专利名称：一种高通量筛选降解秸秆高活力纤维素酶的方法
技术领域：
本发明提供一种高通量筛选降解秸秆高活力纤维素酶的方法，为一种新的纤维素酶筛选方法，属于生物酶检测技术领域。
背景技术：
目前，测定纤维素酶的活性通常使用国际纯化学和应用化学学会(IUPAC)的滤纸酶活测定方法，主要因为该方法重复性好。但是，这种方法也存在操作繁琐，耗时耗力等缺点，而且这种方法只适用于测量小规模的样品，对大规模筛选纤维素酶就不适用了，尤其在筛选可高效降解秸秆的纤维素酶时，传统的测酶活方法就更无能为力了。人们一般利用霉菌生产纤维素酶，因为霉菌可以分泌降解纤维素的纤维素酶。能够产生纤维素酶的霉菌在自然界中大量存在，人们虽然分离出一些菌株，并对这些菌株进行了诱变，但是，还可以从自然界中筛选可以用于工业生产的菌株，或者，对已经分离得到的菌株进行诱变，以得到产高活力纤维素酶的菌株。筛选高产菌株是一个耗时耗力的工作， 如果没有好的筛选方法，很难得到高产的菌株。利用IUPAC的方法，一个一个地测各个菌株的活力，因为工作量太大，在实践中是不可行的。纤维素酶可以降解很多种纤维质物质，比如滤纸、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、 木屑和秸秆等等，国际上通用的测纤维素酶活力的底物是滤纸，利用滤纸做底物具有重现性好的优点，但是，用滤纸做底物测出的酶活高的纤维素酶对其它底物(如秸秆、微晶纤维素)的降解能力却不一定高，这是因为自然界中的纤维质物质的结构各有不同，不同的纤维质的聚合度和结晶度各有不同，另外，纤维素往往会和木质素、半纤维素等物质混杂纠结在一起，这就造成同一纤维素酶对不同的底物具有不同的活性。利用生物基原料生产燃料乙醇是各国进行可再生能源生产的重要措施，我国生产燃料乙醇的主要原料是玉米，近年来，我国提出发展燃料乙醇要不与人争粮、不与粮争地， 所以，利用秸秆生产燃料乙醇是大势所趋。纤维素酶是用秸秆生产乙醇生产过程中的关键用酶，它可以将纤维素水解成葡萄糖，葡萄糖再经过发酵生成乙醇。筛选到能高效降解秸秆的纤维素酶和它的生产菌株是一项非常重要的工作。虽然近年来有一些关于筛选高活力纤维素酶的方法，但是，这些方法要么是针对纤维素酶的某种活力，比如内切酶活力进行筛选，要么是针对滤纸酶活进行筛选，通过这些方法筛选出的高活力酶在水解秸秆时的酶活不一定高。为了克服上述方法的缺点，本发明提出了一种高通量的筛选方法，利用这种方法可以快速地将高活力的纤维素酶筛选出来，经检索未见有公开相关文献报道。

发明内容
本发明公开一种高通量筛选降解秸秆高活力纤维素酶的方法，以秸秆作为底物， 利用96孔板进行高通量筛选，克服了传统的滤纸酶活测定方法操作繁琐，耗时耗力等缺点，适用大规模筛选降解秸秆的纤维素酶检测。
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本发明的高通量筛选降解秸秆高活力纤维素酶的方法，采用如下技术解决方案
1)在磁力搅拌的情况下，向96孔板中每孔加汽爆的秸秆粉悬液，所加的汽爆过的秸秆粉悬液要适量，经试验优选量为10-100 μ L ；
2)将适当稀释纤维素酶加入每孔中，混勻，酶液的量控制在10-40μL ；
3)密封后，恒温浴一段时间，恒温水浴时一定要密封，并且控制温度在40-60°C最优，时间控制在50-70min ；
4)向每孔再加适量DNS，混勻，所加DNS的量要适中，才能保证变色区分明显，线性良好，一般的DNS添加量为100-140 μ L ；
5)密封，一定温度热水浴适当时间，温度控制在90-100°C最优，5-lOmin之后，放入冷水浴；
6)反应后静置一段时间，静止的时间要适中，以利于染色的稳定，实验证明控制在1-2 小时最优；
7)另取一96微孔板，并将反应液取适量加到相应的孔道中并适当稀释，由于其反应体系的容量小，使得在酶解反应和显色反应时的蒸发损失对结果产生较大的影响；因此要采取适当的措施来尽量减少蒸发损失，如将加完样品的微孔板用封膜密封后再盖上一块塑料盖；
8)在适当波长下处测吸光度。测吸光度测定要在还原糖变色后的最大紫外吸收峰处， 约为MOnm。本发明的积极效果在于采取96微孔板法测定降解秸秆粉酶活，在标准FPA方法的基础上，改用秸秆粉为反应底物，建立一种高通量筛选方法，可以简便快速的从大量菌株中选出用于降解秸秆的纤维素酶高产菌株，有利于发现和改造用于工业化生产所需的菌种。


图1为本发明测定霉菌SYZ)(6所产纤维素酶降解秸秆酶活图； 图2本发明测定霉菌里氏木霉ATCC56765和里氏木霉ATCC56764所产纤维素酶降解秸秆酶活图。
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。下述实施例及试验中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1
96微孔板法测定土壤样品中分离出的霉菌iSiTm所产纤维素酶降解秸秆粉酶活 (60 μ L反应体系，所有溶液的配制和稀释都用柠檬酸缓冲液)
(1)在96孔板中每孔加乳40μ L的秸秆粉悬液(在用磁力搅拌的情况下进行)；
(2)然后将20μL的适当稀释纤维素酶液加入每孔中，混勻；
(3)密封后，50°C温浴60min；
(4)向每孔再加120μ L DNS，混勻；
(5)密封，100°C温浴5min后放入冷水浴；(6)反应后静置1-2小时；
(7)另取一96微孔板，并将反应液取100 μ L加到相应的孔道中；
(8)在MOnm处测吸光度；
(9)计算得到酶活为0.2977U/ml,误差范围在5%以内(见图1)。一个活力单位(U)被定义为在测定纤维素酶水解秸秆反应时，每分钟释放1 μ moL 葡萄糖所用酶量。从结果上看，利用96孔板高通量测纤维素酶降解秸秆的活力时，结果平行，误差范围在5%以内，重现性好。实施例2，
96微孔板法测定里氏木霉ATCC56765和里氏木霉ATCC56764所产纤维素酶降解秸秆粉酶活(60 μ L反应体系，所有溶液的配制和稀释都用柠檬酸缓冲液)
(1)在96孔板中每孔加乳40μ L的秸秆粉悬液(在用磁力搅拌的情况下加入)；
(2)选取48个孔，将ATCC56764所产纤维素酶酶液各20μ L的加入每孔中，混勻；将 ATCC56765所产纤维素酶酶液各20 μ L的加入其它的48孔内
(3)密封后，50°C温浴60min；
(4)向每孔再加120μ L DNS，混勻；
(5)密封，100°C温浴5min后放入冷水浴；
(6)反应后静置1小时；
(7)另取一96微孔板，并将反应液取100 μ L加到相应的孔道中并适当稀释；
(8)在MOnm处测吸光度；
(9)计算得到ATCC56765所产纤维素酶平均酶活为0.5357U/ml，误差范围在5%以内。 ATCC56764酶活为0. 2658U/ml,误差范围在5%以内(见图2)。从结果上看，利用96孔板高通量比较两种纤维素酶降解秸秆的活力时，同种酶结果平行，误差范围在5%以内。对两种酶的酶活进行比较，差异显著，重现性好。
权利要求
1. 一种高通量筛选降解秸秆高活力纤维素酶的方法，包括以下步骤1)在磁力搅拌的情况下，向96孔板中每孔加10-100μ L汽爆的秸秆粉悬液；2)将10-40μ L纤维素酶加入每孔中，混勻；3)密封后，40-60°C恒温水浴50-70min；4)向每孔再加100-140μ L的DNS，混勻；5)密封，90-100°C热水浴5-10min之后，放入冷水浴；6)反应后静置1-2小时；7)另取一块96微孔板，并将反应液加到相应的孔道中；8)在适当波长下处测吸光度，测吸光度测定要在还原糖变色后的最大紫外吸收峰处， 约为MOnm。
全文摘要
本发明提供一种高通量筛选降解秸秆高活力纤维素酶的方法，为一种新的纤维素酶筛选方法，采取96微孔板法测定降解秸秆粉酶活，在标准FPA方法的基础上，改用秸秆粉为反应底物，建立一种高通量筛选方法，可以简便快速的从大量菌株中选出用于降解秸秆的纤维素酶高产菌株，有利于发现和改造用于工业化生产所需的菌种。
文档编号G01N21/33GK102212608SQ201110093108
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者任晓冬, 刘艳, 姚栋, 孟庆繁, 李硕, 藤利荣, 逯家辉 申请人:吉林大学