专利名称：高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法
技术领域：
本发明涉及一种高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，尤其涉及均匀、大小厚度可控基质薄膜制备方法，以及样品定量分析方法。本发明的原理基于将能够吸收激光能量的有机分子在恒定高压下压缩成薄膜(Compressed Matrix Thin Film,简称为CMTF)，所制得的基质薄膜既能实现普通方法所得基质吸收激光能量的功能，又能作为疏水薄膜吸附样品分子，而使无机盐原位水洗除去，并且消除样品在靶上的扩散，提高方法的灵敏度。该方法还能处理固体样品，提高了应用范围。
背景技术：
基质辅助激光解析离解质谱是广泛应用的一种分析技术，该技术利用可吸收激光能量的有机小分子基质与样品混合，并将能量传递给样品分子，使之汽化并离子化，再被质量分析器检测。在该技术中，有机小分子基质与样品分子混合模式是关键，因为它直接影响分析结果的准确度、分辨率以及实验结果的重现性和定量分析的能力。现有的技术中，常常采用有机溶剂先溶解基质，再让基质溶液与样品溶液混合，待溶剂挥发后，样品与基质分子形成混晶。现有技术的主要缺点在于很难形成大小均匀，形貌可控的晶体，从而使得激光在不同扫描时间所获得的图谱不具有重现性，信号强度与样品量之间没有定量关系。并且，由于晶体大小和形貌的差异，造成激光轰击样品分子之后所得离子的初速度和方向不同，影响实验结果的分辨率和质量准确度。

发明内容
本发明目的旨在提供一种高压成型基质薄膜(CMTF)辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，具体为将有机小分子基质在高压下压制成均匀、大小厚度可控的薄膜，避免溶剂重结晶过程的不确定性，获得的基质薄膜既能吸收紫外光，又能作为反相疏水层吸附样品分子，而使无机盐被原位水洗除去。同时，本方法提供的疏水表面还能避免样品溶液在样品靶表面的扩散，提高方法的灵敏度。本方法无需有机溶剂重结晶过程，可以处理固体样品，扩大应用范围。本方法所获得的谱图信号稳定，信号强度与样品量之间有良好的线性关系，重现性好，灵敏度高。实现本发明的技术方案:一种高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，该方法将有机小分子基质在高压下压制成薄膜，再将薄膜粘在质谱仪的样品靶上，样品点在薄膜上并自然风干，将样品原位洗涤除去无机盐，自然风干后放入质谱仪进行分析。本发明的技术方案中，所述的有机小分子基质包括:α -氰基-4-羟基肉桂酸(，α -cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA), 2, 5 二轻基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoicacid, DHB)。本发明的 技术方案中，所述的有机小分子基质在高压下压制成薄膜，是将有机小分子基质单独压制成薄膜，或者与固体样品混合后压制成薄膜。
本发明的技术方案中，基质单独压制成薄膜的方法步骤包括:1)、称取基质α -氰基-4-羟基肉桂酸或2，5 二羟基苯甲酸，基质的种类和量根据不同的样品而定；2)、将步骤1)得到的基质用玛瑙研钵磨细，使其颗粒大小小于2 μ m ;3)、将步骤2)得到的基质粉末放入压片机的模具，模具面积50X70mm，再放入压片机，施加4800kg压力，并在此压力下保持I分钟；4)、将步骤3)压制的基质薄膜取出，保存在室温即可。本发明的技术方案中，基质与固体样品混合后压制成薄膜的方法步骤包括:1)、称取基质α -氰基-4-羟基肉桂酸或2，5 二羟基苯甲酸，基质的种类和量据不同的样品而定；称取固体样品；2)、将步骤1)得到的基质和固体样品用玛瑙研钵磨细，使其颗粒大小小于2 μ m，以便使压制得到的基质薄膜大小和厚度均匀；3)、将步骤2)得到的基质和固体样品粉末，按基质与固体样品摩尔比为300: I比例混合，放入压片机的模具，模具面积50 X 70mm,再放入压片机,施加4800kg压力，并在此压力下保持I分钟；4)、将步骤3)压制的薄膜取出，所得薄膜可直接进行激光解析离解质谱分析。本发明的技术方案中，所述的样品原位洗涤除去无机盐的方法是，使用移液器将IOy I或更多浓度0.1wt % TFA(三氟乙酸)水溶液将样品点完全覆盖，保持2秒钟，再用无尘纸吸取样品上的水，样品中所含的无机盐被除去，重复洗2-3次。本发明的高 压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，分析蛋白质样品:取一定量蛋白的酶解液，将样品调至酸性，pH 1-2，使用移液器将I μ I样品点在样品靶，等待其自然风干后，使用移液器将 ο μ I或更多浓度0.lwt%三氟乙酸水溶液将样品点完全覆盖，保持2秒钟，再用无尘纸吸取样品上的水，样品中所含的无机盐被除去，重复洗2-3次，自然风干后放入质谱仪进行分析；所述的蛋白质为α酪蛋白。激光束以一定频率轰击样品分子，由于按照此法制得的样品和基质均匀分布，因此采得的信号稳定，信号绝对强度与样品的量具有良好的线性关系，可以进行定量分析，本发明的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，分析固体样品:将固体样品与基质按照摩尔比为1: 300的比例混合并按照上述的方法制备成薄膜，所得薄膜可直接进行激光解析离解质谱分析；所述的固体样品为α酪蛋白酶解液的冷冻干燥干粉。本发明的效果和优点:1.本发明的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，所得基质薄膜表面均匀，大小厚度可控，操作简单，无需有毒有害试剂，绿色环保。2.整个制备过程简单，容易控制，耗能少，质量稳定，重现性好，并且易于表征，成本低，适合于进行大规模实际生产，便于质量控制和产业化。由于基质辅助激光解析离解质谱是广泛应用的分析技术，因此本发明具有广泛的应用前景。3.与现有基质制备方法相比，本发明无需有机试剂，不仅绿色环保，而且消除了重结晶过程的不确定性。本发明所制得基质薄膜均匀，所获得信号强度稳定，绝对信号强度与样品量之间的良好线性关系，可以进行样品定量分析。
4.样品原位除盐洗脱容易，金属离子加合物干扰小，分析速度快。以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明。


图1-A为实施例1高压成型制备的DHB薄膜图1-B为实施例1高压成型制备的CHCA薄膜图1-C为DHB高压成型薄膜的100倍显微镜1-D为CHCA高压成型薄膜的100倍显微镜1-E为重结晶的DHB的100倍显微镜下1-F为重结晶的CHCA的100倍显微镜图以上图片显示，高压成型基质薄膜表面光滑均匀，而重结晶所获得晶体大小形状不一。下面图2-图5是实施例2所得产物进行样品分析总离子流图。图2是为DHB重结晶法所得总离子流图。图3为DHB高压成型基质薄膜所得总离子流4为CHCA重结晶法所得总离子流5为CHCA高压成型基质薄膜所得总离子流2-图5显示高压成型基质薄膜上所获得信号强度稳定，相对标准偏差小。下面图6-图9是实施例3高压成型基质薄膜原位除盐效果6为α -酪蛋白酶解液在DHB基质的质谱中，箭头所指为钠和钾加合物峰。图7为α -酪蛋白酶解液在DHB基质上原位除盐后所得质谱图由图可见，钠峰和钾峰明显降低。图8为α -酪蛋白酶解液在CHCA基质的质谱中箭头所指为钠和钾加合物峰。图9为α -酪蛋白酶解液在CHCA基质上原位除盐后所得质谱图由图可见，钠峰和钾峰明显降低。图10是实施例4高压成型基质薄膜分析固体样品质谱中:α -酪蛋白酶解液冷冻干粉样品直接与CHCA基质混合后高压成型，然后进行质谱分析，可见所获得质谱图与常规分析法所获得质谱图一致。下面图11-图13是实施例5高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱法的定量分析能力图11是m/zl337多肽的工作曲线图由图可见，线性范围为l.0yg-0.005 μ g，相关系数平方分别为0.7066。.
图12是m/z 1759多肽的工作曲线图由图可见，，线性范围为1.0 μ g-0.005 μ g，相关系数平方为0.8917。图13是m/z2316多肽的工作曲线图由图可见，线 性范围为L O μ g-0.005 μ g，相关系数平方分0.9629。
具体实施例方式实施例1高压成型基质薄膜的制备，制备步骤依次如下:I)、用分析天平称取一定量的基质，比如50mgCHCA(α -cyano-4-hydroxycinnamic acid)和 12mg DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid),基质的种类和量可据不同的样品而定；2)、将步骤I)得到的基质用玛瑙研钵磨细，使其颗粒大小小于2 μ m ;3)、将步骤2)得到的基质粉末放入压片机的磨具，再放入压片机，施加4800kg压力，并在此压力下保持I分钟；4)、将步骤3)压制得基质薄膜(CMTF)取出，保存在室温。其中，步骤4)所得CHCA薄膜的图片如图1_A所示，所得DHB薄膜的图片如图1_B所示，图中显示所得基质薄膜表面光滑，基质均匀。步骤4)所得CHCA薄膜和DHB薄膜在100倍显微镜放大后分别如图1-C和图1-D所示，与结晶法所得CHCA薄膜(图1-E)及DHB薄膜(图1-F)相比，基质分布均匀，而结晶法所得晶体颗粒大小和形状不均。实施例2实施例1制备的高压成型基质薄膜用于样品分析信号强度稳定性I)、将实施例1制备的高压成型基质薄膜粘在样品靶上；2)、将α-酪蛋白酶解液样品调至pH 1_2，使用移液器将I μ I样品点在薄膜上不同的样品点位置，并让其自然风干；3)、取10 μ I浓度0.1wt % TFA水溶液使其覆盖样品点，保持2秒钟，用无尘纸吸掉水珠，重复3次；4)、将样品靶放入质谱仪；5)、使用一定频率的激光轰击样品，使待测样品气化并离子化，并检测其信号强度；其中，步骤5)所获得DHB高压成型基质薄膜总离子流图如图3所示，CHCA高压成型基质薄膜总离子流图如图5所示，与DHB重结晶法所得总离子流图(图2)及CHCA重结晶法所得总离子流图(图4)相比，高压成型基质薄膜法所获得信号强度稳定，相对标准偏差小。表I列出了用不同方法重复测量所获得信号的相对标准偏差，可见高压成型基质薄膜法明显优于结晶法。结晶法由于晶体大小不均，晶体颗粒在靶上的分布不均，不均导致信号强度不均，甚至使激光扫描时不能轰击到样品(如图中箭头所指位置)。
表1.不同方法所获得的相对标准偏差 ^
权利要求
1.一种高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，其特征在于，该方法将有机小分子基质在高压下压制成薄膜，再将薄膜粘在质谱仪的样品靶上，样品点在薄膜上并自然风干，将样品原位洗涤除去无机盐，自然风干后放入质谱仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，其特征在于，所述的有机小分子基质包括:α -氰基-4-羟基肉桂酸或2，5 二羟基苯甲酸。
3.根据权利要求1所述的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，其特征在于，所述的有机小分子基质在高压下压制成薄膜，是将有机小分子基质单独压制成薄膜，或者与固体样品混合后压制成薄膜。
4.根据权利要求3所述的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，其特征在于，基质单独压制成薄膜的方法步骤包括: 1)、称取基质α-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5二羟基苯甲酸，基质的种类和量根据不同的样品而定； 2)、将步骤I)得到的基质用玛瑙研钵磨细，使其颗粒大小小于2μ m ; 3)、将步骤2)得到的基质粉末放入压片机的模具，模具面积50X 70mm，再放入压片机，施加4800kg压力，并在此压力下保持I分钟； 4)、将步骤3)压制的基质薄膜取出，保存在室温即可。
5.根据权利要求3所述的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，其特征在于，基质与固体样品混合后压制成薄膜的方法步骤包括: 1)、称取基质α-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5 二羟基苯甲酸，基质的种类和量据不同的样品而定；称取固体样品； 2)、将步骤I)得到的基质和固体样品用玛瑙研钵磨细，使其颗粒大小小于2μ m ; 3)、将步骤2)得到的基质和固体样品粉末，按基质与固体样品摩尔比为300: I比例混合，放入压片机的模具，模具面积50 X 70mm,再放入压片机,施加4800kg压力，并在此压力下保持I分钟； 4)、将步骤3)压制的薄膜取出，所得薄膜可直接进行激光解析离解质谱分析。
6.根据权利要求1所述的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法，其特征在于，所述的样品原位洗涤除去无机盐的方法是，使用移液器将10 μ I或更多1%三氟乙酸水溶液将样品点完全覆盖，保持2秒钟，再用无尘纸吸取样品上的水，样品中所含的无机盐被除去，重复洗2-3次。
7.权利要求1所述的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法分析蛋白质样品，其特征在于:取一定量蛋白的酶解液，将样品调至酸性，ΡΗ1-2，使用移液器将I μ I样品点在样品靶，等待其自然风干后，使用移液器将10 μ I或更多浓度0.lwt%三氟乙酸水溶液将样品点完全覆盖，保持2秒钟，再用无尘纸吸取样品上的水，样品中所含的无机盐被除去，重复洗2-3次，自然风干后放入质谱仪进行分析；所述的蛋白质为α酪蛋白。
8.权利要求1所述的高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法分析固体样品，其特征在于:将固体样品与基质按照摩尔比为1: 300的比例混合并按照权利要求5所述的方法制备成薄膜，所得薄膜可直接进行激光解析离解质谱分析；所述的固体样品为α酪蛋白酶解液的冷冻干燥干粉。
全文摘要
一种高压成型基质薄膜辅助-激光解析离解质谱定量分析方法。该方法将有机小分子基质在高压下压制成薄膜，再将薄膜粘在质谱仪的样品靶上，样品点在薄膜上并自然风干，将样品原位洗涤除去无机盐，自然风干后放入质谱仪进行分析。本法避免了结晶法所得晶体大小和形状的不均匀性。所得基质薄膜能起到疏水反相固定相的作用，吸附样品分子，而无机盐原位水洗除去，而且能避免样品分子在样品靶表面的扩散，从而提高了灵敏度。本法所得质谱信号稳定，重现性好，金属离子加合物干扰小，谱图背景小，信号强度与样品量呈现良好线性关系，能够进行定量分析。本方法简单，不需要复杂的仪器，无需复杂的样品前处理，无需有机溶剂，绿色环保。
文档编号G01N27/64GK103245717SQ201210029189
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者钟鸿英, 黄璐璐, 肖潇, 郑石 申请人:华中师范大学