专利名称：一种用于研究药效物质基础的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于药物血清移行成分动效关系分析药物药效物质基础的新技术。
背景技术：
血清药物化学是近年来发展起来的新学科，其基本理论认为药物化学成分虽然多种多样，但作为口服药物应用时，只有那些能被吸收入血的成分才可能是活性成分。但有些药物成分极其复杂，经过动态血清药物化学图谱分析后，很可能会出现大量的成分谱，在大量的成分谱中逐一寻找药物药效物质基础犹如“大海捞针”。选择简便、可靠的方式对血清中药效成分进行确定，是本研究的核心问题。研究者认为药物化学成分与中药药效之间存在关联性，且不同的药效强度实质上是由血清中药效成分的含量所决定的，可以利用相关分析和回归分析将药效作用强度的动态变化与成分谱的峰面积(含量)的动态变化联系起来，通过统计分析来确定众多药物成分中真正的药效成分谱峰。经查阅，有5项专利和2篇文论涉及到药物药效物质筛选的研究，分别为1. 一种对中成药处方二次开发优化筛选的方法CN1374524该专利报道了一种对中成药处方二次开发优化筛选的方法。建立了将传统方剂改制成现代中药研究模式和技术平台，处方组分配伍、配比的筛选采用两极等比增减设计。原处方中甲、乙两种药物(君药、臣药)在总量恒定的前提下以药典记载的配比为基线，甲、乙两种药物各种配比分组采用整体动物为主，结合离体器官、细胞实验与血清药物化学分析， 以其主要效应和次要效应作为其优选的评价指标。在名特优处方二次开发中，从同一配伍的不同配比中优选最佳，此方法适用于药效物质基础相对明确，药味相对较少，作用靶点清楚的小复方。突破了千百年来凭经验组方的局限，为现代中药组方提供了科学依据，经过实验和临床研究均取得成功。该筛选方法的局限是仅仅能对小处方进行处方优化，而中药汤剂多以复方(5-25 味)中药组成，按照上述方法操作寻找处方优化条件存在一定的难度，且未能够彻底明确药效物质基础，不利于中药现代化。2.组分中药的研究方法和技术路线CN101190M0该专利提供了一个组分中药的研究方法和技术路线，可制造出组分中药、建立中药药效组分质量标准体系，其特征在于由7个主要研究步骤组成传统标准中药一药效组分的分析测定一初步组分中药一按照中药功能主治设计的组合药理学辅助实验一人体或大动物体内药效组分代谢实验一药效组分质量标准建立一组分中药。组分中药是由中药药效组分组成，药效组分包括3个层次①配伍组分符合临床治疗要求的饮片；②药效物质类别组分化合物类别，信息物质；③药效物质单体组分化学单体；蛋白质，核酸，多糖。中药药效组分质量标准体系研究的方法及内容包括有效性指标、安全性指标和稳定性指标。3. 一种中药复方药效物质基础的虚拟筛选方法CN101089M5本发明公开了一种中药复方药效物质的虚拟筛选方法首先挑选一个化学成分基本清楚的中药复方作为研究对象，对复方中的每味中药的化学成分分子进行收集和整理， 建立一个复方化学成分分子库。以该复方主要治疗功效中疗效确切、机制清楚、靶点明确的药理作用为目标，寻找或建立其对应的分子靶点。分别在所建分子药理模型下对分子库中的分子进行毒性筛选、类药性评估、分子对接评测，三个步骤次序不分先后，并依据具体情况略作增减。最后对分子库中的每个分子进行综合评价，筛选打分最高的诸个分子，经药理实验药效验证和筛选得到该复方药理作用P(i)的分子预方。预方通过剂量配比设计产生该复方药理作用p(i)的分子新复方。本发明建立的筛选方法高效快捷、经济新颖，为中药复方现代化、中药复方创新提供了一条可行性思路。文献2，3所报道的方法中均需要建立中药复方分子库，该项工作耗时耗力，成本较高，不利于经济快速准确的筛选真正的药效成分，此外，上述两个文献所报道的方法忽略了药物成分代谢及炮制过程中所发生的化学变化，难以明确真正的药效成分。且文献3采用虚拟计算方法存在一定的不确定性。4. 一种研究中药复方药效物质的新方法CN1762389本发明提供了一种研究中药复方药效物质的新方法，它是利用现代科技手段研究中药复方中的化学物质，然后将该复方应用中医外治法治疗相关疾病，再用相同现代科技手段研究用药后该复方中的化学物质，并将两次用现代科技手段测得的化学物质进行对比分析，以找到治疗相关疾病的中药复方药效物质。上述方案的缺点在于进能够应用于外敷中药复方的药效物质研究，此外，药物成分中被皮肤吸收的部分未必是真正的药效成分，可能仅仅因为分子量易于被机体吸收而减少，所以该种评价方法存在着一定的不确定性。5.中药药效物质机理的生物信息分析平台及其分析方法CN101441682本发明提供了一种中药药效物质机理的生物信息分析平台及其分析方法，包括中药活性成分及含量数据库模块，INVD0CK软件包模块和网络数据库模块，网络数据库模块包括人类蛋白相互作用数据库、代谢数据库、和信号转导数据库、治疗性药靶数据库、药物副作用靶点数据库和药物吸收分布代谢排出数据库，还提供了一种采用该生物信息分析平台分析中药药效物质机理的方法，该生物信息分析平台能全面分析中药药效物质的药理机制，具有准确、高效的特点，为中药药理研究提供指导，可以大大加快中药药理研究，加速开发新型中药。文献5仅仅能够对已知的中药化学成分进行对比推测，而对未见报道的药物成分无法进行分析。对潜在靶点作用效果不明确的药物无法进行准确的计算。建立数据库所参考的相关研究材料可能存在缺乏准确性、真实性、全面性的问题。

发明内容
本发明提供了一种快速、准确筛选药物药效物质基础的方法，对新药研究、精减处方、明确药理药效具有非常重要的意义。本发明一种用于研究药效物质基础的方法，其特征在于，包括如下步骤S1、选择η名药物试验对象，空腹口服药物。其中，试验对象的数量根据需要选择可以是6-10名，也可以是上百或数千数万名。S2、服药后，以时间间隔方式分别采集试验对象的血液样本；其中，间隔的时间长度根据具体检测的药物决定，一种优选方式下，试验对象服药后，可以在0、2、5、10、15、20、 30、60、90、120、150、180、210、240、360分钟的时间点，采集各个试验对象的血液样本。S3、检测某一时间点某一试验对象的血液样本，获得该时间点药物进入该实验对象血液的成分含量。S4、检测某一时间点某一试验对象的血液样本，获得该时间点该实验对象血液中各种蛋白成份的含量。S5、根据步骤S3和步骤S4获得的多组数据，分别建立血液样本蛋白数据集、血液样本药物数据集，以某种统计推断的算法，进行两个数据集的关联性的预测(相关性)。当计算结果显示药物进入血液后药物成分与蛋白成份的相关系数，具备统计学意义时则，确认该种药物成分为有效药成份。这种相关系数的确认可以根据统计学的基本原理，利用 SPSS统计软件的Pearson多元相关分析确定；而且在统计学上，这种相关系数的计算方式较多，根据需要选择计算方式即可。此外，在步骤S3中，需排除血清干扰成分，具体步骤为S31、在服药之前，Sl中的各个试验对象需空腹口服等药量的淀粉，而后根据S2中的时间间隔方式在各个时间点采集血液样本，采用HPLC色谱技术进行检测获得空白血清的色谱峰。S32、在服药之后，采集血液样本，并采用HPLC色谱技术对含药血清进行检测，以步骤S31中空白血清色谱峰为参照，从含药血清中删除与之相重叠的峰，剩余的色谱峰即是药物入血的药物成分峰。优选方式下，本发明用于研究药效物质基础的方法，在步骤Sl中，试验对象需排除长期服药、有免疫性疾病或其他急、慢性疾病的对象；而且试验对象最好空腹8-16小时后口服药物，给药剂量为0. 06-1. 5g/kg。本发明结合血清药物化学、药物代谢动力学、药效学、统计学的研究思路和研究方法分析药物的药效物质基础，即利用血清药物化学、药代动力学方法建立药物血中移行成分代谢的动态图谱，以药效学指标为“活性向导”，通过统计学方法建立血清药物成分代谢动态图谱与药效动态变化相联系的数学模型，并从血清药物成分代谢图谱的动态特征考虑 “谱效关系”，利用药效对图谱进行“解码”；最终确定药物的药效物质基础。本发明方法能够速、准确筛选药物药效物质，对新药研究、精减处方、明确药理药效具有非常重要的意义。本专利技术的有益效果在于1.本技术对传统的药效成分筛选方法进行优化，以计算机辅助技术筛选真正药效成分，该技术可提高有效组分筛选效率，缩短筛选周期。2.本技术采用绘制与药效相关的定量指纹图谱，将中药指纹谱图中化学成分的变化与中药药效结果联系起来，从而明确药效与成分之间的关系，确定出与药效相关的化学成分群，这种“谱-效”结合技术突破了传统药物研究模式，具有很强的创新性。3.本技术是将血清药物化学、药效学、毒理学、药物代谢动力学、统计学相结合，以药效学指标为“活性向导”，依据相关、回归、聚类、主成分分析结果，确定核心的药效成分， 该技术具有筛选结果准确、研究时间相对较短的优点。4.本技术采用建立药物血清化学成分代谢的动态图谱，为全面反映药物在体内的移行成分提供依据，同时可以为剔除无效成分和毒性成分提供确切的依据。


图1利用本发明方法在筛选药物治疗疾病的药效物质研究的流程示意图；图2在狼疮颗粒治疗SLE的药效物质研究实施例中各个药物血清移行成分谱示意图；图3在狼疮颗粒治疗SLE的药效物质研究实施例中活性向导IL-6、IL_10、C3、 ds-DNA的动态变化谱示意图。
具体实施例方式结合图1说明本发明的主要思路及技术路线如下一、确定药物治疗疾病的药效物质基础第一步建立药物“动态血清药物成分指纹图谱”实验仪器留置针、低温离心机、分析型高效液相仪实验原理中药化学成分虽然复杂，但经口服给药时只有那些能够进入血的成分才可能是作用成分，故将进入血液的药物成分为研究对象。为了避免药效成分的遗漏，对入血的药物成分进行全程的动态检测，利用高效液相色谱仪对所有入血清的药物成分进行定性、定量检测，掌握每个入血药物成分含量的动态变化，从而建立药物“动态血清药物成分指纹图谱”。实验制剂药物、肝素钠、DMS0、乙醇丙酮等分析试剂。实验步骤被试的选择及给药后血清样本的采集及处理治疗组选择6-10名被试，排除长期服药、有免疫性疾病或其他急、慢性疾病的被试，所有被试在实验前签订知情同意书。含药血清样本的制备为防止食物、饮品对实验结果的干扰，所有被试在实验前要求空腹8小时以上。晨起空腹口服给予药物，给药剂量为0. 06g-1.00/kg。给药前lOmin，于被试左前臂静脉内插入留置针，给药后0、2、5、10、15、20、30、60、90、120、150、180、210、240、 360min各时间点从留置针中分别采集血液样本30mL，离心分离血清成分。空白血清样本的制备被试口服装有淀粉的胶囊，血液采集时间及处理方式同上。血清干扰成分的排除采用HPLC色谱技术对空白血清及含药血清进行检测，以空白血清色谱峰为参照，从含药血清中删除与之相重叠的峰，剩余的色谱峰即是药物药入血的物成分峰。血清中药物成分含量的测定通过HPLC技术检测各个入血药物成分在每个观察时间点含量的动态变化(以出峰时间区分不同的化学成分，峰面积计算每个化学成分的含
量° )建立药物所有入血成分含量变化的“动态指纹图谱”。实验二确定药物发挥作用的“靶蛋白，，实验仪器低温离心机、酶标仪、分光光度计、PCR仪。实验原理血清药物成分在体内发挥活性时均需要作用于某些靶蛋白，且这些靶蛋白含量的动态变化实质上是由血清中药效成分的动态变化所决定的。可以通过“成分/
6靶点”间的关联性确定药效作用物质基础及其作用靶点。实验制剂R&D Systems高通量蛋白芯片试剂盒。实验步骤药物发挥作用的“靶蛋白谱”确定用R&D Systems高通量蛋白芯片试剂盒检测血清样本。该试剂盒包含了已知人源性蛋白芯片，可同时对血清中768个蛋白指标进行定量检测。试剂盒的每个微孔都预先点有一系列捕获抗体构成的抗体芯片列。向微孔内加入血清样本后，样本中的目标蛋白与固定于微孔板上的捕获抗体结合。才用生物素标记的混合检测抗体与HRP偶联的亲和素(夹心法)检测被捕获的蛋白。通过对比患者给药前后血清中蛋白质表达水平的变化，即可确定哪些蛋白受到了药物影响。依据现有研究报道，选择其中蛋白功能确定的蛋白为“靶蛋白”，检测其在给药后血清中含量的动态变化。实验三药物药效物质基础的确定将药物所有入血成分含量变化的“动态指纹图谱”与同步获得的“动态靶蛋白谱” 整合。以药物血清药物化学成分含量为“自变量”，以靶蛋白为“因变量”，采用SPSS统计软件的Pearson多元相关分析确定药物治疗SLE的药效物质基础。在确定了药效物质基础后， 采用制备色谱技术分离这些目标药效成分。下面结合狼疮颗粒治疗SLE的药效物质研究的实施例，说明本发明的方法。1.建立狼疮颗粒血清药物化学成分代谢的动态图谱(1)成人口服给药量为1. 5g/kg。(2)含狼疮颗粒血清标本制备药及高效液相色谱分析条件的选择被试空腹8小时后，口服狼疮颗粒，给药后0、2、5、10、15、20、30、60、90、120、180、 240,480分钟提取被试血样，分离血清。(3)狼疮颗粒血清药物化学成分代谢动态图谱建立用高效液相色谱仪分析狼疮颗粒血清移行成分谱，以出峰时间(位置)区分不同的化学成分，峰面积计算每个化学成分的含量。以时间为横坐标，以各个药物成分的含量为纵坐标，建立药物血清药物化学成分(每个峰)的代谢动态图谱，如表1和图2所示。表1狼疮颗粒血清移行成分谱相对峰面积
权利要求
1.一种用于研究药效物质基础的方法，其特征在于，包括如下步骤51、选择η名药物试验对象，空腹口服药物；52、服药后，以时间间隔方式分别采集试验对象的血液样本；53、检测某一时间点某一试验对象的血液样本，获得该时间点药物进入该实验对象血液的成分含量；54、检测某一时间点某一试验对象的血液样本，获得该时间点该实验对象血液中各种蛋白成份的含量；55、根据步骤S3和步骤S4获得的多组数据，分别建立血液样本蛋白数据集、血液样本药物数据集，以统计推断的算法，进行两个数据集的关联性的预测，当计算结果显示药物进入血液后药物成分与蛋白成份的相关系数具备统计学意义时，则确认该种药物成分为有效药成份。
2.根据权利要求1所述用于研究药效物质基础的方法，其特征在于，步骤S3中，需排除血清干扰成分，具体步骤为531、在服药之前，Sl中的各个试验对象需空腹口服等药量的淀粉，而后根据S2中的时间间隔方式在各个时间点采集血液样本，采用HPLC色谱技术进行检测获得空白血清的色谱峰；532、在服药之后，采集血液样本，并采用HPLC色谱技术对含药血清进行检测，以步骤 S31中空白血清色谱峰为参照，从含药血清中删除与之相重叠的峰，剩余的色谱峰即是药物入血的药物成分峰。
3.根据权利要求2所述用于研究药效物质基础的方法，其特征在于，步骤Sl中，试验对象需排除长期服药、有免疫性疾病或其他急、慢性疾病的对象。
4.根据权利要求3所述用于研究药效物质基础的方法，其特征在于，步骤Sl中，试验对象空腹8-16小时后口服药物，给药剂量为0. 06g-l. 5g/kg。
5.根据权利要求1-4任一所述用于研究药效物质基础的方法，其特征在于，步骤 S2 中，试验对象服药后，在 0、2、5、10、15、20、30、60、90、120、150、180、210、240、 360分钟的时间点，采集各个试验对象的血液样本。
全文摘要
本发明公开了一种用于研究药效物质基础的方法，包括1、选择n名药物试验对象，空腹口服药物；2、服药后，以时间间隔方式分别采集试验对象的血液样本；3、检测某一时间点某一试验对象的血液样本，获得该时间点药物进入该实验对象血液的成分含量；4、检测某一时间点某一试验对象的血液样本，获得该时间点该实验对象血液中各种蛋白成份的含量；5、根据步骤3、4获得的多组数据，统计出药物进入血液后药物成分与蛋白成份的相关系数，当某一药物成分与某一蛋白成份的相关系数符合统计学意义，则确认该种药物成分为有效药物成份。本发明方法能够速、准确筛选药物药效物质，对新药研究、精减处方、明确药理药效具有非常重要的意义。
文档编号G01N30/02GK102188720SQ20101011953
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月8日 优先权日2010年3月8日
发明者冯宝民, 刘狄, 李文哲, 王惠国, 苑艳霞, 邱琳 申请人:大连大学