专利名称：抗帕金虫的高免血清及制备方法和贝类体内帕金虫的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测贝类体内帕金虫的方法，具体地说，涉及一种抗帕金虫的高免血清及其制备方法，以及间接ELISA(酶联免疫吸附测定法)检测贝类体内帕金虫的方法。
背景技术：
帕金虫(perkinsus marinus)是寄生在贝类体内的一种原生动物，是导致海水养殖贝类病害最常见的病原生物之一。最初于1946年在美洲牡蛎体内发现，而在我国直到1997年才在栉孔扇贝、虾夷扇贝、皱纹盘鲍、菲律宾蛤仔体内检测到帕金虫。帕金虫属于原生动物亚界中的顶复门、帕金虫纲、帕金虫目、帕金虫科、帕金虫属。
Ray的液体巯基醋酸盐培养基检测法(Fluid ThioglycollateMedium，FTM)(A culture technique for the diagnosis of infectionswith Dermocystidium marinum.Mackin，Owen，and Collier，in oyster.Science，1952b，116360-361)是目前广泛应用的帕金虫检测技术。将活贝类样品称重后，取全部或部分软体部，匀浆，放到50mL三角烧瓶中，加入20mL灭菌的液体巯基醋酸盐培养基和100μL氯霉素混匀，然后在培养基表面轻轻覆盖2mL制霉菌素，室温下黑暗培养7天；培养结束后，在1500r/min条件下离心10分钟，去掉上清液，加入20mL、2mol/L的NaOH，60℃恒温消化2-6小时；消化后在1500r/min条件下离心10分钟，去掉上清液；用去离子水10mL溶解，混匀，1500r/min条件下离心10min；如此清洗3次后，样品可以在0.2％的NaN3中冷藏储存。帕金虫计数前，加入1mL的卢哥氏染液，充分混匀，帕金虫被染成黑色。此时在光学显微镜下，清晰可见黑色帕金虫。在液体巯基醋酸盐培养基中，帕金虫只生长而不繁殖，所以可以对贝类体内的帕金虫进行定量。
Dangan和Roberson应用抗体标记和荧光染色技术，发展了一种比液体巯基醋酸盐培养基技术更灵敏的方法(Bindingspecificities of mono-and polyclonal antibodies to the protozoanoyster pathogen Perkinsus marinus.Disease of Aquatic Organism，1993，159-22)，可以将少量的帕金虫检测出来，甚至可以检测环境水体中帕金虫的存在。Fong等提供了一种合成帕金虫DNA探针的方法(Small subunit ribosomal RNA gene sequence of the oysterparasite Perkinsus marinus.Molecule Marine Biology Biotechnology，1993，2346-350)，这一技术具有种的特异性，能够将帕金虫同其他微生物区分开来。这些技术固然精确，但都不如液体巯基醋酸盐培养基方法简便，易于操作，但是液体巯基醋酸盐培养基方法工作量比较大。

发明内容
本发明的目的是提供一种贝类体内帕金虫的快速检测方法。
为完成上述目的，本发明首先提供一种抗帕金虫的高免血清的制备方法，该方法包括帕金虫的培养与纯化步骤，在该步骤中，取出贝类软体部分，研磨，加入液体巯基醋酸盐培养基，在室温黑暗状态下培养1周后，分别使用网目数为30～140的纱绢以网目数由高至低的方式对培养液进行3～4次帕金虫纯化；免疫及分离血清步骤，在该步骤中，将培养液中的帕金虫定量到105～107个/mL，在体重为1.5～2.5千克的雄兔背部采用4～6点注射的方式免疫，共免疫3～5次，免疫间隔为8～12天，在最后一次免疫的7天后采血，分离血清，得到抗帕金虫的高免血清。
在上述制备方法的帕金虫的培养与纯化步骤中，优选使培养液分别通过网目为135、75、40的纱绢进行帕金虫的纯化。
在上述制备方法的免疫及分离血清步骤中，优选将培养液中的帕金虫定量到106个/mL，共免疫5次，免疫间隔为10天。
本发明还提供根据上述制备方法得到的抗帕金虫的高免血清。
根据本发明的方法制备的抗帕金虫的高免血清，可以用于检测贝类体内的帕金虫。
本发明建立的间接ELISA检测方法，首先是在培养和纯化帕金虫，以及制备抗帕金虫的高免血清的基础上进行的。本发明所提供的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法包括(1)取贝类的软体组织，研磨得到匀浆液，加入包被液，将所得混合液加入到酶标反应板的反应孔内，湿盒过夜；(2)用洗涤液洗板；(3)用封闭液封闭，洗涤；(4)加上1∶3000～1∶5000倍稀释的按上述方法制备的抗帕金虫的高免血清，洗涤；(5)加上酶标二抗，洗涤；(6)加显色液，避光显色；(7)终止液终止显色；(8)酶标仪测定OD492值。
在本发明的检测方法中所使用的抗帕金虫的高免血清优选是1∶4000倍稀释的。
在本发明的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法中所使用的试剂分别为包被液pH9～10的碳酸盐缓冲液；封闭液含0.5％脱脂乳的pH7～8的磷酸盐缓冲液；洗涤液含0.05％Tween-20的pH7～8的磷酸盐缓冲液；显色液Na2HPO4溶液、柠檬酸溶液与邻苯二胺的混合液，临用时加H2O2；终止液H2SO4。
在上述贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法中，所使用的阳性对照为经液体巯基醋酸盐培养基培养的已纯化的帕金虫，阴性对照为贝类的组织匀浆液，按1000单位/mL加青霉素和链霉素，无菌过滤得到。
本发明的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法可用于大批量检测贝类体内帕金虫。
本发明的产品优点体现在检测帕金虫的高免血清特异性强、反应效价高；检测时间短，一般15个小时即可检出结果；样品无需无菌化处理；操作简便易行，可以标准化为产品；检测成本低廉，适于推广；可以进行大批量检测，用于流行病学调查。
具体实施例方式
本发明优选采用的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法包括(1)取贝类的软组织，研磨得到匀浆液，加入与该匀浆液等体积的包被液，将所得混合液加入到酶标反应板的反应孔内，加入量100μL/孔，于4℃湿盒过夜；(2)用洗涤液洗板三次，每次震荡洗涤1分钟；(3)用200μL/孔的封闭液封闭，于37℃封闭1小时，洗涤；(4)加上1∶4000倍稀释的由上述方法制得的抗帕金虫的高免血清，100μL/孔，于37℃经1小时，洗涤；(5)加上酶标二抗，100μL/孔，于37℃经1小时，洗涤；(6)加显色液，100μL/孔，于37℃避光显色10分钟；(7)用50μL/孔的终止液终止显色；(8)用酶标仪测定OD492值。
在本发明的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法中所使用的试剂优选分别为包被液pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液；封闭液含0.5％脱脂乳的pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液；洗涤液含0.05％的Tween-20的pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液；显色液将10.3mL的0.2M Na2HPO4溶液和9.7mL的0.1M柠檬酸溶液混合，加上10mg的邻苯二胺，临用时加15μL的30％的H2O2；终止液2M的H2SO4。
以下通过实施例的方式具体说明本发明抗帕金虫的高免血清的制备方法以及使用所制备的抗帕金虫的高免血清间接ELISA检测贝类体内帕金虫的方法。
制备实施例(抗帕金虫的高免血清的制备)帕金虫的培养与纯化取出贝类软体部分，研磨，加入液体巯基醋酸盐培养基，在室温黑暗状态下培养1周后，使培养液分别通过网目为135、75、40的纱绢进行帕金虫的纯化。
免疫及分离血清将培养液中的帕金虫采用液体巯基醋酸盐培养基检测法定量到106个/mL，在2千克左右的新西兰雄兔背部采用6点注射的方式免疫，共免疫5次，免疫间隔为10天，在最后一次免疫的7天后采血，分离血清，得到抗帕金虫的高免血清，备用。
应用实施例(贝类体内帕金虫的间接ELISA检测)取5个贝类样品(样品1～5)进行体内帕金虫检测，每个贝类的处理方法和检测方法相同。从1个贝类体内取1克软体组织，研磨得到约1mL匀浆液，加上1mL碳酸盐缓冲液(pH9.6，0.05M)，将所得混合液加入到聚乙烯酶标反应板的反应孔内，每个样品重复两个孔，100μL/孔，4℃湿盒过夜。
用含0.05％Tween-20的pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液洗板三次，300μL/孔，每次震荡洗涤1分钟，将板甩干。
用含0.5％脱脂乳的pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液封闭反应板，200μL/孔，于37℃经1小时，洗板三次。
用含0.5％脱脂乳的pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液将上述制备实施例得到的抗帕金虫的高免血清进行1∶4000倍稀释，100μL/孔，于37℃经1小时，洗板三次。
加上酶标二抗，100μL/孔，于37℃经1小时，洗板三次。
加上邻苯二胺-过氧化氢显色液，100μL/孔，于37℃避光显色10分钟。
用50μL/孔的2M H2SO4终止液终止显色。
用酶标仪测定OD492值，结果见表1。
对于每一个样品，整个检测过程15小时即可完成。
在同一块酶标板上同时进行空白对照、阳性对照、阴性对照与样品的检测。其中，空白对照是在孔内不加入抗帕金虫的高免血清，阳性对照是使用经液体巯基醋酸盐培养基培养的已纯化的帕金虫，阴性对照是使用贝类的组织匀浆液，按1000单位/mL加青霉素和链霉素，无菌过滤得到。本次实验中空白对照OD492值为0.054，阴性对照OD492值为0.212。
表1 贝类样品的OD492值

帕金虫检测的结果判定根据所得到的OD492值，使用下述公式判定样品中帕金虫的存在(样品OD492值-空白OD492值)/(阴性OD492值-空白OD492值)≥2上述比值大于或等于2者表明样品为阳性，即样品内存在帕金虫。根据本发明实施例的检测方法，当样品OD492值大于或等于0.37时即为阳性。
另外，在根据本发明进行的实验中，空白对照、样品、阳性对照和阴性对照可以在同一酶标板上完成，每块酶标板可在15小时内同时检测至少40个样品，因此可以用很短的时间进行大批量的检测。
权利要求
1.一种抗帕金虫的高免血清的制备方法，该方法包括帕金虫的培养与纯化步骤，在该步骤中，取出贝类软体部分，研磨，加入液体巯基醋酸盐培养基，在室温黑暗状态下培养1周后，分别使用网目数为30～140的纱绢以网目数由高至低的方式对培养液进行3～4次帕金虫纯化；免疫及分离血清步骤，在该步骤中，将培养液中的帕金虫定量到105～107个/mL，在体重为1.5～2.5千克的雄兔背部采用4～6点注射的方式免疫，共免疫3～5次，免疫间隔为8～12天，在最后一次免疫的7天后采血，分离血清，得到抗帕金虫的高免血清。
2.根据权利要求1所述的抗帕金虫的高免血清的制备方法，其中，在帕金虫的培养与纯化步骤中，使培养液分别通过网目为135、75、40的纱绢进行帕金虫的纯化。
3.根据权利要求1所述的抗帕金虫的高免血清的制备方法，其中，在免疫及分离血清步骤中，将培养液中的帕金虫定量到106个/mL，共免疫5次，免疫间隔为10天。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法得到的抗帕金虫的高免血清。
5.贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法，该方法包括(1)取贝类的软体组织，研磨得到匀浆液，加入包被液，将所得混合液加入到酶标反应板的反应孔内，湿盒过夜；(2)用洗涤液洗板；(3)用封闭液封闭，洗涤；(4)加上1∶3000～1∶5000倍稀释的权利要求4所述的抗帕金虫的高免血清，洗涤；(5)加上酶标二抗，洗涤；(6)加显色液，避光显色；(7)用终止液终止显色；(8)用酶标仪测定OD492值。
6.根据权利要求5所述的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法，其中所使用的抗帕金虫的高免血清是1∶4000倍稀释的。
7.根据权利要求5所述的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法，其中所使用的试剂分别为包被液pH9～10的碳酸盐缓冲液；封闭液含0.5％脱脂乳的pH7～8的磷酸盐缓冲液；洗涤液含0.05％Tween-20的pH7～8的磷酸盐缓冲液；显色液Na2HPO4溶液、柠檬酸溶液与邻苯二胺的混合液，临用时加H2O2；终止液H2SO4。
8.根据权利要求5所述的贝类体内帕金虫的间接ELISA检测方法，其中所使用的阳性对照为经液体巯基醋酸盐培养基培养的已纯化的帕金虫，阴性对照为贝类的组织匀浆液，按1000单位/mL加青霉素和链霉素，无菌过滤得到。
全文摘要
本发明提供一种抗帕金虫的高免血清的制备方法，并提供检测贝类体内帕金虫的方法。本发明采用纯化的液体巯基醋酸盐培养基培养并纯化帕金虫，通过免疫制备高免血清，并使用所制备的抗帕金虫的高免血清建立间接ELISA方法检测贝类体内帕金虫。本发明所需仪器设备简单，检测成本低、检测时间短、可以进行大批量样品检测，能够满足有关研究单位、质检部门批量检测贝类体内帕金虫的要求。
文档编号G01N33/547GK1779463SQ200410091370
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者樊景凤, 梁玉波, 宋立超, 张喜昌 申请人:国家海洋环境监测中心