该方法通过定量检测存在于尿液中异常糖基化的整合素AG-α 3β I含量，无创性地实现膀胱癌的早期诊断。
背景技术：
膀胱癌为泌尿系最常见的恶性肿瘤，发病率在美国被列为男性恶性肿瘤的第四位，女性为第八位，居恶性肿瘤的第七位。在我国发病率泌尿系肿瘤第一位。膀胱癌约95%来源于膀胱上皮，绝大多数为恶性，只有少数为良性，包括乳头状瘤、移行细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌。其中以移行细胞癌最常见，占80%以上。目前手术治疗、放疗和化疗的疗效并不令人满意，患者5年存活率在40% -60%。预后较差和极易复发是膀胱癌的最大特点，有效的治疗很大程度上依赖于对膀胱癌的早期发现和早期治疗。然而，膀胱癌发病隐匿，大部分 患者都是因为肉眼或镜下血尿怀疑膀胱癌才会到医院就诊，而出现肉眼血尿往往已是癌症晚期。所以寻找特异的膀胱癌早期诊断方法具有重要的临床应用价值。目前，膀胱癌的早期诊断方法有以下几种I)尿液分析血尿出现后首先便是进行尿液分析，以便排除是否是由于尿路炎症引起，并不能确定患者是否患膀胱癌；2)尿脱落细胞分析对尿沉渣中的尿脱落细胞进行显微镜下观察，可以鉴别并区分恶化的肿瘤细胞和正常细胞。但灵敏度不高，且差异较大，早期膀胱癌容易漏检；3)超声、CT或者MRI成像观察对肿瘤的大小和恶化程度可以直接进行图像观察，准确度较前面方法大大提高。尽管近年来成像技术的不断进步，灵敏度不断提高，但对较小的肿瘤观察仍然不够，易漏检；4)膀胱镜观察膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行可视化的观察，从而发现早期的肿瘤并取活检。但该方法是一种有创性检查，不能用于膀胱癌早期筛查环节。目前早期诊断膀胱癌细胞特异性最高的是通过膀胱镜的观察，荧光膀胱镜的应用提高了检测灵敏度。但患者一般需要经常性的跟踪观察，从而能及早发现肿瘤，或者跟踪治疗中的疗效及复发状况的观察。然而，膀胱镜观察会对患者造成身体不适。另外，目前荧光膀胱镜检测所需荧光染料特异性不高，且对人体有一定的负面影响。因此，在膀胱癌的早期诊断方面，人们一直在探索更特异和更灵敏的检测方法，尽可能的利用特异的肿瘤标志物实现方便、快速的检测。实现尿液中膀胱癌标志物或者细胞的检测，进行实时检测在临床诊断方面具有重要的应用价值。目前商业化的可用的膀胱癌的标志物有人补体因子H相关蛋白(膀胱肿瘤抗原，BTA试剂盒)、高分子量的癌胚抗原和两个膀胱癌细胞相关的粘附分子(美国ScimedxCorp公司的Immunocyt试剂盒)、核基质蛋白22 (ΝΜΡ22)、3、7和17号染色体的异倍体以及Ρ16肿瘤抑制因子9ρ21位点的缺失(UroVysion试剂盒)。BTA是指人补充因子H相关蛋白，BTA检测需要专业操作人员在标准实验室进行。灵敏度达到57-83%，特异性60-92%，血尿患者的特异性只能达到46%，另外良性前列腺增生、肾结石以及尿路感染等情况均影响BTA检测的特异性；Immunocyt试剂盒通过免疫荧光检测尿脱落细胞，尽管灵敏度以及特异性很高，但为了达到较高的准确性需要进行大量的尿脱落细胞检测，因此在膀胱癌患者的治疗以及预后观测方面具有很高的应用价值，但应用在早期诊断方面差强人意；其中NMP22是目前应用最广的膀胱癌标志物，ELISA试剂盒的市场化实现了膀胱癌早期诊断的方便、快捷检测，检测灵敏度和特异性也很高，但是在有病毒感染、肾/膀胱结石等情况下，仍会出现假阳性；Ur0Vysi0n试剂盒采用的是多靶标的荧光原位杂交(FISH)技术，尽管灵敏度与特异性得到极大提高，美国FDA批准，但与Immunocyt试剂盒类似，需要进行大量的尿脱落细胞检测。结合目前的膀胱癌标志物的应用以及膀胱癌的诊断现状，我们得出一方面，新的特异的膀胱癌仍是研究的重点；制备早期诊断试剂盒，实现快速、高通量检测，在膀胱癌的早期筛查及预后方面具有重要的临床价值。 因此，选用高特异性、高灵敏性且无创伤性的检测方法对膀胱癌的早诊、早治有重要意义。

发明内容
根据本发明人之前的研究(参见中国专利申请号201010251384. 6)，发现了一种人膀胱癌肿瘤标志物AG- α 3 β 1，其为异常糖基化的整合素α 3 β 1，其特征在于带有作为抗原表位的糖结构[30S03]Galbl-4(Fucal-3) [60S03]GlcNAc。在上述中国专利申请号201010251384. 6中，公开了所述整合素α3β1的α 3亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示，所述整合素α 3β I的β I亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，优选所述异常糖基化是处在α 3亚单位的第740位的氨基酸T (苏氨酸)上。在中国专利申请号201010251384. 6中，本发明人通过以人膀胱癌细胞系T24(ATCC HTB-4)免疫Balb/C小鼠(商购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，将致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用ELISA方法筛选出针对人膀胱癌肿瘤标志物AG- α 3 β I的一株杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2010年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No. 3845。通过同样的方法，本发明人还获得了单抗BCMab3，其为特异性识别人膀胱癌肿瘤标志物AG_a3i3 I蛋白C端的单克隆抗体，分泌单抗的杂交瘤细胞株于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，100101)，保藏号为CGMCC No. 6907。(一)本发明解决的技术问题本发明着眼于膀胱癌的早期诊断与膀胱癌患者的跟踪观察，拟解决现行的膀胱癌早期诊断方面的难题，即采用特异性识别膀胱癌肿瘤标志物AG-a 3β I的两株单克隆抗体，利用双抗体夹心法实现对AG-a 3β I的识别与捕获，结合高灵敏的化学发光免疫分析方法，提供了一种高灵敏、高特异、操作简便、价格适宜的定量检测AG_a3i3 1的化学发光免疫试剂盒。该试剂盒不需要昂贵的检测仪器，便于临床推广，具有良好的市场应用价值，将会弥补市场现有试剂盒的不足。本发明的目的是提供一种定量检测AG- a 3 β I化学发光免疫分析试剂盒，很好的解决了检测灵敏度和特异性低而影响膀胱癌早期诊断的问题。
本发明的另一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。(二)技术方案1.本发明试剂盒组分本发明定量检测AG-α 3β I化学发光免疫分析试剂盒，其组分包括如下Α.标准品。其是化学发光值很高的膀胱癌患者尿液样本的逐级稀释物。冻存备用。B.捕获抗体BCMab3包被的微孔板。BCMab3为单克隆抗体，能特异地识别尿液中的AG- α 3 β I，将该抗体包被在微孔板上，用于特异性捕获尿液中的AG- α 3 β I。C.用于检测的标记抗体。该抗体为酶标记的针对AG-α 3β I的单克隆抗体 BCMabl，能特异地识别尿液中的AG-a 3β I。此单抗可用碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶偶联形成酶联单抗结合物。用其识别样品中的AG-α 3β 1，释放信号。其释放信号能被转换成为Α6_α3β1的浓度，用于定量分析。D.配置碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液。Ε.1OX浓缩洗涤液。本发明所述试剂盒为了便于用户使用，配制了浓缩洗涤液。使用时，用去离子水稀释10倍至Ix使用。该浓缩洗液为含有2% Tween-20的磷酸盐缓冲洗涤液。F.阴性对照，为正常男性尿液，不含有AG-a 3 β I。G.阳性对照，为膀胱癌患者尿液，含有一定量的AG- a 3 β I。2.本发明试剂盒的制备方法制备上述定量检测AG- a 3 β I化学发光免疫分析试剂盒的方法包括以下步骤I)配制标准品。选取化学发光值很高的膀胱癌患者尿液样本，逐级稀释，冻存备用，用作制备定量分析的标准曲线。本方法中将化学发光值为6685的样本(即本方法选取的Cut off值)中包含AG-a 3β I的量定义为lU/mL。标准品的浓度梯度为0、1、2、4、8、16、32、64、128U/mL，用其标准曲线计算出样本中AG-a 3 β I浓度。2)配制含单克隆抗体BCMab3的包被液，将其包被于96孔微孔板上。包被微孔板的步骤为a)包被采用O. 05M、pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液或O. 046M、pH值为4. 6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的BCMab3抗体混合制成包被液，并将其加载于微孔板上，室温过夜；b)封闭配制复合封闭液=IOOOmL磷酸缓冲液，包含O. 2g NaH2PO4 ·2Η20、2. 9g NaH2PO4 · 12H20、IOg BSA、lg水解明胶和ImL生物防腐剂(例如Proclin300)，调pH值为7. O 7. 6，然后将该封闭液加载于包被好抗体的微孔板上，室温过夜；c)洗板稀释IOX浓缩洗液至原倍(IX)，用原倍洗涤液洗板，干燥、封板后，于4°C封存备用。3)制备辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体BCMabl。采用碳二亚胺(EDC)偶联法，即采用碳二亚胺基团可以与酶分子上的羧基反应，洗去多余的EDC后，再加入抗体，实现抗体上的氨基与酶分子上的羧基结合，形成酶标记抗体。选取合适的酶浓度溶解于新配置的酶稀释液中，冻存备用。4)配制辣根过氧化物酶作用的化学发光底物液，化学发光底物液包含A液和B液，其中，基于IOOOmL所述化学发光底物A液，包括1. 7716g鲁米诺、O. 051g4_羟基联苯、
O.012g 4-碘苯硼酸、11. 4g硼酸、4. 9g硼砂，其pH值为8.0 10.0 ;基于IOOOmL所述化学发光底物 B 液，包括 O. 329g 过氧化脲、Iml Tween20、51. 58gNa2HP04 · 12H20、8. 74gNaH2P04 · 2H20,其 pH 值为 7· O 7· 6。5)配制浓缩洗涤液1000mL IOX浓缩洗液，包含5. 93g NaH2PO4 · 12H20、58gNaH2P04 · 2H20、9g NaClUOmL Tween-20 和 IOmL 生物防腐剂(例如 Proclin300)。6)分装上述各组分，并组装为成品。(三)技术效果本发明采用“双抗体夹心一步法”反应模式，即载体上包被的抗体与酶标记的抗体和被测样品的AG- α 3 β I形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构。另外，本发明有效地利用了化学发光技术原理，实现了检测的高灵敏度。
本发明一方面可以灵敏、快速测定尿液中膀胱癌肿瘤标志物AG-α 3β I的含量，对于膀胱癌患者早期诊断、早期治疗提供可靠的临床参考价值，能够实现无创性地早期筛查膀胱癌的目标；另一方面由于使用特异性提高的单克隆抗体作为包被固相，大大提高了AG-a 3β I检测的线性范围，可以根据AG-a 3β I含量的变化情况判断膀胱癌治疗效果及其病情的变化。本方法可以排除正常、炎症上皮细胞，以及其它血细胞的干扰，特异性的识别膀胱癌肿瘤标志物。本发明具有使用简便、检测快速、灵敏、稳定、可使用范围宽等优点。操作简便适用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用，特别适合广大中、小医院推广使用。


图1.本发明所制备的试剂盒中标准品的线性标准曲线(实施例1制备的试剂盒的标准曲线)。图2.为实施例1制备的试剂盒特异性试验。图3.采用实施例2所述的方法对早期膀胱癌患者及正常人尿液检测的散点图。图4.膀胱癌及正常人样本尿液检测的接收者操作特征曲线(receiveroperatingcharacteristic, ROC)。
具体实施例方式实施例1制备本发明的人尿液膀胱癌肿瘤标志物AG- α 3 β I的化学发光免疫分析试剂盒一、标准品的配制本方法采用辣根过氧化物酶催化鲁米诺和过氧化氢化学发光体系，用化学发光仪检测发光值为6685的样本(即本方法选取的Cut off值)中包含AG- α 3 β I的量定义为lU/mL。该发光值也与浓度为lOOOcell/mL的人膀胱癌细胞系(EJ细胞)的化学发光值相
坐寸ο收集大量的化学发光值很高的膀胱癌患者尿液样本以及正常人尿液样本(正常人尿液中不含AG-α 3 β I)，用正常人尿液样本逐级稀释膀胱癌患者尿液样本，标准品的浓度梯度为0、l、2、4、8、16、32、64、128U/mL，冻存备用，用作制备定量分析的标准曲线，用其标准曲线计算出样本中AG- α 3 β I浓度。二、单克隆抗体BCMabl和BCMab3的制备
已具备两株单克隆抗体杂交瘤细胞株保藏号为CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株分泌BCMabl抗体(中国专利申请号201010251384. 6);保藏号为CGMCCNo. 6907的杂交瘤细胞株分泌BCMab3抗体。对于BCMabl和BCMab3各自的制备，取5X IO7个正处于对数生长期的杂交瘤细胞，以IX IO7的细胞浓度注射于BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物公司)腹腔，10天后收集腹水。通过以下步骤纯化腹水中的单克隆抗体a)收集所得的腹水以2500r/min离心，取上清，以O. OlM pH7. 4PBS对倍稀释腹水上清。b)向上述腹水中加入等体积的饱和硫酸铵，室温搅拌I小时；c)以11000rrmin，4°C离心20分钟，弃上清。重悬于适量O. OlM pH7.4PBS中，并加入1/2体积的饱和硫酸铵，4°C搅拌过夜。 d)上述腹水以11000r/min，4°C离心20分钟，弃上清。将沉淀溶于O. OlM pH7. 4PBS中，再用O. OlM pH7. 4PBS透析，即得抗体粗球。e) Protein-G凝胶柱安装到AKTA蛋白纯化仪(GE Healthcare公司)；f)将抗体粗球11000r/min,4°C离心20分钟,取上清。上清以O. 5mL/min流速通过预先以O. 02M pH7. O含O. 15M的NaCl的PBS平衡过的Protein-G凝胶柱，上样完毕后孵育I小时；g) O. 02M ρΗ7· O 含 O. 15Μ 的 NaCl 的 PBS 洗脱杂蛋白；h) O. 2M pH2. 8甘氨酸缓冲液，并收集洗脱液；i)清洗Protein-G凝胶柱,并将柱子保存在20%的乙醇中；j)洗脱的抗体溶液经超滤浓缩，测抗体浓度，即完成抗体的纯化。三、制备单克隆抗体BCMab3包被的微孔板采用O. 05M pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的单克隆抗体BCMab3混合制成包被液，并将其加载于固相载体上；具体地，所述包被方法为a)包被采用0.05M pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的单克隆抗体BCMab3混合配制成包被液。IOOOmL的碳酸盐缓冲液包含2. 93g的NaHC03、1. 59g的Na2C03、和9g NaCl，与适当浓度的单克隆抗体BCMab3混合制成包被液。具体的碳酸盐缓冲液见下

权利要求
1.一种检测(人尿液中)膀胱癌肿瘤标志物(异常糖基化的整合素AG-α 3β I)的(化学发光)免疫分析试剂盒，其包括 特异性识别膀胱癌肿瘤标志物AG-a 3β I的两种单克隆抗体，优选鼠源单克隆抗体，更优选BCMab3和BCMabI，最优选用作捕获抗体的BCMab3和酶标记的单克隆抗体BCMabl。
2.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒,其包括 1)标准品； 2)捕获抗体BCMab3包被的微孔板； 3)酶标记的单克隆抗体BCMabl； 4)上述酶所作用的化学发光底物； 5)浓缩洗涤液； 6)阴性对照，为不含膀胱癌肿瘤标志物AG-α 3 β I的正常人全尿样本；和 7)阳性对照，为含有膀胱癌肿瘤标志物AG-α 3 β I的膀胱癌患者全尿样本。
3.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述标准品为膀胱癌患者尿液样本的逐级稀释液。
4.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述捕获抗体BCMab3为特异性识别人膀胱癌AG- α 3 β I蛋白C端的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 6907的杂交瘤细胞株分泌，优选其中所述微孔板为适用于化学发光反应的检测的96孔(白色)微孔板。
5.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述单克隆抗体BCMabl为抗人膀胱癌AG- α 3 β I的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株分泌。
6.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述酶为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。
7.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其中所述浓缩洗涤液使用前需用去离子水稀释至原倍浓度后使用。
8.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤 1)配制标准品； 2)将捕获抗体BCMab3包被固相载体，优选微孔板； 3)制备酶标记的单克隆抗体BCMabl； 4)配制酶所作用的化学发光底物液； 5)配制浓缩洗涤液；和 6)分装上述各组分，并组装为试剂盒。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤将纯化后的BCMab3抗体配制成包被缓冲液；将BCMab3抗体包被缓冲液过夜包被微孔板；将封闭液封闭微孔板后，用洗涤液洗涤微孔板；再干燥、封板，于4°C保存。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述封闭液为复合封闭液IOOOmL磷酸缓冲液，其中含 O. 2g NaH2PO4 · 2H20 和 2. 9gNa2HP04 · 12H20，加入 IOg BSAUg 水解明胶和 ImL 生物防腐剂，所述封闭液的PH值为7. O 7. 6，然后将所得封闭液加载于微孔板上。
全文摘要
本发明涉及生物医学免疫分析领域，本发明利用微孔板化学发光免疫分析法，通过检测人尿液中的膀胱癌肿瘤标志物——异常糖基化的整合素AG-α3β1建立一种快速、灵敏、高特异性的早期诊断膀胱癌的检测试剂盒。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、高特异、稳定等优点，可用于常规体检中膀胱癌早期筛查及膀胱癌跟踪观察和预后评价，可满足目前膀胱癌体外诊断方面缺乏特异诊断方法的需要。
文档编号G01N33/577GK103018461SQ20121054081
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者范祖森, 杜颖, 李翀, 张倩云, 王彦英, 杨昭, 周鹏 申请人:中国科学院生物物理研究所