专利名称：对免疫球蛋白治疗时出现的nk细胞调节作用有反应者和无反应者的测定和评估方法
技术领域：
本发明涉及一种对患者在以免疫球蛋白治疗疾病或预防疾病时的反应敏感度的 测试方法。
背景技术：
天然杀伤细胞(NK细胞)是先天免疫和宿主防御系统的组成部分。NK细胞的一种 可能的重要功能是攻击诸如病毒和肿瘤细胞等的入侵者。其机理被认为是基于对较少含有 或不含有主要组织相容性复合体I型MHC的细胞的特别识别，它通常在细胞内在化和蛋白 酶解之后呈现于入侵者特定部分。借助所述特有的NK细胞可以区分受感染的和未受感染 的细胞，以便进行定向攻击。特殊病毒甚至能阻止MHC I型分子的输出，规避所述特定的宿 主防御，但因此成为NK细胞攻击的目标。由人细胞表达的特定HLA等位基因本身和与上述识别特征组合，表明“自己的" 体细胞受到了保护，提供了自我攻击的额外的安全机制。杀伤的非常有效的机制是通过定向NK靶细胞接触介导的。所述NK细胞向所述外 源细胞释放分子。这些分子是从NK细胞颗粒中释放的，因此，这种效应被称作脱颗粒化，释 放储存的效应分子，NK细胞利用所谓的'穿孔素'，它在靶细胞膜或包被上形成通道，导致 靶细胞严重损伤，甚至导致其'死亡'。其他分子参与了这种攻击，支持由其他机制引起的 破坏作用，如蛋白水解，其中，相关的颗粒酶B也是通过NK细胞脱颗粒化释放的。包括细胞 因子在内的所述信号传导化合物的释放，吸引并且激活了其他细胞，导致对入侵者的组合 攻击，并最终下调所述防御反应。这种杀伤力可被用于独特的癌症治疗途径，其中，肿瘤细胞受到攻击并且被NK细 胞破坏。因此，一直在寻找特殊的化合物和干预方法，以便支持NK细胞活性，并且将它们更 专一性地导向肿瘤细胞。NK细胞是宿主防御的重要部分。不过，当出现所述细胞的调节异常时，例如，不同 的疾病原因或疾病病程，它们能够使自己针对"自身结构"，造成显著的病理生理后果，如 攻击器官结构和外周和大脑的少突胶质细胞。尽管导致所述错误导向和自身攻击的机制尚 未完全了解，但这些细胞的恢复控制和将其杀伤力减弱到生理学适当的水平是需要的。由 于杀伤效率与脱颗粒化和效应分子的释放密切相关，目的之一是控制所述脱颗粒化，以便 减弱破坏。因此，目的是鉴定并且使用能够调节NK细胞作用减弱/抑制所述作用和随后损 伤的化合物。免疫球蛋白是免疫系统的天然部分，它能识别包括很多不同化合物、结构和作为 细胞结构部分之结构的靶，以便识别并且通常中和他们的生物学作用。所述免疫复合物被 快速清除，导致'外源'分子的消除。因此，识别、结合和去除功能无疑是非常重要的，它得 到了以下事实的证明缺少(或降低)免疫球蛋白含量的患者容易发生严重的或反复的感 染。除了这种针对入侵者的保护作用之外，免疫球蛋白在平衡和调节免疫系统方面具有重
3要调控作用。一般来自收集的血液或血浆捐赠，并且按照专家公知的方法配制的免疫球蛋 白产品被用于治疗IMID(免疫介导的炎性疾病)和所谓的AID(自身免疫性疾病)，而这些 定义可以表达疾病的一致或部分一致的特征。所述免疫球蛋白浓缩物通常是静脉内(IVIG) 或皮下(SCIG)使用的，不过也可以肌肉内、吸入、眼内、口服或局部使用。静脉内给药免疫球蛋白(IVIG)治疗自身免疫性疾病的效果首次披露于1950年 代，那时，它被用于治疗患有特发性血小板减少性紫癜的患者。与此同时，许多临床研究证 实了 IVIG在治疗自身免疫性疾病方面的有益效果。其中，IVIG治疗在吉兰-巴雷综合征 (GBS)，川崎病，慢性炎性脱髓鞘多神经病，重症肌无力和皮质类固醇_抗性皮肌炎上得到 了证实(Ephrem et al.，2005 ；Kazatchkine and Kaveri, 2001 ；Boroset al.，2005)。另夕卜， 还通过临床研究证实了 IVIG对疾病进程复发率和多发性硬化症(MS)中的MRI加大损伤方 面有积极效果(Sorensen PS, 2003 ；Sorensen et al. ,2002) IVIG作用的全部机制尚不清楚，不过，它似乎引起了 F。受体表达和功能的调节、干 涉补体激活、T-和B-细胞-激活、分化基因和效应基因功能的调节(Ephrem et al.，2005 ； Kazatchkine and Kaveri,2001 ；Boros et al. ,2005)。当IVIG防治被成功应用于很多患者时，其中也包括了对IVIG应用反应较差甚至 无反应的病例。目前，既没有可靠的测试系统解释这种无反应性，也不能预测使用免疫球蛋 白是否会在患者体内产生预期的效力。最近的研究证实，例如，在经常性自发流产病例中， NK细胞数量和活性可以预测流产和正常怀孕，即如果数量/活性高，意味着较差的预后。另 外，发现在体外进行的免疫球蛋白测试的效果与NK细胞杀伤活性水平相关，不过，NK细胞 活性如何受免疫球蛋白以直接或间接的方式影响尚不了解。因此，进一步进行的试验集中 在存在Cr51-标记的细胞系和Cr51释放的条件下的NK杀伤活性方面，以便于根据该参数进 行评估。另外，可以考虑上面提到的指征是否是例如有代表性的IMID(免疫介导的炎性疾 病)指征。Asphalter 等在 Clin Exp Immunol 2000，121，506-514 中披露了对 NK 亚类的体 内IVIG替代治疗和大剂量IVIG(2g/kg体重)的效果。还披露了细胞内NK IFN-γ分析， 其中，细胞内IFN-Y是在IVIG治疗之前和之后(200-400mg/kg，每3周一次)在NK细胞中 测量的。两次分析的至少一次测量是在治疗之后进行的，它不能提供区别有反应者和无反 应者的可能性。Ruiz.等在 Journal ofReproductive Immunology，31 (1996)，125-141 中披露了 IVIG在体外抑制NK活性的免疫学机制，它被添加到NK中，用外周血淋巴细胞作为靶进行了 细胞毒性分析。较少的Cr51释放表明了 NK细胞毒性的减弱。由于Cr与细胞表面非特异性 结合，值得怀疑的是，测量到的放射活性是来自脱颗粒化。Tha-In Thanyalak 等在 Blood，Vol 110，No 9，9. Nov. 2007 中披露了，在存在 IVIG 的条件下成熟了 18小时的树突细胞(DC’ s)及其对天然杀伤(NK)细胞的影响。通过在5 天之后测定Fc- y -RIII的表达检查所述细胞对NK细胞表型的影响。在48小时之后还用 共同培养的IVIG-DC’ s测定了 INF-Y产量和NK细胞的脱颗粒化，并且证实了高含量的干 扰素-Y。最有趣的是，发现用不含DC’ s的IVIG处理的NK细胞的对照样品仅表现出临界 活性。因此，THA-IN得出的结论是，只有IVIG-DC，s能适当激活NK细胞脱颗粒化。另外， 与本申请相比(IVIG-DC’ s没有被本发明使用)，用不同细胞进行的长期分析(48小时和5天)，没有发现可以将以上发现用在以免疫球蛋白治疗疾病时，确定容易对免疫球蛋白做出 响应的患者的证据。另外，不幸的是，唯一可比较的分析(用IVIG处理过的NK细胞)证实 了与本申请相矛盾的结果，没有公开可以进行实质上比较的特定条件(第3257页，左栏， 3-7 行)。Kwak Joanne Y. H.等在 EARLY PREGNANCY, Vol IV,pp 154-164 中研究了 IVIG 治 疗对习惯性流产患者的作用，该患者具有较高NK细胞水平，同时接受其他额外的治疗。发 现NK细胞毒性和⑶16+的表达在IVIG输液治疗之后7天受到明显的抑制。没有发现可以 将以上发现用于确定在治疗疾病时容易对免疫球蛋白做出响应的患者的证据。EP-A-1801234涉及通过使用重组核酸构建体预测受试体是否倾向于得病或产生 自身免疫疾病的诊断方法。所述构建体没有在本申请中使用。Park-Min Kyung-Hyun 等在 IMMUNITY, vol. 26，no. 1，January 2007，pp 67-78 中 披露了涉及IVIG对干扰素-γ的细胞响应的若干研究。这些研究主要是基于对Wisteria monocytogenes和巨噬细胞的观察，它们都不是NK细胞。发明的简要说明本发明的技术问题是提供一种用于分辨对免疫球蛋白给药有反应者和无反应者 的方法。令人吃惊的是，NK细胞在存在免疫球蛋白的情况下，即暴露于IVIG式产物中时， 在体外全血试验系统中受到调控。其中，诱导了 IFN-Y释放和NK细胞脱颗粒化，同时减弱 了其杀伤活性。位于NK细胞的细胞表面上的⑶16 (Fcy RIII)也受到了调控。本发明所涉及到的技术问题，针对使用免疫球蛋白进行疾病治疗或疾病预防时患 者出现的反应，而通过一种测定患者对免疫球蛋白的敏感性的方法来解决。其特征在于，测 定由所述免疫球蛋白所导致的NK细胞的调节作用和自然杀伤细胞的脱颗粒化的数量。术语脱颗粒化为本领域技术人员所熟知，并且具有以下含义通过与质膜融合释 放分泌性颗粒内含物。通常，NK细胞靶(如K562标记过的)细胞是细胞-细胞接触时诱导NK细胞脱颗 粒化所必需的，以便通过从NK细胞颗粒中释放的武器(参见上文)影响靶细胞杀伤。业已 发现，全血接触免疫球蛋白(IVIG)能诱导相当敏感的NK细胞亚类的脱颗粒化，其等同于与 靶细胞发生细胞-细胞接触时的情况(如用K562测量的)或者比之更有效。这会导致颗 粒化合物释放到细胞外空间中。所述细胞外空间可以在分析装置中通过一种介质或溶液模 拟。具体地讲，所述自然杀伤细胞的脱颗粒化量是以体外法确定的，该方法可以由技术人员 建立。例如，全血通过IVIG-培养或安慰剂对照培养若干时间，如大约3小时而刺激的。 然后添加抗-人⑶107a或同种型对照物，并且所述样品与例如大约2 X 105K562靶细胞一起 在大约37°C下培养大约3小时。对照样品在没有靶细胞的条件下培养，以便检测自发性和 IVIG诱导的脱颗粒化。然后，用抗-CD56和抗-CD3单克隆抗体对样品进行染色，随后是检 测步骤，具体是进行流式细胞计量分析。具有阳性NK细胞脱颗粒化的患者，被确定为在接受免疫球蛋白治疗时是对NK细 胞调节敏感型的。根据本发明的一种实施方案，针对使用免疫球蛋白进行疾病治疗或疾病预防时出
5现的反应，测定患者对免疫球蛋白的敏感性，是通过检测转录水平，蛋白水平或同时检测转 录水平和蛋白水平的方式进行的。根据本发明的另一种实施方案，所述转录水平，所述蛋白水平或所述转录水平和 所述蛋白水平是定量测定的。例如，所述转录水平是通过核酸检测方法测定的，如聚合酶链 反应(PCR)和/或所述蛋白水平是使用释放的自然杀伤细胞蛋白和/或在所述自然杀伤细 胞表面上表达的蛋白测定的。根据本发明的另一种实施方案，全血或血细胞是在有或没有免疫球蛋白、在存在 刺激剂的条件下培养的，然后测量选自下列一组的、显示NK细胞调节的活动因子IFN_Y， IP-10, Fc-YlII受体，颗粒酶B，穿孔素或其组合，用于评估免疫球蛋白给药后的个体反应 性。术语“组合”完全按照技术人员的理解，如IFN- γ和IP-10，IFN- γ和F。- γ III受体， IFN- γ和颗粒酶B, IFN- γ和穿孔素；ΙΡ-10和Fc- γ III受体，ΙΡ-10和颗粒酶B, ΙΡ-10和 穿孔素；F。- YlII受体和颗粒酶B，F。- γ III受体和穿孔素；颗粒酶B和穿孔素；IFN- γ和 ΙΡ-10 和 F。-γ III 受体；IFN-γ，ΙΡ-10，颗粒酶 B ;IFN-γ 和 ΙΡ-10 和穿孔素；IFN-γ 和 颗粒酶B和穿孔素；ΙΡ-10和Fe-YlII受体和颗粒酶B ；ΙΡ-10和F。-γ III受体和穿孔素； Fc-YlII受体和颗粒酶B和穿孔素；IFN-γ和ΙΡ-10和F。-γ III受体和颗粒酶B ;ΙΡ_10 和F。- γ III受体和颗粒酶B和穿孔素；IFN- γ和ΙΡ-10和F。- γ III受体和颗粒酶B和穿 孔素。所述测量的活动因子是，例如，转录和/或蛋白表达水平的丰度，特别是所述活动 因子的定量测量。在本发明的一种实施方案中，所述刺激剂选自下列一组脂多糖(LPS)，佛波 醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)，离子霉素，与细胞表面蛋白结合的单克隆抗体(mAbs) 或其组合。尽管术语“组合”对所述技术人员来说完全清楚，但列出的组合举例如下LPS 和PMA，LPS和离子霉素；LPS和与细胞表面蛋白结合的mAbs ；PMA和离子霉素；PMA和与细 胞表面蛋白结合的mAbs ；离子霉素和与细胞表面蛋白结合的mAbs ；LPS和PMA和离子霉素； LPS和离子霉素和与细胞表面蛋白结合的mAbs ；PMA和离子霉素和与细胞表面蛋白结合的 mAbs ；LPS和PMA和离子霉素和与细胞表面蛋白结合的mAbs。通常，用于分析的免疫球蛋白的数量可以在大约0.01-大约100mg/ml，特别是大 约I-大约50mg/ml的范围内变化。大约1-大约50mg/ml的范围为技术人员所熟知，所述技术人员可以理解的该术语 包括端值1和50之间的至少每一个整数，具体如技术人员读到的1-50范围的数字组合1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28， 29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50 ；或 2,3,4,5, 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31， 32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，另外，例如，1，2，3 或 2， 3，5，6和仅通过排列上述范围内的数值而产生的任何其他组合。可以通过本发明的方法获得的结果可用于选自下列一组的疾病的治疗发炎引起 的免疫性疾病，自身免疫性疾病和变态反应。发明的详细说明所述脱颗粒化反应本身可以通过以下方法灵敏地检测
a.)采用细胞重构响应(如表面分子检测)和/或b.)含有化合物的颗粒的释放。作为a.)的例子，已知⑶107a (LAMPl)表面表达是NK细胞脱颗粒化的标记。通过 专家公知的方法测量监测信号(如荧光)的增强，如标记过的抗体，片段或用于流式细胞计 量的亲和配体(如FACS，荧光激活的细胞分选)进行特异性检测，表明了在接触IgG时的脱 颗粒化效力，在实施例1中有更详细地描述。与脱颗粒化相关的任何其他细胞标记的变化 都可用于检测并且定量所述脱颗粒化效力，以及通过IgG接触诱导的状态。所述NK细胞颗 粒(细胞溶解溶酶体)化合物的代表包括蛋白质穿孔素和颗粒酶(后者是蛋白酶，更具体 地讲是颗粒酶B)，例如，它可以通过诸如ELISA或直接酶促试验(用于酶和蛋白酶)等抗原 检测系统进行定量。尽管所披露的反应可用于预测IVIG在体内介导的效应，它构成了与体内(生理学 的)调控相关的重要反应，以及由IVIG应用介导的效应。通过直接免疫球蛋白给药引起控 制不良的NK细胞诱导“耗尽”(NK细胞武器的释放)，可以在一定时间内降低NK细胞杀伤 效力，并因此在调节异常的病理学状态下减弱针对“自身”结构的细胞破坏效力。因此，与 NK细胞相关或由NK的作用造成的病理生理状况，是通过技术人员所公知的IVIG、SCIG和 其他形式给药进行的免疫球蛋白预防和治疗所显示出的。对免疫球蛋白预防和治疗有反应 者/无反应者的鉴定可以通过其他参数、这些参数组合和与其他脱颗粒化分析进行组合来 实现。为此，全血分析，以及对分离细胞的分析均可用于在体内预测免疫球蛋白的效力。对于属于干扰素-Y (IFN- γ )的参数来说，它的mRNA (转录物)是在体外使用全 血或例如NK细胞时诱导的，由所述细胞产生的蛋白水平的增加显示的，IP-IO (CXCLlOJi 于T细胞和NK细胞的化学引诱剂，还包括其他功能)通常是受到IFN-Y控制的，即在增加 时受到后者的刺激。将脂多糖(来自细菌)用于全血分析系统，因此模拟病理-生理学状 态，因此IFN-Y和IP-10都上调mRNA转录物(数量)和蛋白(释放)水平。业已发现，在 存在免疫球蛋白的条件下(用LPS进行刺激)与没有免疫球蛋白的对照样品相比，IP-10 的增加因为使用免疫球蛋白而减少，而对于IFN-Y来说没有发现相关的减少。这种作用 是未预料到的，并且被解释为免疫球蛋白的免疫调节特性的一部分，因此导致了 IFN-Y和 IP-10反应的部分解偶联，它可以被解释为抗炎性反应。相应地，这种作用可被用于离体试 验系统(来自潜在IVIG受治者的全血)用于评估是否可以确定使用IVIG的反应性。另外，该参数可用于与对F。_ Y -受体调控的分析进行组合，作为免疫球蛋白诱导 F。_ Y-R类型III的下调，据报导，它的亚类与炎性反应相关。因此，转录物和蛋白细胞表面 表达的减少会在生理学上引起抗炎副作用。另外，所述参数可以与单一核苷酸多态性(SNP)分析进行组合，如白介素_2受体 (IL-2R)，白介素-7受体(IL7-R)和CD58，表示患者不同的遗传背景。将通过以下实施例对本发明和相应的分析作更详细地说明。实施例1NK细胞脱颗粒化分析(CD107a)方法100 μ 1的人血用100 μ 1分析介质(IMDM，含有10% FCS和青霉素/链霉素)稀 释，并且用IVIG培养至少一次，对于对照样品来说，在没有IVIG的条件下培养一次，所述培养于37°C持续至少3小时。然后添加PE-Cy5缀合的抗-⑶107a mAb或同种型对照物，并且 所述样品与2 X 105K562靶细胞一起在37°C下培养2_3小时。对照样品在没有靶细胞的条件 下培养，以便检测自发的和IVIG诱导的脱颗粒化。然后用FITC-缀合的抗-CD56和PE-缀 合的抗-CD3mAbs对样品进行染色，随后进行流式细胞计量分析。将免疫球蛋白(5%或10% IVIG,Octagam,Octpharma ppGmbH,Vienna,Austria)添力口至Ij全血中，添力口量为 10mg/ml。将 麦芽糖溶液用作含有麦芽糖的IVIG的对照样品。结果NK细胞脱颗粒化的诱导可以通过⑶107a阳性细胞的数量增加得到证实。八个健 康受试者的结果如

图1所示。在所有健康受试者中，都诱导了 NK细胞的脱颗粒化，发现其 作用明显比对照(麦芽糖)更有效。K562细胞被用于评估NK杀伤活性(对照K562细胞 +麦芽糖)。值得注意的是，由IVIG介导的作用比标准Κ562细胞更强。观察到了使用IVIG 和Κ562细胞的组合会产生略微增强的脱颗粒化的倾向。Fc- Y-III-受体(CD16)在NK细胞上的表达为了测量NK细胞上的F。_ γ-III-受体(⑶16)，将ΙΟΟμ 1的IVIg或对照处理的全 血样品(按照例1的方法制备)用PerCP-Cy5. 5-缀合的抗-CD16，PE_Cy7_缀合的抗-CD56 和Pacific Blue-缀合的抗-⑶3进行染色，然后进行流式细胞计量分析。IVIg处理明显减弱了⑶16的表面表达(ρ < 0,005,η = 12，图6Α)。以上数据与 IVIg-介导的⑶16的下调吻合，并且暗示了⑶16由IVIg直接约束。⑶16是在NK细胞的 ⑶56dim群体上表达的，与它们的⑶56toight对应体相比，它们的细胞毒性更大，这表明⑶16 通过IVIg所产生的直接约束造成了所观察到的NK细胞的自发脱颗粒化。与该假设吻合的 是，我们发现IVIg能在⑶56dim/⑶16p°sitive NK细胞群体中特异性诱导⑶107a的外在化(图 6B/C)。实施例2通过IVIG诱导的脱颗粒化导致的颗粒酶B，IFN- γ和穿孔素的释放选择一种已建立的实验方法对培养大约3小时和/或大约24小时之后的全血样 品上清液中的颗粒酶B进行定量分析(通过ELISA测定，Sanquin Reagents, Amsterdam, Netherlands)。颗粒酶B的释放(如上文所述，通过接触IgG诱导)导致了颗粒酶B浓度 的显著提高，如图2所示(3h，n = 6 ；24h η = 8)。IFN- γ和穿孔素的测量是通过对全血培养物的上清液进行ELISA分析进行的，所 述上清液是通过在37°C下培养大约3小时和/或大约24小时之后进行离心得到的。如果 需要，上清液可以在大约-80°C下保存直到分析时用。ELISA是使用商业渠道获得的成套用 具，按照生产商提供的方法进行的(DiaclonhBesancon，France)。对照样品测量除了添加 免疫球蛋白(IgG)不同外其余是在相同条件下进行的。颗粒酶B和穿孔素在全血样品中的测量证实了在接触IgG之后的自发性脱颗粒 化。与⑶107a数据一致，IVIg诱导了颗粒酶B的显著释放(ρ = 0，002 ;n = 12 ；使用SPSS 软件，以Wilcoxon Signed-Rank试验用于统计学分析。小于0. 05的P值被视为显著)。并 且在没有靶细胞的条件下发现了穿孔素更适度的增加(P < 0，005 ；η = 12)。有关穿孔素 的结果如图7所示。实施例3
8
全血刺激和免疫球蛋白在IFN- γ和IP-10水平应用中的影响将来自健康供体(η = 19)的肝素化静脉血收集在7，5ml试管(Sarstedt， Numbrecht, Germany)中。将含有 5% IVIG 或 10 % IVIG 的母液(Octagam, Octapharma, Vienna，Austria)在培养介质中稀释到IVIG的浓度为10mg/ml(分别为1 5,1 10)。 根据免疫球蛋白制剂的配制法，安慰剂溶液以与IVIG相同的方式进行稀释(用介质稀释 1 5 或 1 10)。将脂多糖(LPS，Sigma, St. Louis, USA)稀释到浓度为100ng/ml，以便用于刺激。 将Iml的全血与Iml培养基、或与Iml含有安慰剂的培养基、或与Iml含有10mg/ml IVIG 的培养基一起，在有或没有刺激的条件下在37°C下培养3小时。 信使RNA和cDNA合成是按照标准方法进行的。8. 2 μ 1 mRNA的等份试样用第一链 cDNA合成试剂盒进行逆转录(RAS)，并且用oligo-(dT)作引物，采用生产商推荐的方法以 热循环仪进行合成。在cDNA合成终止之后，将反应混合物稀释到最终体积为500 μ 1并且 在-20°C下保存，直到进行聚合酶链反应(PCR)分析。开发了针对LightCycler(RAS)优化的参数特异性引物，并且从 SEARCH-LCGmbH(Heidelberg, Germany)购买。所述PCR是使用 LightCycler FastStart DNA SybrGreen I成套用具(RAS)按照在所述参数特异性成套用具提供的方法进行的。通过两个持家基因β -肌动蛋白和亲环素B的平均表达将RNA输入标准化。所述 数据是作为每μ 1 cDNA的调节转录物出现的。在IVIG刺激的全血中细胞因子和趋化因子的释放(与安慰剂对比)是在24小
ELISA(Diaclone, Besancon, France) g Luminex (Multiplex)系统 (Bio-Plex, Bio-Rad Labaratories, Hercules, CA, USA) fljfi白勺。为了在37°C下培养3小时之后，测量LPS-刺激的全血中细胞因子和趋化因子的释 放，对所述样品进行离心。马上收集上清液，并且在-80°C下保存。用BD CytometricBead Array kits (人类Thl/Th2细胞因子CBA kit，人类趋化因子CBA kit,均购自BD Biosciences, San Diego, USA)，按照生产商提供的方法测量上清液。结果在18/19健康受试着和14/16MS患者中，IVIG诱导了 IFN-γ基因表达(参见图 3a 和 3b)。图3 IVIG (转录物μ 1)在HD (η = 19)和MS患者(η = 16)中诱导IFN- γ的基 因表达。图4表示在24小时之后IVIG诱导的蛋白(IFN-γ )释放(高灵敏度-ELISA) (η =10)。不过，与不含免疫球蛋白的对照样品(在存在LPS的条件下进行)相比，在存在 IVIG的条件下，IP-10蛋白水平(和转录物数量，未示出)增加量明显较少(n = 6)，消除 了与添加的免疫球蛋白接触时其反应强度的个体差别(图5)。例 4通过51Cr释放分析评估NK细胞毒性全血51Cr释放分析是通过以下方法进行的用分析介质(IMDM，10% FCS和青 霉素/链霉素)稀释血液，带有IVIg的样品或对照样品在大约37°C下培养大约3小时，然
9后分配到V-形底的96孔平板上，并且与51Cr标记的K562靶细胞以不同的血液稀释比例混 合。平板在大约37°C下培养大约4小时，并且收获上清液。在γ计数器中测量51Cr释放。 为了测定NK细胞的绝对数量，以便计算效应物与靶的比例，将200μ 1稀释过的血液样品放 在冰上与PE-缀合的抗-⑶56和PE/Cy-5-缀合的抗-⑶3mAbs —起在冰上培养大约20分 钟。然后添力口 20. 000FITC-缀合的珠粒(Right ReferenceStandard, Bangs Laboratories, Fishers, IN, USA)并且用 FACS 溶胞溶液(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)对血液 样品进行红细胞溶解。稀释的血液样品的NK细胞数量按以下公式计算[NK细胞/μ 1样 品]=[(CD56+/CD3-细胞数量)/ (珠粒数量)]X 100。IVIg处理导致了 NK靶Κ562溶解的显著减少(ρ < 0, 005，η = 10，图8)。对图1,3-8的说明图1 :IVIG刺激全血(WB)之后NK细胞的脱颗粒化(η = 8)。图6 :IVIg对CD16的下调和CD56dim NK细胞的脱颗粒化(A)，在全血中，与IVIg 或与对照样品培养3小时之后，⑶16在⑶56+⑶3_细胞的表面表达(MFI以％计，对照= 100% ), η = 12，(B, C)，在与IVIg(C)或与对照样品⑶一起培养3小时之后在全血中 CD107a在CD56dim和CD56bright NK细胞上的外在化。该图显示了 CD56dim或表达CD107a的 Q356Mght细胞的百分比。图7 在全血中能诱导NK细胞脱颗粒化的IVIg被确定为穿孔素。穿孔素(A)在全 血与IVIg或对照样品一起培养24小时之后释放到上清液中(pg/ml) (η = 12，ρ < 0，005)。图8 :IVIg能减弱NK细胞在全血中的杀伤活性。来自健康个体的全血样品用IVIg 或对照物在大约37°C下处理大约3小时。然后采用对NK细胞敏感的靶细胞K562进行四小 时51Cr释放试验，测定NK细胞活性。该图示出了使用100μ 1全血进行的K562细胞的溶解 (η = 10，ρ < 0，005)。
权利要求
通过测定由免疫球蛋白引起的NK细胞调节作用，从而测定出患者对免疫球蛋白敏感性的一种测试方法，以此反映出使用免疫球蛋白治疗或预防由NK细胞失调引起的疾病时患者所出现的反应。
2.如权利要求1的方法，其中，自然杀伤细胞的脱颗粒化之量是通过体外法测定的。
3.如权利要求1或2的方法，其中，测试得出的自然杀伤细胞脱颗粒化呈阳性的患者， 被确定为对免疫球蛋白治疗敏感型的。
4.如权利要求1-3中任意一项的方法，其中，测定患者对免疫球蛋白的敏感性从而反 映出以免疫球蛋白治疗或预防疾病疾病时患者所出现的反应，这一方法是通过检测转录水 平，蛋白水平或转录水平和蛋白水平来进行的。
5.如权利要求4的方法，其中，所述转录水平，所述蛋白水平或所述转录水平和蛋白水 平是定量测定的。
6.如权利要求1-5中任意一项的方法，其中，转录水平是通过核酸检测法测定的，如聚 合酶链反应(PCR)。
7.如权利要求1-6中任意一项的方法，其中，所述蛋白水平是利用释放的自然杀伤细 胞蛋白和/或在所述自然杀伤细胞表面上表达的蛋白测定出的。
8.如权利要求1-7中任意一项的方法，其中，全血或血细胞是在存在刺激剂的条件下， 其至少一个测试样品存在免疫球蛋白，且至少一个测试样品作为对照而不含免疫球蛋白的 条件下培养的，然后测量表示NK细胞调节作用的因子所进行的表达活动，所述因子选自下 列一组=IFN- γ，IP-10, Fc-YlII受体，颗粒酶B,穿孔素，⑶107a或其组合，以此评估免疫 球蛋白给药后的个体响应。
9.根据权利要求8的方法，其中，所述被测试的活动是所述因子的转录丰度和/或蛋白 表达水平，特别是所述活动的定量测量。
10.根据权利要8或9的方法，其中，所述刺激剂选自下列一组脂多糖(LPS)，佛波 醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)，离子霉素，与细胞表面蛋白结合的mAbs或其组合。
11.根据根据权利要求1-10中任意一项的方法，其中，用于测试的免疫球蛋白量为大 约0. 01-大约100mg/ml，特别是大约1-大约50mg/ml。
12.根据权利要求1-11中任意一项的方法，其中，所述疾病选自下列一组炎性介导的 免疫性疾病，自身免疫性疾病和变态反应。
全文摘要
测定针对免疫球蛋白引起的NK细胞调节作用的患者敏感性的一种测试方法，借助该测试可反映出以免疫球蛋白治疗疾病或预防疾病时患者所出现的反应，其特征在于，针对所说免疫球蛋白引起的天然杀伤细胞的调节作用进行测定。
文档编号G01N33/50GK101910840SQ200980101649
公开日2010年12月8日 申请日期2009年1月9日 优先权日2008年1月9日
发明者于尔根·勒米施, 克里斯蒂安·雅各比, 托马斯·吉泽, 斯特凡·哈格, 斯特凡·莫伊尔 申请人:奥克塔法马有限公司