专利名称：Hla抗体特异性检测微颗粒及试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及免疫检测试剂盒，特别是一种HLA抗体特异性检测微颗粒及试剂盒。

背景技术：
在临床医学上，一些疾病会引发肾脏病变，当病人的肾脏疾病发展到只能依靠透析来维持生命时，则称其为终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)。对于终末期肾病病人，肾移植是一种长期有效的治疗方法。人们在进行器官移植的研究中发现，与移植有关的抗原为HLA-I类和-II类抗原，如表1所示，为目前HLA配型中需要做配型检测五个HLA基因位点的HLA抗原即HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点的HLA抗原(R.Holdsworth，C.K.Hurley，S.G.E.Marsh，M.Lau，H.J.Noreen，J.H.Kempenich，M.Setterholm and M.Maiers，The HLAdictionary 2008a summary of HLA-A，-B，-C，-DRB1/3/4/5，and-DQB1 alleles and theirassociation with serologically defined HLA-A，-B，-C，-DR，and-DQ antigens，Tissue Antigens(73)，95-170，2009))。
表1HLA抗原表(HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点) 由于输血和妊娠等原因，在暴露于异体HLA抗原后，病人体液免疫系统可以产生抗HLA抗体。肾移植初步成功的关键取决于受体血液中是否含有HLA抗体以及HLA抗体的特异性，即如果患者血液中没有可以识别供者HLA抗原的抗体，则更可能移植成功，因此，为了保证移植肾的存活，移植前对受体进行HLA抗体特异性检测，不仅是绝对必要的，而且有助于快速地找到适合的供体肾。准确灵敏的抗体检测分析方法能够预测并杜绝肾移植超急性排斥(hyperacute rejection)的发生，同时也可以显著地降低肾移植术后早期急性排斥(early acuterejection)的发生。
HLA抗体特异性包括针对单一HLA抗原的抗体和针对交叉反应组(cross reactive group，CREG)的抗体。Takemoto等(1994)提出交叉反应组配型的概念，即由于某些HLA抗原氨基酸分子结构相近，HLA抗原分子之间具有公共抗原决定簇，可与同一种HLA抗体发生交叉反应，这些与同一种HLA抗体发生反应的HLA抗原决定簇称为交叉反应组；目前常规检测的I类HLA抗原可归纳为9个交叉反应组，如表2所示，摘自(Glenn E.Rodey，“HLA beyondtearsintroduction to human histocompatibility”，the third and fourth chapters，2nd edition，2000)。
表2交叉反应组类型及各组所包含的抗原

目前人们普遍基于抗体抗原吸附剂测定(ELISA)或流式点阵仪(Luminex)两种检测方法来检查HLA抗体特异性。目前国外主要使用Luminex xMAP微颗粒外裹人工合成的单一HLA抗原，在流式点阵仪上检测HLA抗体的特异性。使用人工合成的单一HLA抗原具有两个缺点，第一，不同的微颗粒表面人工合成抗原浓度很难保持相同，致使反应强度无法一致；第二，人工合成抗原中氨基酸三维折叠形式的细微改变，可以影响抗体对抗原的识别，会减弱抗原抗体反应的灵敏性；只有One Lambda公司的FlowPRA Specific试剂是使用天然HLA抗原包被微颗粒并在流式细胞仪上检测二抗荧光强度，但是其包括的检测底物种类即提供HLA抗原的细胞目录数目太少，难以一次性完成HLA抗体特异性检测，使用者欠灵活性。
发明申请“HLA抗体特异性检测方法及细胞盘与试剂盒”的说明书中公开了一种采用人淋巴细胞上的天然HLA抗原制备而成的细胞盘来检测HLA抗体特异性的方法，其特点是发明人通过调整细胞盘上HLA抗原频率，使细胞盘也能够检测出具有高PRA值的血清标本的HLA抗体特异性，最大限度地克服了抗原重叠现象对HLA检测的限制，集合了天然抗原的优势和流式细胞仪的高灵敏检测特性。由于细胞盘使用人的淋巴细胞进行抗体检测，交叉配型也同样使用人的淋巴细胞进行移植前的最后检测，二者的检测结果的可比性远高于其它抗体检测结果与交叉配型结果的可比性，因而经过细胞盘试剂盒检测、验证的抗体特异性结果可以直接用于虚拟交叉配型，达到准确地指导临床工作的目的。然而，细胞盘试剂盒同时也具有其在制作和使用上的局限性。由于T淋巴细胞上携带I类HLA抗原，B淋巴细胞上既带有I类也带有II类HLA抗原，当仅采用T细胞作为抗原供体时，细胞盘试剂盒只能检测I类抗体，且T细胞只能来自供体的外周血，而不适宜进行人工培养，当制作细胞盘用完一批外周血后，需要由志愿者再次捐献，因而限制这种方法的推广应用；当仅采用B淋巴细胞作为抗原供体时，I类HLA抗原与II类HLA抗原会相互遮蔽反应结果，使人们无法轻易判断阳性结果是在哪一类HLA抗原上发生的；同时采用T淋巴细胞和B淋巴细胞作为抗原供体时，当待测血清中无I类HLA抗体时或者I类HLA抗体水平很低时能够检测出II类HLA抗体特异性，但是仍然无法避免特殊情况下I类HLA抗体对II类HLA抗体的遮蔽作用，同时也会被T淋巴细胞的来源有限而限制这类检测方法的推广应用。另外，做成的细胞盘不易运输和保存，使用起来欠灵活。再有，有些病人的血清中可能含有抗自身非HLA抗原的抗体，这些抗自身非HLA抗原的抗体与正常人淋巴细胞膜上的非HLA抗原蛋白结合后，会干扰或者减弱细胞盘检测的灵敏性和特异性 PRA，指群体反应性抗体，即待测血清与随机供体群中每个供体的HLA抗原进行抗原抗体反应，呈阳性反应的供体数量与该随机供体群内个体总数的比例。

实用新型内容针对上述抗体检测领域存在的问题，本实用新型提供HLA抗体特异性检测微颗粒及试剂盒，能够圆满地完成绝大部分临床病人标本的HLA抗体特异性检测工作，使用起来方便、灵活，易于运输，能够同时分别检测出I类和II类HLA抗体特异性，且供体细胞来源为人工培养的B细胞株，适于推广使用。
HLA抗体特异性检测微颗粒，其特征在于载体颗粒表面包被着来源于一个供体的B淋巴细胞上的I类或II类HLA抗原。
HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，包括外盒、放置于盒内的支架和多个微颗粒管，所述支架上设置有试剂容器槽，所述微颗粒管放置在试剂容器槽中，其特征在于所述微颗粒管中盛有上述微颗粒，不同微颗粒管中的微颗粒上的HLA抗原不同。
所述试剂盒内的微颗粒上的HLA抗原为HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位点下的HLA抗原。
所述微颗粒管为96个，呈阵列式分布。
所述96个微颗粒管为96孔PCR板。
所述试剂容器槽上还放置有盛装荧光标记二抗的标记物管。
所述试剂容器槽上放置有盛装阳性对照血清的阳性对照管和盛装阴性对照血清的阴性对照管，所述阳性对照血清的PRA为100％，阴性对照血清的PRA为0％。
本实用新型一种HLA抗体特异性检测微颗粒，是在载体颗粒上包被了天然HLA抗原，同一个微颗粒上只有来自源于一份B细胞的I类或II类HLA抗原，该微颗粒用于HLA抗体检测时，两类抗原的反应结果分别检查出来，不会互相遮蔽；包被抗原的来源为B淋巴细胞株，B淋巴细胞可人工培养，因此能为包被微颗粒提供源源不断的HLA抗原，便于微颗粒的推广应用；由于包被的HLA抗原来源于B淋巴细胞，需要将I类或II类HLA抗原进行分离纯化，在HLA抗原分离、纯化过程中，同时也弃除了细胞膜上非HLA抗原蛋白，使非特异性反应大幅度降低，从而提高检测的灵敏性和特异性。另外微颗粒上只含有HLA抗原蛋白，贮存时不需要-20℃以下的低温环境，在0-10℃环境贮存即可，利于运输，便于推广应用。再有，微颗粒在检测中操作方便，人们可以根据HLA抗体检测的具体需要选择包被着不同HLA抗原的多种微颗粒同时使用，即为人们提供了灵活多样的底物选择，且易于定量。
本实用新型为了使上述微颗粒得以推广使用，提供一种HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，包括外盒、放置于盒内的支架和多个微颗粒管，所述支架上设置有试剂容器槽，所述微颗粒管放置在试剂容器槽中，其特征在于所述微颗粒管中盛有上述微颗粒，不同微颗粒管中的微颗粒上的HLA抗原不同。本领域技术人员可以根据HLA抗体特异性检测的具体情况和需要，使试剂盒盛装着多种不同的微颗粒和其他检测中需要用到的试剂，为了运输中保证各种试剂及微颗粒管能放置稳妥，在盒内设了支架，各种试剂管或容器放置在支架上相应的试剂容器槽中。
为了更进一步提高上述微颗粒在检测HLA抗体特异性中的实用性，使其可直接用于HLA抗体特异性检测，本实用新型优选设置成试剂盒内所有微颗粒管中的微颗粒上的HLA抗原为HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位点下的HLA抗原。因为，在大多数情况下，检测一份血清的HLA抗体特异性，需要检测到其全面的HLA抗体特异性，如果提供的检测底物即HLA抗原的类型不全面，则无法一次获得血清的全面HLA抗体特异性。因此，本实用新型优选提供可以一次性检测血清的全面的HLA抗体特异性的试剂盒，试剂盒中的各种微颗粒与待测血清同时反应并通过流式细胞仪检测反应结果，对检查结果统计分析后能够一次性获得一份待测血清中I类和II类HLA抗体特异性，提高了本实用新型微颗粒的实用性，真正能够直接用于HLA抗体特异性检测。
本实用新型的试剂盒优选设置96个微颗粒管，微颗粒管呈阵列式排列，便于采用8个吸头或者12个吸头的移液枪，以提高检测工作效率；96个微颗粒管的数量足以盛装来自于60个供体的B淋巴细胞上的I类HLA抗原，34份B淋巴细胞的II类HLA抗原和一份阳性对照微颗粒和一份裸粒。全部94种微颗粒足以覆盖表1所示的五个基因位点下的HLA抗原。如果可盛装的微颗粒种类太少即供体份数太少，则增加了选择合适供体的难度，若包括太多微颗粒管，则增加了检测和分析的工作量，检测效率受到影响。实际操作时，从96个微颗粒管中分别吸取等量微颗粒，移至一个空白96孔PCR板进行抗体标记，96种微颗粒能够在流式细胞仪上一次完成检测，使试剂盒的应用更便捷。
本实用新型试剂盒优选96孔PCR板代替上述96个微颗粒管。96孔PCR板为一体结构，放置、移动都非常方便稳妥。
为了进一步提高本实用新型使用过程中的实用性和便捷度，优选所述试剂容器槽中还放置有标记物管，管内盛装有荧光标记二抗，荧光标记二抗与微颗粒上结合的HLA抗体结合，二抗的荧光强度直接反应抗原抗体反应的结果。更进一步，本实用新型试剂盒中的试剂容器槽中还放置有阳性对照管和阴性对照管，分别盛装了PRA值为100％的阳性对照血清和PRA值为0％的阴性对照血清，进一步提高试剂盒的使用便捷度。在进行HLA抗体检测时，阳性对照血清可以检测微颗粒上包被的HLA抗原是否失效，阴性对照血清可以检测微颗粒的荧光物本底，同时也可以检测其它反应试剂是否有污染。
综上所述，本实用新型微颗粒及试剂盒的优点可概括为1.用于检测HLA抗体特异性的底物为天然的HLA抗原，但是该抗原的直接来源B细胞可以人工培养，因此，可为微颗粒的推广应用提供源源不断的抗原；2.包被在微颗粒上的抗原经过分离及纯化，在一种微颗粒上只有I类或II类HLA抗原，检测结果中两类抗原的反应情况不会互相遮蔽，且都不受非HLA抗原的干扰，又具备天然抗原的优势，因此能提高检测的灵敏性和特异性。3.做成的试剂盒促进了微颗粒的推广使用，可根据检测需要选择在试剂盒中盛装不同种类的HLA抗原的微颗粒，也可是包括表1所示的所有HLA抗原的微颗粒以用于一次性全面检测待测血清的HLA抗体特异性。4.微颗粒仅仅包含抗原，对于贮存温度要求不严格，利于微颗粒及其试剂盒的运输和推广使用。

图1.本实用新型HLA抗体特异性检测微颗粒包被结构示意图 图2.本实用新型试剂盒内部俯视示意图。
图3.本实用新型试剂盒中96个微颗粒管为96孔板的示意图。
其中1-载体颗粒，2-HLA抗原，3-外盒，4-支架，5-试剂容器槽，6-微颗粒管，7-标记物管，8-阳性对照管，9-阴性对照管，10-96孔板。
具体实施方式
如图1所示，本实用新型提供一种HLA抗体特异性检测微颗粒，其特征在于同一粒载体颗粒1表面包被着来源于一个供体的B淋巴细胞上的I类或II类HLA抗原2。由于是在载体颗粒1上包被了天然HLA抗原2，同一个微颗粒上只有来自源于一份B细胞的I类或II类HLA抗原，该微颗粒用于HLA抗体检测时，两类HLA抗原2的反应结果分别检查出来，不会互相遮蔽；包被HLA抗原2的来源B淋巴细胞株可人工培养，因此能为包被微颗粒提供源源不断的HLA抗原2，便于微颗粒的推广应用；由于包被的HLA抗原来源于B淋巴细胞，需要将I类或II类HLA抗原进行分离纯化，在HLA抗原分离、纯化过程中，同时也弃除了细胞膜上非HLA抗原蛋白，使非特异性反应大幅度降低，从而提高检测的灵敏性和特异性。另外微颗粒上只含有HLA抗原蛋白，而不是完整的细胞，贮存时不需要-20℃以下的低温环境，在0-10℃环境贮存即可，利于运输，便于推广应用。再有，微颗粒在检测中操作方便，人们可以根据HLA抗体检测的具体需要选择包被着不同HLA抗原的多种微颗粒同时使用，即为人们提供了灵活多样的底物选择，且易于定量。
如图2、3所示本实用新型为了使上述微颗粒得以推广使用，提供一种HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，包括外盒3、放置于盒内的支架4和多个微颗粒管6，所述支架上设置有试剂容器槽5，所述微颗粒管6放置在试剂容器槽5中，其特征在于所述微颗粒管6中盛有图1所示的微颗粒，不同微颗粒管6中的微颗粒上的HLA抗原不同。本领域技术人员可以根据HLA抗体特异性检测的具体情况和需要，使试剂盒盛装着多种不同的微颗粒种类和其他检测中需要用到的试剂。为了运输中保证各种试剂容器及微颗粒管能放置稳妥，在盒内设了支架4，各种试剂管或容器放置在支架4上相应的试剂容器槽5中。
为了更进一步提高如图1所示的本实用新型微颗粒在检测HLA抗体特异性中的实用性，使其可直接用于检测得出HLA抗体特异性，本实用新型优选设置成试剂盒内所有微颗粒管6中的微颗粒上的HLA抗原2为HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位点下的HLA抗原。因为，在大多数情况下，检测一份血清的HLA抗体特异性，需要检测到其全面的HLA抗体特异性，如果提供的检测底物即HLA抗原2的类型不全面，则无法一次性获得血清的全面HLA抗体特异性。因此，本实用新型优选提供可以一次性检测血清的全面的HLA抗体特异性的试剂盒，试剂盒中的各种微颗粒包被的HLA抗原可以包括表1所示的HLA五个位点下的所有HLA抗原，这些微颗粒与待测血清同时反应并通过流式细胞仪检测反应结果，对检查结果统计分析后能够一次性获得一份待测血清中I类和II类HLA抗体特异性，提高了本实用新型微颗粒的实用性，真正能够直接用于HLA抗体特异性检测。
如图3本实用新型的试剂盒优选设置96个微颗粒管6，微颗粒管6呈阵列式排列，便于采用8个吸头或者12个吸头的移液枪，以提高检测工作效率；96个微颗粒管6的数量足以盛装来自于60个供体的B淋巴细胞上的I类HLA抗原，34份B淋巴细胞的II类HLA抗原和一份阳性对照微颗粒和一份裸粒。全部94种微颗粒足以覆盖表1所示的五个基因位点下的HLA抗原。如果可盛装的微颗粒种类太少即供体份数太少，则增加了选择合适供体的难度，若包括太多微颗粒管6，则增加了检测和分析的工作量，检测效率受到影响。实际操作时，从96个微颗粒管中分别吸取等量微颗粒，移至一个空白96孔反应板进行抗体标记反应，并在流式细胞仪上一次完成检测，使试剂盒的应用更便捷。
本实用新型试剂盒优选96孔PCR板10代替上述96个微颗粒管6。96孔PCR板10为一体结构，放置、移动都非常方便稳妥。
为了进一步提高本实用新型使用过程中的实用性和便捷度，优选所述试剂容器槽5中还放置有标记物管7，管内盛装有荧光标记二抗，荧光标记二抗与微颗粒上结合的HLA抗体结合，二抗的荧光强度直接反应抗原抗体反应的结果。
更进一步，本实用新型试剂盒中的试剂容器槽5中还放置有阳性对照管8和阴性对照管9，分别盛装了PRA值为100％的阳性对照血清和PRA值为0％的阴性对照血清，进一步提高试剂盒的使用便捷度。在进行HLA抗体检测时，阳性对照血清可以检测微颗粒上包被的HLA抗原是否失效，阴性对照血清可以检测微颗粒的荧光物本底，同时也可以检测其它反应试剂是否有污染。
本实用新型试剂盒的使用方法 I类和II类抗体检测方法相同，现以I类抗体检测为例。试剂盒中96种微颗粒分别盛装在96孔PCR板10的96个孔中，其中94个孔中的微颗粒所带有的HLA抗原包括表1所示的五个位点下的全部HLA抗原，统计记录每个孔的位置及其代表的HLA抗原类型。其余2个孔中，一个孔中的微颗粒为裸粒，表面不带有任何HLA抗原，另外一个孔中的微颗粒用于阳性对照。
步骤1.将一个空白96孔板作为对照板，另一个96孔板为检测板。采用12个吸头的移液枪(调为10ul量程)，将本实用新型试剂盒中96孔PCR板中96种微颗粒分别吸入96孔对照板和检测板的相同位置的孔中。
步骤2.在对照板和检测板的一个孔中加入25ul阳性对照血清，在对照板的其余95个孔中加入25ul阴性对照血清，在检测板的其余95个孔中加入25ul待测血清。
步骤3.对照板和检测板都避光置于室温(22℃)培养30分钟。
步骤4.用微颗粒洗涤缓冲液洗板三次。
步骤5.将标记物管中的荧光标记二抗加入到对照板和检测板的每个反应孔中，避光置于室温(22℃)培养30分钟。
步骤6.用微颗粒洗涤缓冲液洗板三次。
步骤7.在每个反应孔内，分别加入100μl微颗粒洗涤缓冲液。
步骤8.将微颗粒从96孔反应板转移到流式细胞仪玻璃管中，继而用流式细胞仪测量荧光强度。
步骤9对照板中每种微颗粒的荧光值为该种微颗粒的荧光本底。检测板中某一种微颗粒的荧光值减去对照板中相同位置的微颗粒的荧光值，便得出该种微颗粒上抗原抗体反应的FITC荧光值。裸粒上的荧光值用于调整各个微颗粒的荧光本底值。分析计算待测血清所对应的94种微颗粒的荧光值，分别归类记录I类和II类HLA抗原的反应结果，通过扣除分析，结合表2所示的交叉反应组，便可找出该份血清的I类抗体特异性，II类抗体特异性可直接通过扣除分析得出。
权利要求1.HLA抗体特异性检测微颗粒，其特征在于载体颗粒表面包被着来源于一个供体的B淋巴细胞上的I类或II类HLA抗原。
2.HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，包括外盒、放置于盒内的支架和多个微颗粒管，所述支架上设置有试剂容器槽，所述微颗粒管放置在试剂容器槽中，其特征在于所述微颗粒管中盛有权利要求1所述的HLA抗体特异性检测微颗粒，不同微颗粒管中的微颗粒上的HLA抗原不同。
3.根据权利要求2所述的HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，其特征在于所述试剂盒内的微颗粒上的HLA抗原为HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位点下的HLA抗原。
4.根据权利要求3所述的HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，其特征在于所述微颗粒管为96个，呈阵列式分布。
5.根据权利要求4所述的HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，其特征在于所述96个微颗粒管为96孔PCR板。
6.根据权利要求2～5任一所述的HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，其特征在于所述试剂容器槽上还放置有盛装荧光标记二抗的标记物管。
7.根据权利要求2～5任一所述的HLA抗体特异性检测微颗粒试剂盒，其特征在于所述试剂容器槽上放置有盛装阳性对照血清的阳性对照管和盛装阴性对照血清的阴性对照管，所述阳性对照血清的PRA为100％，阴性对照血清的PRA为0％。
专利摘要本实用新型“HLA抗体特异性检测微颗粒及试剂盒”，属于抗体检测领域。本实用新型的微颗粒，其特征在于载体颗粒表面包被着来源于一个供体的B淋巴细胞上的I类或II类HLA抗原。可同时分别检测到I类和II类HLA抗体特异性，既具备天然抗原的优势，又避免了两类HLA抗原的反应结果相互遮蔽，HLA抗原的来源为可人工培养的B淋巴细胞。本实用新型中，将盛装各种上述微颗粒的试剂管与其他试剂管装载在一个外盒中，外盒中有一个特定的支架，用于支撑这些试剂管，试剂盒微颗粒上的HLA类型可以包括表1所示的所有HLA抗原，使试剂盒能够一次性全面检测到待测血请的HLA抗体特异性。
文档编号G01N33/533GK201540289SQ20092024644
公开日2010年8月4日 申请日期2009年10月23日 优先权日2009年10月23日
发明者才新, 焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司