专利名称：基于纳米量子点技术的肝癌早期诊断生物试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及纳米材料、免疫学、分子生物学和蛋白检测技术领域。是将量子点生物探针与肿瘤标记物结合，建立一种简单、灵敏的肿瘤标志物检测技术，使肿瘤标志物临床应用价值得以发挥。
背景技术：
肝癌是我国常见肿瘤之一，由于早期症状不明显和缺乏特异性，发生肿瘤时症状隐蔽而不易察觉。甲种胎儿蛋白(alpha feto protein, AFP)是在胎儿的肝细胞内合成,并释放于血液中的一种特殊蛋白。研究表明原发性肝癌患者对AFP十分敏感，有80-90%血清中的AFP含量明显升高，有77% AFP>500ng/ml (甲胎蛋白的正常值〈20ng/ml)。并且AFP值的升高在大多数的肝癌患者中较临床上能检查到肿瘤要早3-6个月。 检测甲胎蛋白的方法有琼指扩散法、对流泳免疫法、反向血凝法、补体结合法、酶联免疫法等。化学测定方法的关键在于抗原抗体间的特异结合，以及如何将这种特异结合的信号通过一定的技术手段进行增益放大。琼指扩散法灵敏度不高，AFP检出量在l-3mg/L以上，阳性率达75%左右。反向血凝法较琼脂扩散法灵敏度高100-200倍，但需要借助仪器；放射免疫法能检出纳克水平的AFP，原发性肝癌阳性检出率达85%左右，但存在如何处理放射性污染的问题；酶联免疫法虽灵敏，但人为因素常常影响测定的结果。因此，上述方法均不能满足现在临床大量样本的快速、精确测定的要求。用荧光染料分子对细胞进行标记是一种经典的细胞生物学研究方法，而传统的荧光染料自身具有局限性，如激发光谱窄、发射光谱宽、容易光漂白等缺点。纳米量子点(Quantum Dots, QDs)是一种半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒,与传统有机染料相比，量子点具有量子产率高，抗漂白能力强，光化学稳定性良好等优良特性，是一种很有发展潜力的荧光探针。目前合成量子点的方法主要有溶胶-凝胶法、微乳液法、有机相合成法和水相合成法。与其它合成方法相比，水相合成法具有试剂低毒性、廉价、操作简单、重现性好，所制备的量子点生物相容性好等特点成为量子点合成方法中的新宠。

实用新型内容本实用新型提供一种能够快速、准确地检测人血液中的甲胎蛋白含量，早期诊断肝癌的试剂盒，具有实用简便、易贮存、结果直观等优点。本实用新型基于纳米量子点技术的肝癌早期诊断生物试剂盒，包含人血液甲胎蛋白测试生物芯片，以及设置于其外的外壳，所述生物芯片为片状的扇形结构，从圆心角处至弧的次序，依次由贴靠或搭接的条状的样品垫、吸附有CdTe量子点的鼠抗人AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水滤纸组成；其中，所述硝酸纤维素膜在靠近玻璃纤维膜的一侧有一条由甲胎蛋白(AFP)包被而成的检测线或检测蛋白印迹，在靠近吸水滤纸的另一侧有一条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线或对照蛋白印迹；检测线或检测蛋白印迹与对照线或对照蛋白印迹彼此分离、相互分隔。垂直于片状的扇形面观看所述样品垫与玻璃纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形；所述玻璃纤维膜分别与样品垫和硝酸纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形；所述硝酸纤维膜分别与玻璃纤维膜和吸水滤纸相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形；所述吸水滤纸与硝酸纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心 的弧线形。所述吸水滤纸远离硝酸纤维膜一侧的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形。本发明检测肝癌试剂盒具有以下的优点1.不需荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，只需要紫外灯下照射，更适用于现场检测；2.没有放射性同位素、TMB等有害物质或化学物质的参与，更加安全；3.实验结果可以长期保存；4.简单快速，灵敏度高，可单人份操作。对于某些抗原或抗体含量极低的样本，以往利用胶体金检测甲胎蛋白(AFP)试剂盒的颜色变化较浅，很难用肉眼来判断结果，因此灵敏度较低。而量子点本身具有的荧光寿命长和抗光漂白作用好等特点，即保证了我们研发的试剂盒可以获得稳定的检测结果，又可以提高了检测AFP的检测限，同时保证其检测的特异性。设计成扇形的结构，使样品扩散更均匀，呈现的线性明显，无色带区，结果更可靠。
图I荧光量子点的紫外吸收光谱(a)、荧光光谱(b)和透射电镜图(C)；图2CdTe量子点的紫外吸收光谱(a)与荧光光谱(b)以及暗场紫外灯下的照片
(C)；图3为本实用新型试剂盒生物芯片结构示意图。
具体实施方式
本实用新型试剂盒包含人血液甲胎蛋白测试生物芯片，以及设置于其外的外壳。所述生物芯片为片状的扇形结构，按照从圆心角处至弧的次序，依次由条状的样品垫、吸附有CdTe量子点的鼠抗人AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水滤纸搭接而成。其中，所述硝酸纤维素膜在靠近玻璃纤维膜的一端有一条由甲胎蛋白(AFP)包被而成的检测线，在靠近吸水滤纸的另一端有一条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线；所述样品垫与玻璃纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形；所述玻璃纤维膜分别与样品垫和硝酸纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形；所述硝酸纤维膜分别与玻璃纤维膜和吸水滤纸相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形；所述吸水滤纸与硝酸纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形。所述吸水滤纸远离硝酸纤维膜一侧的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形。所述样品垫的材料为吸附纤维层；检测过程检测时将样品液滴加到样品垫上，当样品中含有AFP时，AFP立即与标记好量子点的抗体结合，通过层析作用运动到检测线上，因为样品的AFP已经夺取了抗体的AFP结合位，所以抗体不会和检测带中的抗原结合而继续层析到对照线与二抗连接并在对照线上显现荧光；而如果样品中无AFP时，检测线上的AFP抗原将与抗体反应造成检测线 显色，在蓝光下显示出两条荧光线。如图1、2所示，本发明选用谷胱甘肽(GSH)作为稳定剂，在水溶液中100°C温度下回流2h合成了稳定的CdTe纳米量子点，所合成的CdTe量子点粒径约4nm，分散性较好，量子产率高，荧光吸收峰窄而对称。
权利要求1.基于纳米量子点技术的肝癌早期诊断生物试剂盒，包含人血液甲胎蛋白测试生物芯片，以及设置于其外的外壳，其特征在于 所述生物芯片为片状的扇形结构，从圆心角处至弧的次序，依次由贴靠或搭接的条状的样品垫、吸附有CdTe量子点的鼠抗人AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水滤纸组成； 其中，所述硝酸纤维素膜在靠近玻璃纤维膜的ー侧有一条由甲胎蛋白包被而成的检测线或检测蛋白印迹，在靠近吸水滤纸的另ー侧有一条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线或对照蛋白印迹；检测线或检测蛋白印迹与对照线或对照蛋白印迹彼此分离、相互分隔。
2.按照权利要求1所述基于纳米量子点技术的肝癌早期诊断生物试剂盒，其特征在于 所述样品垫与玻璃纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形； 所述玻璃纤维膜分别与样品垫和硝酸纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形； 所述硝酸纤维膜分别与玻璃纤维膜和吸水滤纸相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形； 所述吸水滤纸与硝酸纤维膜相接触处的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形。
3.按照权利要求1或2所述基于纳米量子点技术的肝癌早期诊断生物试剂盒，其特征在于 所述吸水滤纸远离硝酸纤维膜一侧的边缘为以生物芯片的扇形圆心角为圆心的弧线形。
专利摘要基于纳米量子点技术的肝癌早期诊断生物试剂盒，包含人血液甲胎蛋白测试生物芯片，以及设置于其外的外壳，生物芯片为片状扇形，从圆心角处至弧，依次由贴靠或搭接的条状的样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水滤纸组成；其中，所述硝酸纤维素膜在靠近玻璃纤维膜的一侧有一条由甲胎蛋白包被而成的检测线或检测蛋白印迹，在靠近吸水滤纸的另一侧有一条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线或对照蛋白印迹；检测线或检测蛋白印迹与对照线或对照蛋白印迹彼此分离、相互分隔。本实用新型提供一种能够快速、准确地检测人血液中的甲胎蛋白含量，早期诊断肝癌的试剂盒，具有实用简便、易贮存、结果直观等优点。
文档编号G01N33/577GK202757941SQ20122040550
公开日2013年2月27日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者董微, 董焱, 周新夫, 周巳祺, 于虹, 岳里加, 葛欣, 隋丽丽 申请人:沈阳医学院