专利名称：一种三维荧光纳米显微成像方法、系统及成像设备的制作方法
技术领域：
本发明属于显微成像领域，尤其涉及一种三维荧光纳米显微成像方法、系统及成 像设备。
背景技术：
纳米分辨荧光成像可以以纳米级的空间分辨率直观地显示被标记分子在被标记 物内的空间分布，并能用来研究被标记分子之间的相互作用过程，可用于生物领域研究细 胞内DNA、RNA与蛋白质分子之间的相互作用和运动规律。目前常用的成像方法是利用荧光 标记物本身的开关效应来进行定位的显微成像技术，通过时分复用、质心定位以及图像复 合来进行纳米分辨成像，例如，光敏定位显微(PALM)、随机光学重建显微(STORM)等等，它 们在每个时刻获取稀疏分布的荧光标记物的定位信息，然后将不同时刻获得的定位信息叠 加，最终实现高横向纳米分辨。结合轴向分辨辅助元件或方法，可进行三维纳米显微成像。然而，上述方法比较适用于较薄样品的三维显微成像，对于厚度达到一二十微米 甚至更厚的样品，由于探测物镜非焦平面荧光背景噪声的影响，其标记分子的定位精度较 低，无法获取高精度的三维图像。目前，这些方法大都以结合全内反射荧光显微(TIRF) 的方式实现，通过TIRF只激发表面的荧光分子，从而有效遏制了非焦平面的荧光信号，但 TIRF也带来一定的局限性，即这种方法只局限于样品表面IOOnm左右范围内的成像，应用 范围受到很大限制。因此，对具有一定厚度的样品进行三维纳米分辨成像时，通常的做法 是增大被标记分子的稀疏程度，单纯依靠轴向分辨以及轴向扫描手段实现三维纳米分辨成 像。但是，不同深度的荧光分子被激发，不仅降低了轴向定位精度，也影响了成像效率，增加 了厚样品观测的难度。

发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种三维荧光纳米显微成像方法，旨在解决厚样品 内分子定位精度低，样品观测难的问题。本发明实施例是这样实现的，一种三维荧光纳米显微成像方法，所述方法包括下 述步骤产生激发光；将所述激发光转换为片状激发光束；将所述片状激发光束作用于样品；探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧光；横向定位，获取荧光标记物的二维位置；轴向定位，获取荧光标记物的轴向位置；三维重构，结合所述的二维位置和轴向位置获取被作用样品层的三维纳米分辨图 像；轴向扫描，获取不同样品层的三维纳米分辨图像；
获得完整样品的三维纳米分辨图像。本发明实施例的另一目的在于提供一种三维荧光纳米显微成像系统，所述系统包 括光源，用于产生激发光；光路调整装置，置于所述光源的输出光路山，用于将所述激发光转换成片状激发 光束，并将所述片状激发光束作用到样品上；微调样品台，置于所述光路调整装置的输出光路上，用于放置并轴向移动样品，所 述样品接受所述片状激发光束的作用后发射荧光；探测光路装置，置于所述样品发射的荧光的光路上，用于接收并传导荧光；探测装置，置于所述探测光路装置的输出光路上，用于探测荧光。本发明实施例的另一目的在于提供一种包含上述三维荧光纳米显微成像系统的 成像设备。本发明实施例用片状激发光束作用于样品的一薄层，使处于探测层轴向中心位置 的荧光标记物处于稀疏激发状态，远离探测层轴向中心位置的荧光标记物免于被激发，实 现了厚样品的轴向选择性激发，避免了不同层中处于荧光态的荧光标记物的相互串扰，并 降低了非探测层荧光标记物发出的荧光带来的离焦背景噪声，进而提高了荧光标记物的横 向及轴向定位精度；通过轴向扫描获得不同深度样品层的三维纳米分辨图像，最终实现厚 样品的高精度三维荧光纳米显微成像，使得厚样品的观测更加容易。


图1是本发明第一实施例提供的三维荧光纳米显微成像方法的实现流程图；图2是本发明第六实施例提供的双焦平面差动探测方法的实现流程图；图3是本发明第十实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统的原理图；图4是本发明第十一实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统的结构图；图5是本发明第十二实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统的结构图；图6是本发明第十三实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统的结构图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。本发明实施例用片状激发光束作用于样品，实现了厚样品的轴向选择性激发，提 高了荧光标记物的横向及轴向定位精度，结合轴向扫描实现了完整样品的三维纳米显微成 像，使厚样品的观测更加容易。 本发明实施例提供了 一种三维荧光纳米显微成像方法，所述方法包括下述步骤产生激发光；将所述激发光转换为片状激发光束；将所述片状激发光束作用于样品；探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧光；
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横向定位，获取荧光标记物的二维位置；轴向定位，获取荧光标记物的轴向位置；三维重构，获取被作用样品层的三维纳米分辨图像；轴向扫描，获取不同样品层的三维纳米分辨图像；获得完整样品的三维纳米分辨图像。本发明实施例还提供了一种三维荧光纳米显微成像系统，所述系统包括光源，用于产生激发光；光路调整装置，置于所述光源的输出光路山，用于将所述激发光转换成片状激发 光束，并将所述片状激发光束作用到样品上；微调样品台，置于所述光路调整装置的输出光路上，用于放置并轴向移动样品，所 述样品接受所述片状激发光束的作用后发射荧光；探测光路装置，置于所述样品发射的荧光的光路上，用于接收并传导荧光；探测装置，置于所述探测光路装置的输出光路上，用于探测荧光。本发明实施例还提供了 一种包含三维荧光纳米显微成像系统的成像设备。本发明实施例以片状光束作为激发光作用于样品的一薄层，使处于探测层轴向中 心位置的荧光标记物处于稀疏激发状态，远离探测层轴向中心位置的荧光标记物免于被激 发，实现了厚样品的轴向选择性激发，避免了不同层中处于荧光态的荧光标记物的相互串 扰，并降低了非探测层荧光标记物发出的荧光带来的离焦背景噪声，进而提高了荧光标记 物的横向及轴向定位精度；通过轴向扫描获得不同深度样品层的三维纳米分辨图像，最终 实现厚样品的高精度三维荧光纳米显微成像，使得厚样品的观测更加容易。以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述实施例一图1示出了本发明第一实施例提供的三维荧光纳米显微成像方法的实现流程，详 述如下在步骤SlOl中，产生激发光；在步骤S102中，将激发光转换为片状激发光束；在步骤S103中，将片状激发光束作用于样品；在步骤S104中，探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧光；在步骤S105中，横向定位，获取荧光标记物的二维位置；在步骤S106中，轴向定位，获取荧光标记物的轴向位置；在步骤S107中，三维重构，结合所述的二维位置和轴向位置获取被作用样品层的 三维纳米分辨图像；在步骤S108中，轴向扫描，获取不同样品层的三维纳米分辨图像；在步骤S109中，获得完整样品的三维纳米分辨图像。实施例二 在本发明实施例中，激发光应当能够使荧光标记物实现稀疏激发，其波长在荧光 标记物的激发谱中激发较强的谱段选取。激发光的光源可选择单色性较好的激光光源。实施例三在本发明实施例中，片状激发光束可以通过下述方法获取由光源产生的激发光经过准直扩束后，通过片状光束获取元件形成片状光束；然后经扩展焦深元件扩大所述片 状光束的焦深，大焦深的片状光束通过照明物镜，其厚度被大幅度减小，使得该光束在焦深 范围内近似为超薄片状的平行光束。作为本发明的一个实施例，片状激发光束的焦深的数量级高于被作用样品层在激 发光路方向上的径向长度的数量级，片状激发光束的厚度低于1微米。实施例四在本发明实施例中，光源发出的激发光在进行准直扩束之前，可先经过反射镜与 扫描反射镜反射，以便调整激发光路与探测光路垂直。实施例五在本发明实施例中，可通过下述步骤探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧 光通过探测物镜接收样品发出的荧光，并将荧光以平行光束输出；对平行光束进行滤波 以滤除激发光；然后，改变荧光的光程差，该光程差具体指荧光在与其传导方向相垂直的二 维方向(XY轴向)上的光程差；最后，荧光经成像装置成像在探测装置上。根据探测装置探测到的荧光强度信号对荧光标记物进行横向及轴向定位，确定荧 光标记物的横向和轴向位置。在本发明实施例中，当被作用荧光标记物处于探测物镜焦平面时，其发出的荧光 成像在探测装置上的光斑与普通显微镜一样，是一个圆形；当被作用荧光标记物不在焦平 面时，其发出的荧光成像在探测装置上的点扩散光斑会呈现椭圆形状，其椭圆长轴的指向 和长度决定了荧光标记物的Z轴离焦量的大小与正负，其中，正负代表荧光标记物在探测 物镜焦平面的上方或下方，大小代表荧光标记物离探测物镜焦平面的距离，从而可以确定 荧光标记物在Z轴的位置。实施例六在本发明实施例中，可通过双焦平面差动探测方法获得荧光标记物的轴向位置， 以进一步提高轴向定位精度。图2示出了本发明第六实施例提供的双焦平面差动探测方法的实现流程图，详述 如下通过下述步骤探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧光在步骤S201中，接收样品发出的荧光，并将其转换为平行光束输出；在步骤S202中，对平行光束进行滤波；在步骤S203中，将平行光束分为两路，即第一荧光光束和第二荧光光束；在步骤S204中，第一荧光光束通过第一成像透镜成像在第一探测装置上，第二荧 光光束通过第二成像透镜成像在第二探测装置上；其中，第一探测装置位于第一成像透镜像焦平面的前方第一距离处，第二探测装 置位于第二成像透镜像焦平面的后方第二距离处；第一距离和第二距离相等，第一成像透 镜和第二成像透镜的焦距相等。通过下述步骤对荧光标记物进行轴向定位，获取其轴向位置在步骤S205中，将第一探测装置和第二探测装置探测到的荧光强度信号差动相 减，根据相减后得到的探测信号确定荧光标记物的轴向位置。双焦平面差动探测方法的原理如下所述当物面与系统探测物镜的焦平面重合时，由于两个探测装置分别位于相应成像透镜的像焦平面前后相等距离处，因此，两个探测 装置上的单分子弥散光斑大小相等，光强相等，输出的信号之差为零。当物面偏离探测物镜 的焦平面一点位移时，两探测装置上的单分子光斑大小不再相等，输出的荧光信号也不同。 根据两探测装置上每个单分子横向质心位置处的荧光强度信号差值的大小与正负，便可判 断单分子轴向离焦量的大小与正负。因此，可使轴向“焦前”、“焦后”偏移放置的两个探测 装置探测到的单分子荧光强度信号差动相减，根据差动相减后得到的探测信号来定位分子 的轴向位置，改善轴向定位精度。其中，探测装置与相应成像透镜像焦平面之间的距离主要 由探测物镜的数值孔径和横向放大倍率决定。在本发明实施例中，双焦平面差动探测方法可实现10-20nm的轴向定位精度，比 传统的轴向定位方法提高了 20% -35%。实施例七在本发明实施例中，可通过二维质心定位方法进行横向定位，获得荧光标记物的 二维位置。实施例八在本发明实施例中，轴向扫描的移动步长与作用在样品上的片状激发光束的厚度 相等，确保轴向扫描结束后，所有轴向上的荧光标记物均受到一致的激活次数。实施例九在本发明实施例中，荧光标记物为具有开关效应的荧光蛋白分子、荧光染料分子 或荧光量子点。实施例十图3示出了本发明第十实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统的成像原理，详 述如下光源1产生激发光；光路调整装置2接收激发光并将其转换为片状激发光束；微 调样品台3位于光路调整装置2的输出光路上，使片状激发光束作用在样品上，样品内的荧 光标记物接受片状激发光束的作用后发射荧光；探测光路装置4接收荧光，并将其传导至 探测装置5，根据探测装置5探测的荧光强度信号确定被作用样品层内荧光标记物的横向 及轴向位置，进而获得被作用样品层的三维纳米分辨图像。微调样品台3可轴向移动样品， 通过获取不同样品层的三维纳米分辨图像，可实现完整样品的三维纳米显微成像。实施例H图4示出了本发明第十一实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统，为了便于说 明，仅示出了与本发明实施例相关的部分。该系统用于完整厚样品的 精度三维显微成像。其中光路调整装置2包括准直 扩束元件23，在准直扩束元件23的输出光路上依次设置片状光束获取元件24、扩展焦深元 件25及照明物镜26。微调样品台3包括轴向平移台31和样品池32。探测光路装置4包括探测物镜41 ；滤光片42，置于探测物镜41的输出光路上； 柱面透镜43，置于滤光片42的输出光路上；成像透镜44，置于柱面透镜43的输出光路上。探测装置5包括探测器51，置于成像透镜44的像焦平面处。其中，光源1产生的激发光通过准直扩束元件23变为准直宽光束，准直宽光束经过片状光束获取元件24形成片状光束；扩展焦深元件25扩大片状光束的焦深，使焦深的数 量级高于被作用样品层在激发光路方向上的径向长度的数量级；大焦深的片状光束经照明 物镜26后形成超薄片状光束，并作用到样品池32内的样品上，作用在样品上的片状激发光 束的厚度低于1微米。样品内分布的荧光标记物受到超薄片状光束的作用后发射荧光，探测物镜41收 集荧光，并将其转换为平行光束输出，平行荧光光束通过滤光片42后滤除激发光，然后，经 过柱面透镜43改变其光程差，该光程差具体指荧光在与其传导方向相垂直的二维方向(XY 轴向)上的光程差；再通过成像透镜44成像在探测器51上。根据探测器51探测的荧光强 度信号即可确定被作用样品层内荧光标记物的横向及轴向位置，获得该样品层的三维纳米 分辨图像。轴向平移台31可轴向移动样品，使片状激发光束作用在不同的样品薄层上，其 轴向移动步长与作用在样品上的光束厚度相等，实现完整样品的轴向扫描，进而实现完整 样品的三维荧光纳米显微成像。实施例十二 图5示出了本发明第十二实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统，下面仅对与 本发明实施例相关的部分作详细说明。在本发明实施例中，所述光路调整装置2还可进一步包括反射镜21和扫描反射镜 22，依次置于光源1和准直扩束元件23之间，且扫描反射镜22置于照明物镜26后焦面的 共轭面上，便于调整激发光路与探测光路垂直。实施例十三在本发明实施例中，对探测光路装置4和探测装置5作进一步改进，即将荧光光束 分为两路分别探测，可使该系统的轴向定位精度更高。图6示出了本发明第十三实施例提供的三维荧光纳米显微成像系统，下面仅对与 本发明实施例相关的部分作详细说明。其中，探测光路装置4包括探测物镜41，用于接收荧光，并将其调整为平行光束 输出；滤光片42，置于探测物镜41的输出光路上；分束镜45，置于滤光片42的输出光路上， 用于将荧光分为两路，即反射荧光和透射荧光；第一成像透镜46，置于透射荧光的光路上； 第二成像透镜47，置于反射荧光的光路上；第一成像透镜46与第二成像透镜47的焦距相 等；探测装置5包括第一探测器52，置于第一成像透镜46的像焦平面之前第一距离 处；第二探测器53，置于第二成像透镜47的像焦平面之后第二距离处；第一距离与第二距 离相等。所述距离主要由探测物镜41的数值孔径和横向放大倍率决定。在本发明实施例中，探测物镜41收集荧光，并以平行光束输出，平行荧光光束经 滤光片42滤除激发光，然后被分束镜45分为透射荧光和反射荧光，透射荧光经第一成像透 镜46成像在第一探测器52上；反射荧光经第二成像透镜47成像在第二探测器53上，为标 记物的横向及轴向定位提供源图像。本发明实施例提供的成像系统可使标记分子的轴向定位精度得到进一步提高。实施例十四在本发明实施例中，片状光束获取元件24可选用柱面透镜。
实施例十五在本发明实施例中，扩展焦深元件25可选用圆锥透镜、轴锥透镜、相位型光瞳滤 波器或空间光调制器。实施例十六在本发明实施例中，轴向平移台31可选用具有轴向精密移动功能的压电陶瓷样 品台。实施例十七在本发明实施例中，照明物镜26可选用复消色差物镜。实施例十八在本发明实施例中，探测器51、第一探测器52和第二探测器53可选用电子倍增探 测器。本发明实施例用片状激发光束作用于样品的一薄层，实现了厚样品的轴向选择性 激发，提高了荧光标记物的横向及轴向定位精度；并且，采用双焦平面差动探测方法进行轴 向定位，进一步提高了轴向定位精度；避免了处于非探测层的荧光标记物的无效激发以及 可能的光漂白，降低了单次成像中无效成像的荧光标记物数量，提高了成像效率；通过轴向 扫描获得不同深度样品层的三维纳米分辨图像，最终实现厚样品的高精度三维纳米显微成 像，使得厚样品的观测更加容易。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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权利要求
一种三维荧光纳米显微成像方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤产生激发光；将所述激发光转换为片状激发光束；将所述片状激发光束作用于样品；探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧光；横向定位，获取荧光标记物的二维位置；轴向定位，获取荧光标记物的轴向位置；三维重构，结合所述的二维位置和轴向位置获取被作用样品层的三维纳米分辨图像；轴向扫描，获取不同样品层的三维纳米分辨图像；获得完整样品的三维纳米分辨图像。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述激发光转换为片状激发光束的 具体步骤为对所述激发光进行准直扩束； 将所述准直扩束后的激发光转换成片状光束； 扩展所述片状光束的焦深； 进一步减小所述片状光束的厚度。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片状激发光束的焦深的数量级高于被 作用样品层在激发光路方向上的径向长度的数量级；所述片状激发光束的厚度低于1微 米。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探测被作用样品层内荧光标记物发射 的荧光的具体步骤为接收所述样品发射的荧光，并将其转换为平行荧光光束；对所述平行荧光光束进行滤波；改变所述经过滤波后的荧光的光程差；将所述经过改变光程差的荧光成像在探测装置上；所述轴向定位，获得荧光标记物的轴向位置的具体步骤为根据所述探测装置探测到的荧光强度信号确定荧光标记物的轴向位置。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探测被作用样品层内荧光标记物发射 的荧光的具体步骤为接收所述样品发射的荧光，并将其转换为平行荧光光束； 对所述平行荧光光束进行滤波；将经过滤波后的平行荧光光束分为第一荧光光束和第二荧光光束； 将第一荧光光束通过第一成像透镜成像在第一探测装置上，将第二荧光光束通过第二 成像透镜成像在第二探测装置上；所述第一探测装置位于第一成像透镜像焦平面的前方第一距离处，所述第二探测装置 位于第二成像透镜像焦平面的后方第二距离处；所述第一距离和第二距离相等，所述第一 成像透镜和第二成像透镜的焦距相等；所述轴向定位，获得荧光标记物的轴向位置的具体步骤为将所述第一探测装置和第二探测装置探测到的荧光强度信号差动相减，根据相减后得到的探测信号确定荧光标记物的轴向位置。
6.一种三维荧光纳米显微成像系统，其特征在于，所述系统包括 光源，用于产生激发光；光路调整装置，置于所述光源的输出光路山，用于将所述激发光转换成片状激发光束， 并将所述片状激发光束作用到样品上；微调样品台，置于所述光路调整装置的输出光路上，用于放置并轴向移动样品，所述样 品接受所述片状激发光束的作用后发射荧光；探测光路装置，置于所述样品发射的荧光的光路上，用于接收并传导荧光； 探测装置，置于所述探测光路装置的输出光路上，用于探测荧光。
7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述光路调整装置包括准直扩束元件，置于所述光源的输出光路上，用于将所述光源发出的激发光准直扩束 后输出；片状光束获取元件，置于所述准直扩束元件的输出光路上，用于将所述激发光转换为 片状光束；扩展焦深元件，置于所述片状光束获取元件的输出光路上，用于扩大所述片状光束的 焦深；照明物镜，置于所述扩展焦深元件的输出光路上，用于减小所述片状光束的厚度，并将 其作用到所述样品上。
8.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述探测光路装置包括 探测物镜，用于接收所述样品发射的荧光，并将荧光以平行光束输出； 滤光片，置于所述探测物镜的输出光路上；柱面透镜，置于所述滤光片的输出光路上；成像透镜，置于所述柱面透镜的输出光路上；所述探测装置包括探测器，置于所述成像透镜的像焦平面处。
9.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述探测光路装置包括 探测物镜，用于接收所述样品发射的荧光，并将荧光以平行光束输出； 滤光片，置于所述探测物镜的输出光路上；分束镜，置于所述滤光片的输出光路上，用于将荧光分为反射荧光与透射荧光； 第一成像透镜，置于透射荧光的光路上； 第二成像透镜，置于反射荧光的光路上； 所述第一成像透镜与第二成像透镜的焦距相等； 所述探测装置包括第一探测器，置于所述第一成像透镜像焦平面的前方第一距离处； 第二探测器，置于所述第二成像透镜像焦平面的后方第二距离处； 所述第一距离与第二距离相等。
10.一种包含权利要求6至9任一权利要求的三维荧光纳米显微成像系统的成像设备。
全文摘要
本发明适用于显微成像领域，提供了一种三维荧光纳米显微成像方法、系统及成像设备，所述方法包括下述步骤产生激发光；将所述激发光转换为片状激发光束；将所述片状激发光束作用于样品；探测被作用样品层内荧光标记物发射的荧光；横向定位，获取荧光标记物的二维位置；轴向定位，获取荧光标记物的轴向位置；三维重构，结合所述的二维位置和轴向位置获取被作用样品层的三维纳米分辨图像；轴向扫描，获取不同样品层的三维纳米分辨图像；获得完整样品的三维纳米分辨图像。本发明以片状光束作为激发光，结合轴向扫描，实现了高精度的三维纳米显微成像，适用于生物领域细胞等厚样品的三维显微成像，解决了厚样品内分子定位精度低，样品观测难的问题。
文档编号G01N21/64GK101963582SQ20101027973
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者于斌, 屈军乐, 牛憨笨, 陈丹妮 申请人:深圳大学