专利名称：心血管疾病的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测在例如人或者非人类动物，特别是哺乳动物的宿主中心 血管疾病(CVD)的可能性或倾向性的检测方法，并具体涉及一种用于在该宿主出现明显的 CVD症状发作之前，检测CVD的可能性或倾向性的检测方法。
背景技术：
心血管疾病是人类健康不良的一个主要来源。在1998年，全欧洲的死亡人数中大 约有40%的死于CVD (即，每2. 5例死亡中就有1例)。据估计，2002年，在美国，将有超过 一百万人遭受新发现的和复发的心脏冠状动脉发作的病痛，并且在患有这些疾病的人数中 将有超过40%的人会死亡。这些人中的许多都是在未经就医或治疗的情况下突然死亡的。 许多人都将不能认识到他们易患心血管疾病。然而，早期或抢先治疗，例如改变饮食、减少或停止吸烟、增加运动量、降低体重等 在预防CVD或降低CVD的倾向性方面具有很高的成功率。因此，如果能够检测CVD或CVD 的可能性或倾向性，就能够有效地进行治疗。因此，需要一种在CVD疾病发展到超过通常可成功治疗(例如改变生活方式和/ 或习惯)的阶段之前，用于诊断CVD，特别是诊断CVD的可能性或倾向性的方法。特别地， 需要一种在当症状对宿主和第三方例如内科医师并不明显的早期阶段，用于检测CVD的方 法，即需要用于测试“无症状宿主”的方法。这种方法可被用于筛选一般人群(即普查)或者易感人群，例如年龄超过40岁的 男性、从事高压力工作的工人、具有不良饮食习惯的个人、患有临床肥胖症的个人、吸烟者 等。在诊断出具有CVD可能性或CVD倾向的病例中，可以进行预先治疗和/或鼓励病人调 节生活方式和习惯。同样地，当检测出具有CVD可能性或CVD倾向时，可对病人进行进一步的测试，例 如使用更昂贵的或更费时的技术，例如有和没有身体活动的ECG(心电图)、心肌灌注的放 射性同位素成像、X射线(例如CT)心肌血管造影、MR心肌血管造影或灌注成像等。从而 通过使用本发明的廉价、易行的检测方法在初始筛选中(例如在“无症状健康”宿主的普查 中)确认CVD的存在、可能性、或倾向性，在健康损害变得无法挽回之前，提高检测或识别未 被发现的CVD、或CVD倾向性，同时，限制使用了昂贵和耗时的不必要测试。所谓“CVD”表示任何中断向躯体的生命维持区域例如大脑、心脏等的供氧的心 脏、动脉、或静脉的病况。CVD的实例为动脉硬化(arteriosclerosis)、急性心肌梗塞 (acute myocardial infarction)(angina pectoris) >(ischemic heart disease)、脑血管疾病(cerebrovascular disease)、中风(stroke)、蛛网膜下出 il (subarachnoid haemorrhage)、；^ H 内出 il (intra-cerebralhaemorrhage)、！| ■
4(cerebral infarction)、充血性心力衰竭(congestive heartfai lure)、心绞痛(angina)、 心力衰竭(heart attack)、心脏停搏(cardiac arrest)与心律不齐(arrhythmia)。

发明内容
本发明是基于如下令人惊讶的发现，S卩，发现蛋白钙卫蛋白是一种在CVD症状发 作之前(即无症状宿主)对于CVD可能性或CVD倾向有用的“标记子”或者“指示子”。特 别地，已经惊奇地发现在各种体液中异常高的钙卫蛋白水平，在对该宿主或第三方(例如 内科医师)明显CVD症状的发作之前，指示着CVD的易感性。因为该避免引起疑问，术语钙卫蛋白是“Li蛋白”、“MRP 8/14”、“囊性纤维化(关 联)抗原(CFA) ”和“钙粒蛋白”的同义表达。钙卫蛋白同时存在二聚或三聚形式。作为二聚物，钙卫蛋白包含多肽链S100A8与 S100A9。作为三聚物，钙卫蛋白是具有两个重链(14kD)与一个轻链(SkD)的非共价连接的 36kDa杂三聚蛋白。钙卫蛋白是一个钙结合性蛋白，并且在与钙结合时，钙卫蛋白可以耐热并耐蛋白 水解。这使得能够使用大量的试验方法和条件。钙卫蛋白的抗原表位图谱显示可以制造对配合和/或单一蛋白链具有专一性的 抗体。已经表明在钙卫蛋白配合物上存在至少四个单独免疫原位点。一些抗体识别重链或 者轻链，而另一些则同时识别两者。可在人体各部分的细胞、组织和体液中发现钙卫蛋白，并且它主要是从嗜中性粒 细胞与单核细胞衍生而来的。很可能所有人体都携带有钙卫蛋白，这是因为在超过5000个 个体测试中，还没有发现不携带钙卫蛋白的个体。在大鼠、小鼠、兔、羊、牛与猪身上也发现 有钙卫蛋白。因此，它是一种含量丰富、普遍存在的分子。在体内，钙卫蛋白涉及许多生物机能，这包括胞内信号转导、嗜中性粒细胞活化、 与细胞增殖、抗菌活性以及嗜中性粒细胞防御相关的胞内酶的抑制。钙卫蛋白同时还是炎 症反应的调节蛋白，并且，在这一过程中还可以起到刺激产生免疫球蛋白、趋化因子活性以 及嗜中性粒细胞固定因子的作用。虽然体液很可能总是包含钙卫蛋白，但已经发现在各种体液中的钙卫蛋白的浓度 是会发生变化的，例如，在多种疾病状况(例如炎症性、传染性与恶性疾病)中其浓度会增 加。因此，可以使用如下方法作为诊断这种疾病的手段，测定正遭受这种疾病的病人(即对 该宿主和/或第三方明显的症状发作的个体)的体液中的钙卫蛋白的浓度，并与健康(即 非患病)宿主的体液中的钙卫蛋白浓度进行比较。例如，尽管细菌感染和病毒感染的症状非常相似，并且仅从它们的症状进行诊断 是非常困难的，病毒感染宿主的血浆/血清中钙卫蛋白的浓度上升1 2倍，而细菌感染宿 主则上升1 18倍。因此，对于已经发现感染症状的宿主，可以测量其体液中的钙卫蛋白 的浓度、诊断其感染情况，并进相应的治疗。可使用钙卫蛋白诊断测试的其它疾病包括风湿性疾病(rheumaticdiseases) (例如风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、青年类风湿性关节炎(juvenile rheumatoid arthritis)、全身性红斑狼疫(systemic lupuserythematosus))、斯耳口格 伦氏综合症(Sj0grens syndrome)、眼内炎症(intraocularinflammatory)、囊性纤维i-t (cystic fibrosis)、急个生与个曼个生月市(acute andchronic lung disease)、月市· 瘤(lung carcinoma)(鳞状细胞)、月市癌(pulmonarycancers)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease)、胃癌(gastric cancer)、结肠 M-Ml MiM^iih (colorectal ademona orcancer)、胃■氏 _ (Chrohn ‘ s disease) > ^ 荡性结肠炎(ulcerative colitis)、胃肠粘膜炎(gastrointestinal mucosal)、尿路 结石(urinary stones)、酒精性肝脏病(alcoholic liver disease)、口腔粘膜炎性疾 病(oral inflammatory mucosaldisease)、CNS 炎性疾病(CNS inflammatory disease) (例如多发性硬化(multiplesclerosis)与急性脑炎(acute enc印halitis))、HIV感染 (HIV infection)、HIV 感染病人的继发 CNS 感染(secondary CNS infections in HIV infected patients)、尿路感染(urinary tract infections)、膀胱炎(cystitis)、肾 盂肾炎(pyelon 印 hritis)、内源性后葡萄膜炎(endogenous posterior uveitis)、血液 疾病(haematologicalconditions)(例如白血病(leukaemia))、发热性疾病(febrile conditions)(感染性的与非感染性的)、急性心肌梗塞(acute myocardial infarction) 与分离输血(apheresis)。还已经发现在心脏直视手术期间钙卫蛋白的血浆浓度增加(Semb，A. G.等，Eur. J. Cardio-thorac Surg. (1991)5:363-367, Saatvedt, K.等，Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. (1996)30 :53-60，Moen，0.等，Perfusion (1994) 9 :109_117)。更具体地说，Saatvedt 等报道了在心肺分流手术开始之后钙卫蛋白浓度上升，并且在术后48小时达到最高值。已经惊讶地发现可以通过测定从所述宿主取得的含钙卫蛋白样品中的钙卫蛋白 的浓度来检测宿主的CVD可能性或CVD倾向。换言之，已经发现测定从宿主取得的含钙卫 蛋白样品中的钙卫蛋白的浓度可被用于在对宿主和第三方(例如内科医师)明显可见的症 状发作之前，预测该宿主是否或者多大可能罹患CVD。所谓“具有可能性”或“具有倾向性”是指对当前接受测试的无症状宿主在将来罹 患CVD疾病的可能性或几率。这可以采用反映将来(例如在随后的1 2年中，至少在随 后的6个月中)的CVD的相对风险的指数、比例、百分数或类似的数字的形式。因此，从一个方面来看，本发明提供了一种检测人或非人类动物宿主患有CVD可 能性或倾向性的检测方法，所述的方法包括测定取自所述宿主的含钙卫蛋白样品，例如血 液、血浆、血清、脑脊液(cerebrospinal fluid)、口腔液(oral fluid)、尿液、排泄物、滑液 或脓液(synovial or empyema fluid)中的钙卫蛋白的浓度。所谓“检测”是指测定钙卫蛋白浓度的定量或半定量值。这个值可以是测试样品， 例如进行处理以除去细胞或其它的非测试样品组分、或者浓缩或稀释该样品或者将该样品 转移到一个单独的介质例如固体基质中之后的浓度的值。或者，该检测可以简单地是定性的，即只表明该钙卫蛋白是否高于或低于一个或 多个预选的阈值，例如表示通过该测试检测不会出现CVD可能性或CVD倾向的值。这些钙 卫蛋白的阈值或其它参考值的精确值取决于样品的性质、宿主的年龄、体重、性别和种族， 并可以以常规方式通过测量未患有CVD和处于CVD的不同发展阶段的相同宿主的相关体液 的钙卫蛋白浓度来测定该值。根据本发明的方法指示“检测的，，或测定钙卫蛋白浓度的值可以是钙卫蛋白的绝 对浓度，或者可以是反映钙卫蛋白浓度的指数、比例、百分比或类似数字。
可被用于本发明的检测方法的人体样品可以是任何包含钙卫蛋白的样品，例如体 液或组织样品，或者悬浮液等。优选样品为体液，例如尿液、脑脊液、口腔液、滑液或脓液，或 者更优选血液或者血液衍生的样品。在这种情况下(即，使用血液和血液衍生的样品时)， 优选用于分析的样品不含细胞(例如血清或血浆)。或者，可以使用排泄物。在用于本发明的检测方法之前，可以预先对该样品进行处理。因此，可以对样品进 行处理以除去任何细胞和/或任何非测定的样品组分。还可以对样品进行浓缩、稀释处理， 或者将钙卫蛋白转移到一个单独的介质上，例如固体基质上。例如，可以通过加入缓冲液或 者其它的水溶性介质稀释该样品。或者，可以直接使用该样品，例如血浆或血清。例如可以在用于本发明的检测方法之前任选地使用钙或者钙类似物(例如另一 个碱土金属的离子)处理该样品。该钙或钙类似物可以是提供Ca2+离子的任何形式(例如 CaCl2)。如果使用钙，优选将足够的钙或钙类似物加入到样品中以饱和钙卫蛋白的结合部 位。例如，可以加入10摩尔过量、或者更优选5摩尔过量、或特别优选3摩尔过量的钙源。尽管钙卫蛋白的检测是已知的并且可被用于本发明的方法，此前并没有任何暗示 说钙卫蛋白是CVD可能性或CVD倾向的标记子或指示子。换言之，先前并没有任何这样的 暗示无症状宿主的钙卫蛋白浓度可被用作CVD的可能性或倾向性的标记子或指示子，并 且，具体地并没有这样的暗示钙卫蛋白浓度可作为健康宿主(即无症状宿主)普查的检测 方法中的标记子或指示子使用。在本发明的检测方法中可以使用任何已知的检测钙卫蛋白的方法。因此，例如 US-A-4833074(Fagerhol等)所公开的分离钙卫蛋白以及随后产生单特异性抗血清的方 法可被用于制造用于任何常规方法的抗钙卫蛋白抗体。所产生的抗钙卫蛋白抗体可被用 于例如酶连接免疫试验和放射免疫试验。对于钙卫蛋白还可以使用例如NycoCard (Axis-Shield PoC，Oslo，挪威)免疫测定格式。该检测使用一个固相、夹心形式，其中的测 试装置包括涂布有固定的抗钙卫蛋白抗体的膜。因此，将样品(任选地被稀释的)施加到 该装置上并且当该样品流过该膜时，可以俘获任何存在的钙卫蛋白。然后使用与钙卫蛋白 抗体复合物结合的金抗体共轭处理固定在膜上的钙卫蛋白，并且通过对红光吸光率所测定 的(由于金珠产生的)色强度与钙卫蛋白的量成正比。因此，可以从常规方式制订的标准 曲线计算得到钙卫蛋白的浓度。或者，可以对例如排泄物(购自Eurospital )中的钙卫 蛋白使用商业试验(Calpresto )。该检测使用针对酶连接的免疫吸收剂检测系统中的钙 卫蛋白的多克隆抗体。因此，存在于取自宿主的样品中的钙卫蛋白与抗体结合，其中该抗体 被吸收到塑料井的表面。然后加入酶的基质，并且所产生的着色产品的强度与酶的量成正 比，并因此与钙卫蛋白的量成正比。因此，可以从常规方式制订的标准曲线计算得到钙卫蛋 白的浓度。实际上，单克隆和多克隆抗钙卫蛋白抗体都可从商业途径获得。鸡蛋和兔子多克 隆是分别从例如 Norwegian Antibodies AS 和 Axis-Shield Diagnostics 得到的，而老鼠 单克隆抗体可从丹麦的Dako A/S获得。任何可以通过例如任何用于制造抗体的常规方法 得到的抗钙卫蛋白抗体都可被用于本发明的方法。例如，可根据Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY 所述 的规程制造兔子抗钙卫蛋白以及单克隆抗体。或者，可以将含钙卫蛋白溶液定期注射到小鸡上，并然后收集鸡蛋的蛋黄来制备抗钙卫蛋白抗体。然后可以按照常规方法分离鸡蛋多克隆抗体并通过亲和色谱法纯化。优选将本发明的方法用于健康(例如无CVD症状)宿主的普查。当检测出患CVD 可能性或患CVD倾向性时，可对该宿主进行进一步的测试(例如使用专门针对CVD的更昂 贵的技术)以证实CVD的存在与否。通常，除了测样品之外，在实施该检测方法时，还将检测含有已知钙卫蛋白含量的 校准样品。这种测试可被用于绘制标准曲线，而根据该曲线可以测定所研究的样品的钙卫 蛋白的含量。校准样品的性质以及对于在钙卫蛋白的检测中所使用的转化和修正因子的选 择可以变化，并取决于例如所实际使用的检测技术中钙卫蛋白的检测方式，并取决于该方 法中影响检测结果的其它方面，例如缓冲液组合物、检测条件等。通常，使用钙卫蛋白含量为0 5000mg/L的校准样品。钙卫蛋白浓度的值通常出 现的参考范围为0. 1 10mg/L。通常，没有或具有很低患CVD可能性或患CVD倾向性的人的血浆或血清中的钙 卫蛋白浓度将为0. 01 0. 75mg/L。更具体地说，没有或具有很低患CVD可能性或患CVD 倾向性的人的血浆或血清中的钙卫蛋白浓度将为0. 05 0. 70mg/L，更具体地为0. 10 0. 66mg/L,例如为0. 15 0. 45mg/L。例如，没有或具有很低患CVD可能性或患CVD倾向 性的女性血清或血浆中的钙卫蛋白浓度为0. 09 0. 53mg/L，例如约0. 31mg/L或0. 30mg/ L0没有或具有很低患CVD可能性或患CVD倾向性的男性血清或血浆中的钙卫蛋白浓度为 0. 12 0. 66mg/L，例如 0. 30 0. 39mg/L，特别是 0. 31mg/L。血清或血浆中钙卫蛋白浓度大于0. 75mg/L的将通常是患CVD可能性或患CVD倾 向性非常强烈的表现。因此，可用于预测患CVD可能性或患CVD倾向性的检测的阈值为 0. 32 0. 77mg/L,例如约0. 67mg/L,优选约0. 70mg/L,特别是约0. 76mg/L。更优选可用于预 测患CVD可能性或患CVD倾向性的检测的阈值为0. 30 0. 50mg/L，更优选0. 32 0. 47mg/ L，例如约 0. 45mg/L。通常，没有或具有很低患CVD可能性或患CVD倾向性的人的排泄物中的钙卫蛋白 浓度将为0. 01 10mg/L。更具体地说，这种人的排泄物中的钙卫蛋白浓度将为0. 05 9. Omg/L,更具体地为 0. 50 8. Omg/L。排泄物中钙卫蛋白浓度大于10mg/L的将通常是患CVD可能性或患CVD倾向性非 常强烈的表现。因此，可被用于预测患CVD可能性或患CVD倾向性的阈值通常为大约9mg/ L，优选大约10. 5mg/L，特别是大约llmg/L。然而，优选使用对于从相似类型(年龄、性别、体重、种族等)病人得到的相同体 液样品类型进行相同检测技术所测定的钙卫蛋白来计算该阈值，其中所述相似类型病人为 从健康阶段到CVD早期阶段到CVD严重阶段。更优选该阈值为在早期、健康阶段对相同病 人的测定值。因此，特别是在有风险的情况下，可以基于常规情况(例如每6个月或1年) 按照普查程序检测其钙卫蛋白水平。在本发明优选的检测方法中，所述的方法还包括另外检测从宿主取得的样品中 其它CVD的可能性标记子的浓度。适宜的标记子的实例可以是高半胱氨酸、活化接触因 子XII、胆固醇、胆固醇HDL比、纤维蛋白原、组织型纤维蛋白溶酶原活化因子、第V、VII和 VIII因子、脂蛋白(a)、冯维勒布兰德氏因子(von Willebrand factor)抗原、纤溶酶-α 2 抗血纤维蛋白酶复合物、凝血酶原片段1+2、凝血酶-抗凝血酶III复合物、纤维蛋白肽Α、纤维蛋白降解产物、D-二聚物、活化蛋白C-抵抗剂、第VIIc和VIIa因子、凝血酶、血清淀粉 状蛋白A、脉管粘着分子和冠状动脉钙。第二标记子优选选自高半胱氨酸或C反应蛋白。本发明的检测方法更优选进一步包含另外检测取自该宿主的样品中的C-反应蛋 白(CRP)的浓度。优选在检测所述钙卫蛋白的同时或随后检测CRP的浓度。可以使用任何标准的免疫技术(例如ELISA、RIA等)进行CRP的测量。或者可以 通过 NycoCard (购自 Axis-Shield PoC, Oslo，挪威)测定。除了 CRP浓度大于1. 75mg/L之外，血清或血浆中钙卫蛋白浓度大于0. 75mg/L通 常将是患CVD可能性或患CVD倾向性的一个非常强的表现。优选，上述浓度的出现与钙卫 蛋白或CRP浓度单独出现比较而言是更强的患CVD可能性或患CVD倾向性的表现。因此，钙卫蛋白和CRP的阈值通常分别为0. 32 0. 77mg/L和1. 70mg/L，更优选分 别为大约0. 67mg/L和1. 75mg/L,更优选分别为0. 70mg/L和2. 00mg/L,特别优选分别为大 约0. 76mg/L和2. 25mg/L，其中超过所述阈值时将进行检测以高度预测患CVD可能性或患 CVD倾向性。更优选的阈值分别为0. 30 0. 50mg/L和0. 75mg/L,更优选0. 32 0. 47mg/ L和0. 75mg/L，例如分别为大约0. 45mg/L和0. 75mg/L，其中超过所述阈值时将进行检测以 预测患CVD可能性或患CVD倾向性。从另一个方面来看，本发明提供了一种用于本发明方法的检测试剂盒，所述试剂 盒包括试剂以及用于实施所述检测法和用于解释检测结果的说明，并任选地，含钙卫蛋白 参比样品，以及任选地含检测器。优选所述的试剂盒进一步包含用于测定CRP浓度的试剂 和说明。试剂盒中的说明可以是例如标签、手册或者指导传单的形式，但是，它们也可以采 用计算机程序或数据载体，例如电脑磁盘的形式。存在检测器时，该检测器通常是能够检测一个报告种类，如分光计、核辐射探测 器、散射光检测器等的检测器。该试剂将是适合用于钙卫蛋白测定的试剂，例如在所引用的与由Eurospital 和 NycoCard(购自Axis Shield ASA, Oslo，挪威)得到的钙卫蛋白现有测试相关的文献中所 描述的适宜的试剂，。US-A-4833074中所述的试剂也是合适的。在本发明中用于检测钙卫蛋白浓度的特别优选的方法为基于颗粒的免疫测定。这 是一项基于钙卫蛋白浓度的浊度法测定的灵敏技术。该检测方法所具有的灵敏度能够有利 地使得在体液(例如血浆或血清)样品中相对低的钙卫蛋白浓度进行高精度地测定。同时， 也可以准确地测定较高的钙卫蛋白浓度。浊度法测定还具有如下优点，在检测中的物理分离不需要固体表面，并且也不需 要多个洗涤和/或分离步骤。因此，与现有技术(例如ELISA)相比，钙卫蛋白的均相浊度 法测定可以快速、方便地进行，并且可以例如实现自动化。和涉及例如固体表面的非均相技 术的自动化相比，基于浊度检测法的自动化是相对容易的。并且，得到的自动化的均相处理 通常更可靠，例如更不易中止。自动化的浊度检测法还是快速的，允许样品高的流通量，并且运行起来相对便宜。 通常可以使用商业可得机器人例如从Roche Diagnostics购得的Cobas Mira或Hitachi 711来进行该检测方法。当对具有CVD可能性或倾向性的个体进行例行测试时，这种自动化 的检测是特别有吸引力的。
对于钙卫蛋白浓度的浊度法测定，包含钙卫蛋白的样品通常为体液，例如尿液、脑 脊液、口腔液、滑液或脓液，或更优选血液或血液衍生的样品。在这时，用于分析的样品通常 将优选为无细胞的(例如血清或血浆)。因此，可以对样品进行处理以除去任何细胞和/或任何非检测的样品组分。可以 对样品进行浓缩或稀释处理，或者将钙卫蛋白转移到单独的介质，例如固体基质中。例如， 可以通过加入水、缓冲液或其它的水溶性介质来稀释样品。或者，可以直接使用样品，具体 是血清或血浆样品。任选地，可以在用于该检测方法之前使用钙或钙类似物处理样品。钙或钙类似物 可以是能够提供Ca2+离子的任何形式(例如CaCl2)。如果使用钙，优选将足够量的钙或钙 类似物加入到样品中以饱和钙卫蛋白的钙结合部位。例如，可以加入10摩尔过量、更优选 5摩尔过量、或特别优选3摩尔过量的钙源。钙卫蛋白浓度的浊度法测定的不透明度通常是，通过将含钙卫蛋白样品或其等分 部分与抗钙卫蛋白抗体、抗体片段或抗钙卫蛋白抗体的混合物(例如单克隆抗体的混合 物)接触而产生。可以使用购自NorwegianAntibodies AS的卵多克隆抗人钙卫蛋白抗体 产生不透明度。任何可以通过例如任何用于制造抗体的常规方法得到的抗钙卫蛋白抗体都 可被用于本发明的方法。用于钙卫蛋白浓度的浊度法测定的抗体或抗体片段优选与其它的可能存在于洗 脱物中的血蛋白不发生或几乎不发生交叉反应。因为乳浊是由于多重钙卫蛋白结合产生乳 浊中心的钩形效应(hook effect)产生的，所使用的抗体或抗体片段的数量当然应相对于 含钙卫蛋白标准样品进行优化的。如上所述，钙卫蛋白具有多个抗体结合部位，并且特别适 合用于在这种检测中进行检测。在一个优选的实施方案中，可以通过直接或间接地结合或偶合到任何已知的通常 用于固定的固体载体或基质上来固定抗钙卫蛋白抗体、抗体片段。优选该固体载体或基质 采用颗粒，优选纳米颗粒的形式。方便地，该固体载体可以是由玻璃、二氧化硅、胶乳、金属 (如金)或聚合材料(例如聚乙烯)制成。优选载体是由聚合材料例如聚乙烯制成。可以通过任何常规方法来实现抗钙卫蛋白抗体或抗体片段的固定和结合。例如， 可以通过在缓冲液中搅拌(例如在室温下搅拌24小时)并然后结合使用生物素标记的抗 钙卫蛋白抗体(按照现有技术的常规方法制备的)，将抗生物素蛋白固定到氯甲基活化的 聚苯乙烯纳米颗粒(购自美国InterfacialDynamic公司)上。因此，例如，将用于测试CVD 可能性或倾向性的取自该宿主的血浆加入到分光光度计石英池中的涂布有抗生物素蛋白 的纳米颗粒的溶液中，随后加入生物素标记的抗钙卫蛋白抗体。然后采用浊度计读数。或者，可以在加入血浆或血清之前加入生物素标记抗体。换句话说，尽管无论使 用何种用于浊度检测的仪器通常都是使用相同的试剂，但是不同试剂的精确的加入顺序是 可以改变的。通常，所使用的顺序应当与所使用的分光光度计(例如岛津UV-160分光光度 计)所附的说明一致。得到浊度计读数(即，定期测量适宜的波长下的吸光率)并测定相对于参比样品 的吸光率。任选地，可以使用多波长仪器以得到浊度计读数并可以提供更精确的结果。用于 获取浊度计读数的适宜的仪器包括Cobas Mira、RocheIntegra和Merck，s Turbiquant0在另一种可供选择的试验装置中，可以将抗钙卫蛋白抗体或抗体片段直接固定在氯甲基活化的纳米颗粒(购自美国Interfacial Dynamic公司)上。例如，可以将抗钙卫蛋 白抗体(例如购自Norwegian Antibodies AS的卵多克隆抗体)在缓冲液(IOmM硼酸盐， 15mM氯化钠、pH值9. 0)中与上述活化颗粒混合并搅拌(例如在室温下搅拌24小时)，以 得到涂布有抗钙卫蛋白抗体的纳米颗粒。这种纳米颗粒可以通过将其加入到取自测试CVD 可能性或倾向性的宿主的溶于缓冲液的血清或血浆样品中，并以运动模式获取浊度计读数 用于钙卫蛋白浓度的浊度测试。或者，可以将血浆或血清加到抗钙卫蛋白抗体涂布的纳米颗粒上。换句话说，尽管 无论使用何种用于浊度检测的仪器通常都是使用相同的试剂，但是不同试剂的精确的加入 顺序是可以改变的。通常，所使用的顺序应当与所使用的分光光度计(例如岛津UV-160分 光光度计)所附的说明一致。适合按照本发明的检测方法获得浊度计读数的自动化机器人的实例包括Roche Diagnostics 制造的 Cobas Mira 和和 Hitachi 711。抗体或抗体片段可以结合的颗粒通常为球状。检测中所使用的颗粒的大小可以影 响钙卫蛋白浓度测量的精度。尽管更大的颗粒允许检测更低的钙卫蛋白浓度，但是它们降 低了的表面积意味着它们的结合量也较低。例如，直径扩大一倍，单位质量的颗粒的结合量 减半。此外，粒径的增加将导致在这种检测所通常使用的波长下(例如330 600nm)的 背景光吸光率以及光悬浮(light suspension)的增加。因此，尽管更大的颗粒提高了检测 的灵敏度，但这也可能伴随一些精确度的损失，并且具体是增加了得到的假阴性结果的数 目。这是在含有较高钙卫蛋白浓度的样品(即，取自那些具有较高CVD可能性或倾向性的 个体的样品)中特别容易发生的情形，其中该纳米颗粒结合的结合部位可以在并非所有的 钙卫蛋白被结合的条件下变得饱和。这些与改变粒径相关的相反作用(例如增加粒径提高了灵敏度但是降低了精确 度)代表了在发展用于检测存在于体液中钙卫蛋白的含量范围的灵敏检测法过程中需要 克服的重要问题。在本发明的检测方法中还优选所使用的颗粒能够精确测定各种范围内的浓度。这 可能表示对否定的结果(即，低于阈值的浓度)以及肯定的结果都具有很高的置信度。特 别优选在本发明的检测方法中可以测量钙卫蛋白浓度为0. 5 50mg/L(例如1 40mg/L) 的样品。抗体或抗体片段可以结合的颗粒通常为粒径为1 150歷，例如10 90nm或15 60nm，例如44nm的球状颗粒。在特别优选的本发明的检测方法中，抗体或抗体片段所结合 的颗粒的粒径为55 104nm，更优选65 llOnm，例如70 90nm。或者，可以一旦抗体或抗体片段结合到其表面就测定颗粒的直径。在这种情况下， 涂布有抗体或抗体片段的颗粒的直径优选为65 140nm，更优选为75 120nm，并更优选 为80 lOOnm。当所测试的样品为血浆时，特别优选这些大小的涂布颗粒。颗粒无论是“裸露的”还是“涂布的”状态，都优选具有的直径不会导致颗粒本身 吸收用于分光光度进行测定的光的波长。因此，涂布纳米颗粒的悬浮液大致(例如基本上) 为透明的，直至由钙卫蛋白诱导的聚集体形成出现以导致形成的聚集体具有更大直径。这 种聚集体能够吸收分光光度计所使用的光的波长。
此外，优选颗粒基本上大小相同，并且，更具体地说全部具有相同直径。优选使用 单分散金属(例如金)或聚合物颗粒。单分散聚合物颗粒购自DynalBiotech AS，0slo，挪威。虽然不限于任何理论，但可能是应用固定的抗体或抗体片段通过增加任何由钙卫 蛋白衍生得到的不透明位点的大小而增加了检测的灵敏度，并因此增加了从中散射的量。 通过使用基本上具有相同大小的固体载体或基质(例如纳米颗粒)，可以进一步提高浊度 检测法检测的灵敏度。在常规的浊度检测法中，通常优选向洗脱物中加入聚合乳浊化增强剂，例如聚乙在进行浊度测定之前，可以将流分、抗体或抗体片段，优选与纳米颗粒结合，以及 任选地增强剂在室温下孵化较短的时间，例如5分钟 1小时，优选大约10分钟。任选地， 在使用浊度法技术测定钙卫蛋白的浓度的过程中，可以使用运动读数模式。在乳浊测定中所使用的光应当具有合适的波长，例如300 600nm。在这一点上， 已经发现使用300 450nm的过滤器，优选340nm或405nm的过滤具有特别好的效果。使 用560nm过滤器也可以具有特别好的结果。通常，除了测样品之外，在实施检测方法时，还将检测含有已知钙卫蛋白含量的校 准样品。这种测试可被用于绘制标准曲线，而根据该曲线可以测定所测试的样品的钙卫蛋 白的含量。优选使用钙卫蛋白的含量至多为5000mg/L(例如1500、1000、750、250、100)或 者至多为100mg/L(例如75、50、25、5、l.(^P0.5mg/L)的钙卫蛋白样品。更优选钙卫蛋白 样品的钙卫蛋白含量至多为1 Omg/L (例如10、8、6、4、2mg/L)，更优选至多5mg/L (5、4. 5、4、 3. 5、3、2· 5、2、1· 5、1、0· 5mg/L)。上述用于检测钙卫蛋白的浊度检测法令人吃惊地可靠、快捷、廉价、易行和易于自 动化。这与当前可用的相对复杂、且不能直接被诊断实验室所通常使用的自动化多任务诊 断机器进行应用的检测方法相比形成了鲜明的对照。当涉及许多混合、添加和/或稀释步骤时，自动化是特别需要的，因为这可以实现 更高程度的精确度。也可以使用机器人以得到更高水平的可靠性和/或重现性。自动化还 提高了处理量。然而现有的可以提供合理的精确度的检测方法(例如ELISA)难以自动化。这至 少是部分因为它们通常涉及多个洗涤和分离步骤(例如附着到固体表面)，并且非均相过 程的自动化通常是困难的。此外，这些方法通常涉及相对大量的步骤，这又增加了任何自动 化过程的复杂性。其它的测定钙卫蛋白的常规方法(例如浊度法)提供了较高的精确度但 是需要专门的设备实施测量。而专门的设备通常不易被结合到自动化过程中。实际上，一直需要一种用于诊断技术的廉价、可靠、快捷和易行的钙卫蛋白检测方 法。因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于测定含钙卫蛋白体液中 的钙卫蛋白的检测方法，所述的方法包括(a)获得所述体液的、或者来自所述体液的含钙卫蛋白的液体样品；(b)将所述体液的所述样品与任选地与纳米颗粒结合的、抗钙卫蛋白抗体或抗体 片段接触，以结合所述的钙卫蛋白；
(c)任选地，加入一个不透明度增强剂；和(d)通过浊度测定法测定钙卫蛋白含量。这种检测可被用于各种疾病状况的诊断，所述疾病状况的特征在于不正常水平 (例如高水平)的钙卫蛋白。这类疾病状况包括风湿性疾病(例如风湿性关节炎、青年类 风湿性关节炎、全身性红斑狼疮)、斯耶格伦氏综合症、眼内炎症、囊性纤维化、急性与慢性 肺疾病、肺癌瘤(鳞状细胞)、肺癌、结肠直肠癌、炎症性肠病、胃癌、结肠直肠腺瘤或癌、克 隆氏病、溃疡性结肠炎、胃肠粘膜炎、尿路结石、酒精性肝脏病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性 疾病(例如多发性硬化与急性脑炎)、HIV感染、HIV感染病人的继发CNS感染、尿路感染、 膀胱炎、肾盂肾炎、内源性后葡萄膜炎、血液疾病(例如白血病)、发热性疾病(感染性的与 非感染性的)、急性心肌梗塞与分离输血。因此，从另一个方面来看，本发明提供了一种诊断上述任何疾病的方法，其包括前 文所述的方法，并随后将所述的钙卫蛋白含量与预定的阈值比较。表示任何特定疾病状态 的阈值可通过任何本领域已知的方法加以测定。优选该方法用于CVD的诊断。用于浊度检测法中人体样品可以是任何含钙卫蛋白的样品，例如体液或者组织样 品，或者悬浮液等。优选该样品为体液，例如尿液、脑脊液、口腔液、滑液或脓液，或更优选血 液或血液衍生的样品。在这种情况下(即，使用血液或者血液衍生的样品)，用于分析的样 品优选为无细胞的(例如血清或血浆)。或者可以是排泄物。人体样品优选选自对所诊断的疾病提供最大灵敏度指示的。因此，血液、血浆或血 清可被同时用于诊断感染(例如HIV、细菌感染)、风湿性疾病、白血病等，在诊断与胃肠道 相关的疾病(例如克隆氏病、溃疡性结肠炎、结肠直肠癌)的过程中可以测试排泄物。从另一个方面看，本发明提供一种用于本发明的诊断性浊度检测法的试剂盒，所 述试剂盒包含优选一种已知浓度的钙卫蛋白溶液，并更优选具有钙卫蛋白浓度范围的一组这类 溶液；一个或多个抗钙卫蛋白抗体或抗体片段，任选地固定在固体载体(例如纳米颗 粒)上；优选透光容器；优选乳浊化增强剂；和优选检测器。如果需要，可以安装一个自动化装置以接收含钙卫蛋白体液样品；以将该抗钙卫 蛋白抗体或抗体片段施加到，任选地固定到载体(例如纳米颗粒)上；以任选地施加乳浊化 增强剂；并以估计钙卫蛋白含量。相信这样的装置也落入了本发明的范围内。现在，参照下面非限制性的实施例和附图对本发明进行说明，其中


图1为在200个受试宿主中的钙卫蛋白的分布曲线。图1的概括统计如下Anderson-Darling 正态检验A2 8.160P-值0.0000103]平均值0. 403
0104]标准偏差0.238
0105]方差0.057
0106]偏度1.679
0107]峰度3.302
0108]N199
0109]最小值0.070
0110]第一四分值0.240
0111]中值0.340
0112]第三四分值0.500
0113]最大值1.370
0114]Mu的95%置信区间0.370
0115]0.436
0116]Sigma 的 95%置信区间0.217
0117]0.264
0118]中值的95%置信区间0.310
0119]0.370
0120]图2为200个测试宿主中的钙分数的分布曲线。表2的概括统计如下 0121 ]Anderson-Darling 正态检验
0122]A2 25.037
0123]P-值0.000
0124]平均值217.060
0125]标准偏差399.000
0126]方差159201
0127]偏度3.462
0128]峰度15.341
0129]N200
0130]最小值0.00
0131]第一四分值0.00
0132]中值78.00
0133]第三四分值259.25
0134]最大值2794.00
0135]Mu 的 95%置信区间161.42
0136]272.70
0137]Sigma 的 95%置信区间363.35
0138]442.46
0139]中值的95%置信区间0.00
0140]117.33
0141]图3为200个测试宿主中的hsCRP的分布曲线。表3的概括统计如下
14
中值的95%置信区间 7.6208.400图5为钙阳性结果和钙阴性结果之间的钙卫蛋白的分布的点图；和图6和7分别为全部200个测试宿主和男性测试宿主的钙卫蛋白和hsCRP的ROC 曲线。
具体实施例方式实施例1 抗钙卫蛋白抗体(a)钙卫蛋白的分离可以按照如US-A-4，833，074 (Fagerhol)的实施例1和2所述的方法分离钙卫蛋白。或者可以从人类血沉棕黄层纯化钙卫蛋白。将EDTA(50mM，pH 7)加入的细胞中制 得2. 5mM EDTA的细胞悬浮液。然后将细胞在160mM氯化铵/IOmM碳酸氢钠中洗3分钟并 在4°C温度下离心(160xg)10分钟。在EDTA(2.5mM)/NaCl(150mM)中洗所得的片状沉淀物 (pellet)，并在4°C温度下再离心分离(55xg)10分钟。然后将该片状沉淀物悬浮于pH 7.4 的0. 625mM EDTA/18. 75mM巴比妥中，并在_70°C温度下冷冻至少24小时。随后解冻，将所得的材料离心分离(在3700xg)30分钟，然后除去上清液并过 滤(使用Millipore制造的0. 45 μ m过滤器)，然后将其装填在DEAE ( 二乙氨基乙基) 琼脂糖凝胶离子交换柱(Pharmacia制造)上，所述柱为由结合缓冲液(例如0. 63mM EDTA/18. 75mM巴比妥，pH 7.4)预先准备的。任何非结合性材料流过柱子并被洗脱出来。 一旦全部的非结合性材料从柱中洗脱出来，就使用含钙洗脱缓冲液(例如75mM巴比妥缓冲 液/IOmM CaCl2)洗脱纯钙卫蛋白。每个血沉棕黄层中得到大约25mg钙卫蛋白。(b)抗钙卫蛋白抗体的制备可以按照如US-A-4，833，074(Fagerhol)实施例3所述的方法制备抗钙卫蛋白抗体。作为选择可以制备鸡蛋多克隆。每14天4次(或者2个月)，然后每月1次向小 鸡注射包含钙卫蛋白(0. 5mg/ml)和弗氏佐剂的溶液。12星期之后，可以收集该钙卫蛋白注 入的小鸡的鸡蛋，并除去它们的蛋黄(不含膜)。在HCl (5mM)中稀释后，离心分离蛋黄并收 集上清液。然后过滤上清液并使用饱和硫酸铵处理使得最终的浓度达到3. 8M。离心分离 该混合物并收集所得到的沉淀，并将其溶于缓冲液中(0. IlM乙酸钠、0. 15M NaCUpH 7.4)。 最后使用孔径为10，OOOkD的薄膜透析所得到的溶液并然后使用亲和色谱法精制。通常用作亲和色谱的柱子包括琥珀酰亚胺活化琼脂糖凝胶的活化基质 (Amersham-Pharmacia制造的HiTrap NHS activated)，该基质适合用于钙卫蛋白的固定。 更具体地说，该活化的树脂在PH为7 8的条件下与钙卫蛋白中的游离胺自发地反应。对 于色谱分离，在施加到色谱柱中之前，通常将透析溶液在PBS中稀释至大约3mg/ml的浓度。 随后使用溶于冰冻PBS的6M脲或0. IM的柠檬酸钠溶液pH 3. 0洗脱该抗钙卫蛋白抗体。优 选使用0. IM的柠檬酸钠溶液。洗脱后，立即稀释该含抗钙卫蛋白抗体的馏分并在PBS中透 析。实施例2 钙卫蛋白的浊度检测
(a)抗生物素蛋白涂布的纳米颗粒的制备使用孔径为10，OOOkD的薄膜对购自美国Interfacial Dynamic公司的600 μ m的 4. 2% w/v氯甲基活化的纳米颗粒(直径44nm)相对于水进行透析。然后加入pH 9. 0的 0. 5ml的硼酸盐(IOmM)和氯化钠(15mM)溶液并混合。然后加入IOmg抗生物素蛋白(购自 Pierce Chemical Company)并在室温下搅拌24小时，所述抗生物素蛋白溶于pH 9的0.5ml 的IOmM硼酸盐和15mMNaCl溶液。然后加入40 μ 1的甘氨酸溶液(2Μ，ρΗ 9. 0)并在室温下 进一步搅拌该混合物4小时。然后将该颗粒稀释到IOOOml的体积，并首先在500ml的pH 9. 0的IOmM的硼酸盐 和15mM氯化钠溶液中，然后在pH 7. 4的25mM的Tris、150mM氯化钠和0. 01 % Tween 20溶液(购自美国Sigma公司)中，使用Pellicon XL过滤器(截断(cut off) 300, 000) 和labscale TTF系统(Millipore制造)按照仪器供应商的说明进行透析过滤。最后通过 离心分离和在25mM TRIS、150mM氯化钠和0. 01% Tween 20溶液中再悬浮该颗粒得到所 需要的浓度的抗生物素蛋白涂布的纳米颗粒。可以通过缓慢离心将在此制备过程中所形成 的任何聚集体除去。(b)使用抗生物素蛋白涂布的纳米颗粒的钙卫蛋白的检测具有浓度为每毫升大约0. 30mg上述抗生物素蛋白涂层纳米颗粒的悬浮液是通过 上述制剂在 pH 7. 4 的 25mM TRIS、150mM NaCl、0. 1% Tween 20 禾口 2% PEG 6000 溶液 (购自Sigma公司)中的离心分离和再悬浮来制备的。在记录式分光光度计(例如岛津 UV-160)的记录石英透明容器中，将500μ1的该颗粒悬浮液与取自测试CVD倾向性的宿主 的血浆样品(大约20 μ 1)混合。记录340nm的单色光的吸收，并且在60秒之后，将75 μ g 经0. 15nmol生物素(例如购自挪威Norwegian Antibodies AS的生物素标记亲和精制卵 多克隆)标记的、且在 50μ 1 的pH 7. 4 的 25mM TRIS、150mM NaCl 和 0.1% Tween 20 溶 液中稀释的抗钙卫蛋白抗体加入到石英容器中并混合。然后使用包含PH7. 4的25mM TRIS、 150mM NaCl和0. Tween 20参比池立即记录340nm单色光的吸收，并每隔一定间隔 (例如每2分钟)再次测定，直至经过大约15分钟。按照运动模式的标准浊度计读数或“终 点”读数计算在每个时间点上的吸收的增加。也就是说，在每个时间点上的吸光率的增加是 相对于在加入抗体涂布的纳米颗粒之前和/或在记录的末尾的读数来计算的。钙卫蛋白曲线是通过使用具有已知钙卫蛋白浓度的标准品进行相同的步骤得到 的。然后可以从钙卫蛋白曲线计算样品中的钙卫蛋白浓度。实施例3 作为选择的钙卫蛋白的浊度检测(a)抗钙卫蛋白抗体涂层纳米颗粒的制备使用孔径为10，OOOkD的薄膜对购自美国Interfacial Dynamic公司的Iml的 4.2% w/v氯甲基活化的纳米颗粒(直径44nm)相对于水进行透析。然后加入0. 5ml的 PH 9. 0的IOmM硼酸盐和15mM氯化钠溶液。将27mg精制的抗钙卫蛋白抗体(例如购自 Norwegian Antibodies AS的亲和精制卵多克隆抗体)相对于pH 9.0的IOmM硼酸盐和 15mM氯化钠溶液进行透析。接着将纳米颗粒加入到该精制的抗钙卫蛋白抗体中，并在室温下搅拌该混合物24 小时。然后加入40 μ 1的甘氨酸溶液(在pH 9. 0下为2Μ)并在室温下进一步搅拌该混合 物4小时。
然后将该颗粒稀释到IOOOml的总体积，并在IOOOml加入了 0. 01 % Tween 20 和3mg/ml卵白蛋白的pH 9. 0的IOmM硼酸盐和15mM氯化钠溶液中，使用Pellicon XL过 滤器(截止300，000)和labscale TTF系统(Millipore制造)按照仪器供应商的说明进 行透析过滤。最后通过溶液中颗粒的离心分离和再悬浮得到所需要浓度的抗钙卫蛋白抗体 涂布的纳米颗粒。可以通过缓慢离心将在此制备过程中所形成的任何聚集体除去。(b)使用抗钙卫蛋白抗体涂布的纳米颗粒的钙卫蛋白的检测制备悬浮液，其包含溶于50μ 1的pH 9.0的IOmM硼酸盐、15mM NaCl, 0. 1 % Tween 20、3g/l卵白蛋白溶液中400 μ g上述抗体涂布的纳米颗粒。同时，将溶于500 μ 1 检验缓冲液(从 Sigma 公司购得的 pH 7. 4 的 25mMTRIS、150mM NaCl,0. 1% Tween 20 和2% PEG 6000)的20 μ 1取自接受CVD可能性测试的宿主的血浆放入记录式分光光度计 (例如岛津UV-160)的记录石英池中，并测量对340nm单色光的吸光率。60秒之后，加入包 含400 μ g抗体涂布的纳米颗粒的上述悬浮液，并在池中混合。在加入抗体涂布的纳米颗粒 之后立即记录吸光率，并每隔一定间隔(例如每2分钟)再次记录直至经过大约15分钟。 在每个时间点上的吸光率的增加是相对于在加入抗体涂布的纳米颗粒之前和/或在记录 的末尾的读数来计算的。换句话说，得到在运动模式中的浊度计读数和“终点”读数。钙卫蛋白曲线也是通过使用具有已知钙卫蛋白浓度的标准品进行相同的步骤得 到的。然后可以从该曲线计算样品中的钙卫蛋白浓度。实施例4 作为选择的钙卫蛋白的浊度检测法(a)抗生蛋白链菌素涂布的纳米颗粒的制备使用孔径为10，OOOkD的薄膜对购自美国Interfacial Dynamic公司的600 μ m的 4. 2% w/v氯甲基活化的纳米颗粒(直径67nm)相对于水进行透析。将0. 5ml的pH 7. 4的 磷酸盐(IOmM)和氯化钠(150mM)缓冲溶液，与溶于0. 5ml的pH 7. 4的IOmM磷酸和150mM NaCl缓冲溶液(购自Pierce Chemical Company)的IOmg抗生蛋白链菌素一起加入，并在 室温下搅拌该混合物24小时。然后加入40 μ 1的甘氨酸溶液(2Μ，ρΗ 9. 0)，并在室温下进 一步搅拌该混合物4小时。然后将该颗粒稀释到IOOml的体积，并首先在500ml的pH 9. 0的IOmM硼酸盐和 15mM氯化钠溶液中，然后在pH 7. 4的25mM的Tris、150mM氯化钠和0. 01% Tween 20 溶液(购自美国Sigma公司)中，使用Pellicon XL过滤器(截止300，000)和labscale labscale TTF系统(Millipore制造)按照仪器供应商的说明进行透析过滤。最后通过离 心分离和在25mM TRIS、150mM氯化钠和0. 01% Tween 20溶液中再悬浮该颗粒得到所需 要的浓度的抗生物素蛋白涂布的纳米颗粒。可以通过缓慢离心将在此制备过程中所形成的 任何聚集体除去。通过挪威Sinteff AS测得抗生蛋白链菌素涂布的纳米颗粒的的平均粒径为 82nm。(b)使用抗生蛋白链菌素涂布的纳米颗粒的钙卫蛋白的检测浓度为每毫升约0. 60mg上述抗生物素蛋白涂层纳米颗粒的悬浮液是通过上述制 剂在 pH 7. 4 的 25mM TRIS、150mM NaCl、0· 1 % Tween 20 和 1 % PEG 6000 溶液(购自 Sigma公司)中的离心分离和再悬浮来制备的。将500 μ 1该颗粒悬浮液与取自CVD倾向 性的宿主的血浆样品(大约5 μ 1)在一个记录式分光光度计(例如岛津UV-160)的记录石英池中混合。记录560nm的单色光的吸收，并且在60秒之后，将75 μ g经0. 15nmol生物素 (例如购自挪威Norwegian Antibodies AS的生物素标记亲和精制卵多克隆)标记的，且在 50 μ 1的ρΗ 7. 4的25mM TRIS、150mM NaCl和0. Tween 20溶液中稀释的抗钙卫蛋 白抗体加入到石英容器中并混合。然后使用包含PH 7.4的25mMTRIS、150mM NaCl和0. 1% Tween 20参比池立即记录340nm单色光的吸收，并每隔一定间隔(例如每2分钟)再次测 定，直至经过大约15分钟。按照运动模式的标准浊度计读数或“终点”读数计算在每个时 间点上的吸收的增加。也就是说，在每个时间点上的吸光率的增加是相对于在加入抗体涂 布的纳米颗粒之前和/或在记录的末尾的读数来计算的。钙卫蛋白曲线是通过使用具有已知钙卫蛋白浓度的标准品进行相同的步骤得到 的。然后可以从该钙卫蛋白曲线计算样品中的钙卫蛋白浓度。实施例5:(a)抗钙卫蛋白抗体涂布的纳米颗粒的制备使用孔径为10. OOOkD的薄膜对购自美国Interfacial Dynamic公司的Iml的 4. 2% w/v氯甲基活化的纳米颗粒(平均直径67nm)相对于水进行透析，然后使用水稀释至 10ml。将27mg精制的卵多克隆抗体抗体(例购自NorwegianAntibodies AS的亲和精制的 卵多克隆抗体)相对于IOmM硼酸盐和15mM氯化钠缓冲溶液进行透析，并最后在相同的ρΗ 9. 0的IOmM硼酸盐和15mM氯化钠溶液中稀释至6ml。在搅拌条件下，将该颗粒与抗体混合，并在室温下持续搅拌24小时。然后加入 40 μ 1的甘氨酸溶液(2Μ，PH 9. 0)，并在室温下进一步搅拌该混合物4小时。然后将该颗粒在加入了 0. 01% Tween 20和3mg/ml卵白蛋白的IOmM硼酸盐、 15mM氯化钠缓冲液中稀释到的IOOml的总体积，并相对于IOOOml所述的加入了 0. 01 % Tween 20和3mg/ml卵白蛋白的硼酸盐/氯化钠缓冲液，使用Pellicon XL过滤器(截 止300，000)和labscale TTF系统(Millipore制造)按照仪器供应商的说明进行透析过 滤，最后将颗粒浓缩至40 IOOml的体积。通过挪威SinteffAS测得所得到的颗粒的平均直径为81nm。(b)使用抗钙卫蛋白抗体涂布的纳米颗粒的钙卫蛋白的检测在ρΗ 8. 0 的 0. 25mM TRIS、0. 15M NaCl 和 0. 1% Tween 中，制备 0. 7mg/ml 的上 述抗钙卫蛋白抗体涂布颗粒的悬浮液。在记录式分光光度计(例如岛津UV-160)的记录石英池中将5 μ 1的取自CVD宿 主的血浆样品溶于检验缓冲液(460 μ 1的25mM TRIS、150mMNaCl、0. 1% Tween、1. 0%聚乙 二醇6000、pH = 7. 4)，并测量560nm单色光的吸光率。60秒后，加入100 μ 1包含0. 7mg/ml 的抗体涂布的纳米颗粒的悬浮液，并在池中混合。在加入抗体涂布的纳米颗粒之前或加入 之后立即记录吸光率，并每隔一定间隔(例如每20秒)再次记录，直至经过大约15分钟。 也就是说，在每个时间点上的吸光率的增加是相对于在加入抗体涂布的纳米颗粒之前和/ 或在记录的末尾的读数来计算的。换句话说，得到在运动模式中的浊度计读数和/或“终 点”读数。钙卫蛋白曲线液是通过使用具有已知钙卫蛋白浓度的标准品进行相同的步骤得 到的。然后可从该曲线计算样品中的钙卫蛋白浓度。实施例6 统计分析
钙卫蛋白及其它用于检测患CVD可能性或患CVD倾向性的标记子的比较已经表明冠状动脉钙化与CVD的出现具有强烈的关联，并且还已经公开了用于预 测CVD可能性(例如心肌梗塞或中风)有用的方法。冠状动脉钙化的程度是使用电子束计算机断层分析(EBCT)定量测定的并且是通 过钙分数(CS)来表示的。一个高的钙分数表示高水平的钙化并且表示导致心血管疾病 (CVD)的高风险。在下面的研究中，对200个年龄在45岁或以上的宿主的CS (100个CS < 100的对 照组和100个CS > 100的病例)进行了测试，同时还测试了他们的钙卫蛋白、CRP和高半 胱氨酸血浆或血清水平。宿主为经本人或医师判断为无症状的个体并且在此前2年内(通 常为6个月之内)进行过EBCT扫描以测量他们的血浆或者血清中的钙卫蛋白、CRP和高半 胱氨酸浓度。方法钙卫蛋白通过Calpreste 测试(意大利Eurospital 发布)测定钙卫蛋白，并且使用标
准偏差、中值、最小值和最大值总结病人和对照组的数据。计算中值的95%置信区间。使用 Anderson-Darling计算进行正态测试。还通过使用相同的概括统计来通过性别概括钙卫蛋白。钙分数(CS)钙分数是通过电子束计算断层分析(EBCT)扫描来测定的。总结了病例和对照组 的数据。高灵敏度的C-反应蛋白(hsCRP)通过DadeBehring的“N高灵敏度CRP”检测法(Roberts等，Clinical Chemistry, 2000,46 :4，第461-468页)测定hsCRP。使用平均、标准偏差、中值、最小值和最大值总结 病人和对照组的数据。高半胱氨酸(Hyc)通过 Abbott IMx 方法(Shipchandler，M. Τ·禾口 Moore Ε. G. , ClinicalChemistry, 1995，41:7，第991-994页)测量血浆高半胱氨酸(Hcy)。使用平均、标准偏差、中值、最小值 和最大值总结病人和对照组的数据。CS和钙卫蛋白、hsCRP、Hcy的比较⑴卡方值使用卡方值测试测量一对标记子之间的协方差。(ii)优势率使用2X2纵横列表(即卡方值桌子)的优势率为两个共变测试的机率对两个不 一致测试的机率的比例。因此，优势率可被解释为两个测试之间的相关幅度的测量。分别计算CS对钙卫蛋白、hsCRP和Hcy的优势率。标记子的中值的比较(i) Mann-Whitney 测试这是用于测试如果两个标记子的值显著不同的无参数(数据不需要为正态分布) 测试。微型表将两组数据中的数据整齐排列，并制订1为最低、200为最高。然后软件将两组等级分相加比较，并报告“P”值，其中“P”值表示随机抽样将导致中值远离试验观测值的几率。钙卫蛋白、hsCRP和Hcy中值与被分成病例和对照组的CS进行比较，并且使用 Mann-Whitney测试法来测量显著性。(ii)钙卫蛋白和钙分数的ROC曲线可以使用宿主操作特性(ROC)曲线分析来衡量该测试区分患病病例与正常病例 的能力。ROC曲线分析被用于钙卫蛋白hsCRP，并作为这两个标记子的比较。使用11截止极限制得ROC曲线以计算灵敏度(Y轴)和1-特异性(X轴)。将对 照组和病例组的数据混合在一起并从高到低进行排序。在总群体和在男性群体上进行分 析。使用梯形规则计算ROC曲线下的面积。结果钙卫蛋白的概括统计图1显示了所测试的全部200个宿主的分布曲线下表1给出了对照组与病例组中的钙卫蛋白的概括统计。对照组中的中值钙卫蛋 白浓度为0. 31mg/L，而在病例组中则为0. 38mg/L。在对照组中，男性的中值钙卫蛋白浓度为0. 31mg/L，而女性的则为0. 30mg/L。在 病例组中男性的中值钙卫蛋白浓度为0. 39mg/L，而女性的则为0. 31mg/L。表1 钙卫蛋白的概括统计 钙分数的概括统计图2显示了所测试的全部200个宿主的分布曲线。下表2给出了对照组与病例组中的EBCT钙分数的概括统计。对照组中的中值钙 分数为0，而在病例组中则为259。在对照组中男性和女性的中值钙分数均为0，而在病例组中则分别为315和256。表2钙分数的概括统计 hsCRP的概括统计图3显示了所测试的全部200个宿主的分布曲线。下表3给出了对照组与病例组中的hsCRP的概括统计。对照组和病例组中的中值 hsCRP均为1. 2mg/L。在对照组中男性和女性的中值hsCRP分别为1. 6mg/L和0. 7mg/L,而 在病例组中则分别为1. 3mg/L和1. lmg/L。表3 :hsCRP的概括统计 Hcy的概括统计图4显示了所测试的全部200个宿主的分布曲线。下表4给出了对照组与病例组中的Hcy的概括统计。对照组中的中值hcy浓度为 7. 5/L，而在病例组中则为8. 5mg/L。在对照组中女性的中值Hcy浓度为7. 15mol/L,男性的 则为8. 55mol/L，而在病例组中则分别为7. 35mol/L和8. 55mol/L。表4 =Hcy的概括统计 钙分数和钙卫蛋白、hsCRP、Hcy之间的比较(i)卡方值测试使用微型表，完成卡方值表(参阅下表5)。该测试对数据组之间所预计的分布 (假定随机分布)与观测的结果进行比较。显著性值是表示数据为非随机性分布的一个尺 度。例如，考虑到数据对钙卫蛋白阳性，则可以预计在钙阳性和阴性之间有一个平均溢出值 (even spilt)(即预计在两个色谱柱中均为30. 5)。然而观测到的分裂为22阴性以及39 阳性，这表明钙卫蛋白阳性趋向于随钙阳性一起变化。微型表提供了这些差异(一致性和不一致性)的显著性的综合度量，并且在这种 情况下P为0. 009。因此，钙随着钙卫蛋白有显著的共同变化。表5 钙卫蛋白与钙分数的卡方值比较 在钙卫蛋白和hsCRP之间进行了类似的比较(参见下表6)。表6 钙卫蛋白与hsCRP (P = 0)的卡方值比较 (ii)优势率可以从表5和6导出优势率，并且给出观测值偏离预测值多远的量度。如果所预 测的一致性数字相成以及除以不一致性预测数字的产品，应该得到数值1。例如从表6中取出数据，例如，预测值的优势率为1 (88. 96X21. 96)/ (50. 04X39. 04) = 1953. 64/1953. 6 = 1。该表中所观测的优势率(100X 33)/(39 X 28) = 3300/1092 = 3.02。优势率越是远离1，则表明共变越明显；优势率为3则是显著的。在对研究中得到的协方差所进行的优势率分析的结果如表7所示。表7:优势率结果的小结 co =截断点(cut off)一个较高的优势率表明在测试之间具有较高的共变程度。从表7可知，对钙卫蛋 白的测试相对于钙分数的具有最高的优势率，因此可以推断在钙卫蛋白、CRP和高半胱氨酸 中钙卫蛋白具有与钙分数的最高协方差。另外，钙卫蛋白相对于另一个CVD标记子CRP得到一个高的优势率。使用微型表的卡方值分析使用与优势率测试相同的截断点对上述数据进行卡方值测试，在钙分数和钙卫蛋 白结果之间显示出显著的(P 0. 009) 一致性。相比之下，CRP测试或高半胱氨酸测试都没 有显示出与钙分数的任何显著的协方差。在钙卫蛋白和CRP之间也发现了显著的一致性(P 0. 000)。比较中值(i) Mann-Whitney 测试图5为钙阳性结果和钙阴性结果之间的钙卫蛋白的分布的点图。两个组的中值为钙阴性0. 310mg/L,钙阳性0. 375mg/L。Mann-Whitney计算得到 钙阴性的行的总和为912，而钙阳性行的总和为1108，从而得到P值为0. 0113。还对上述数据进行Mann-Whitney分析，以测试在高(CS > 100)和低(CS < 100) 钙分数组中各个钙卫蛋白、CRP和高半胱氨酸浓度的中值的显著上升。结果表明在高钙组 中钙卫蛋白和高半胱氨酸浓度的中值显著上升(P分别为0.0112和0. 0037)而CRP在任何 一个组中都没有显示出显著的差异(参见表8)。表8 钙卫蛋白和Hcy中值的比较 (ii) ROC分析和曲线图6和7分别是全部宿主和男性人群的钙卫蛋白和hsCRP的ROC曲线。表9给出 了 ROC曲线下的面积。表9 =ROC曲线下的面积 对钙分数的一致率在假定钙分数> 100为对CVD的高风险的反应时，还在表7中的截断点水平(Hcy Co 12umol)下，对作为对CVD可能性的测试的各个钙卫蛋白、CRP和高半胱氨酸(Hcy)试 验的准确性进行了评价。分析结果如表10所示。表 10 钙卫蛋白对钙的一致率=58. 5%(42+75/200)CRP对钙的一致率=500(25+75/200)高半胱氨酸对钙的一致率=50. 5%(24+77/200)。
2权利要求
一种用于测定含钙卫蛋白体液中的钙卫蛋白的检测方法，所述的方法包括如下步骤(a)获得所述体液的、或者来自所述体液的含钙卫蛋白的液体样品；(b)将所述体液的所述样品与纳米颗粒结合的抗钙卫蛋白抗体或抗体片段接触，以便结合所述的钙卫蛋白；和(c)通过浊度测定法测定钙卫蛋白含量，其中，抗体或抗体片段涂布的纳米颗粒的直径为65～140nm。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗体片段涂布的纳米颗粒的直径为75 120nm。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述纳米颗粒是单分散性的。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(b)和(c)中间加入不透明度的 增强剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述的体液选自血液、血清、血浆、尿液、 脑脊液、口腔液、滑液或脓液。
6.纳米颗粒结合的抗钙卫蛋白抗体或抗体片段在制备用于检测方法的含钙卫蛋白组 合物中的用途，所述检测方法用于诊断选自下述的疾病风湿性疾病、斯耶格伦氏综合症、 眼内炎症、囊性纤维化、急性与慢性肺疾病、肺癌瘤、肺癌、结肠直肠癌、炎性肠病、胃癌、结 肠直肠腺瘤或癌、克隆氏病、溃疡性结肠炎、胃肠粘膜炎、尿路结石、酒精性肝脏病、口腔粘 膜炎性疾病、CNS炎性疾病、HIV感染、HIV感染病人的继发CNS感染、尿路感染、膀胱炎、肾盂 肾炎、内源性后葡萄膜炎、血液疾病、感染性的发热性疾病或非感染性的发热性疾病、CVD、 急性心肌梗塞与分离输血，其中，所述的钙卫蛋白在取自宿主的样品中，并且所述方法包括用权利要求1的方法 检测钙卫蛋白在所述样品中的浓度。
7.钙卫蛋白在制备用于检测方法的含钙卫蛋白组合物中的用途，所述检测方法用于诊 断选自下述的疾病风湿性疾病、斯耶格伦氏综合症、眼内炎症、囊性纤维化、急性与慢性肺 疾病、肺癌瘤、肺癌、结肠直肠癌、炎性肠病、胃癌、结肠直肠腺瘤或癌、克隆氏病、溃疡性结 肠炎、胃肠粘膜炎、尿路结石、酒精性肝脏病、口腔粘膜炎性疾病、CNS炎性疾病、HIV感染、 HIV感染病人的继发CNS感染、尿路感染、膀胱炎、肾盂肾炎、内源性后葡萄膜炎、血液疾病、 感染性的发热性疾病或非感染性的发热性疾病、CVD、急性心肌梗塞与分离输血，其中，所述的钙卫蛋白在取自宿主的样品中，并且所述方法包括用权利要求1的方法 检测钙卫蛋白在所述样品中的浓度。
8.纳米颗粒结合的抗钙卫蛋白抗体或抗体片段在制备用于检测方法的含钙卫蛋白组 合物中的用途，所述检测方法用于检测患CVD可能性或患CVD倾向性，其中所述钙卫蛋白在 取自宿主的样品中，所述方法包括测定在所述样品中的钙卫蛋白浓度。
9.钙卫蛋白在制备用于检测方法的含钙卫蛋白组合物中的用途，所述检测方法用于检 测患CVD可能性或患CVD倾向性，其中所述钙卫蛋白在取自宿主的样品中，所述方法包括测 定在所述样品中的钙卫蛋白浓度。
10.如权利要求6-9中任一项所述的用途，其还包括测定所述样品中CVD第二标记子的 浓度。
11.如权利要求8-10中任一项所述的用途，其中所述CVD为急性心肌梗塞。
全文摘要
本发明涉及心血管疾病的检测。一种在人或者非人类动物宿主中检测CVD可能性和CVD倾向性的检测方法，所述的方法包括检测取自所述宿主含钙卫蛋白样品中的钙卫蛋白的浓度。
文档编号G01N33/68GK101893635SQ20101016737
公开日2010年11月24日 申请日期2003年12月22日 优先权日2002年12月20日
发明者厄林·森德雷黑根 申请人:阿克西斯-希尔德公司