专利名称：总血浆fvii/fviia水平作为妊娠女性的先兆子痫的指标的制作方法
技术领域：
本发明涉及血浆因子VII (FVII)在妊娠女性中作为先兆子痫(P-EC)的诊断标志 物的用途。更具体地，本发明涉及确定总血浆FVII蛋白，包括活性FVII(FVIIa)的检测与 正常妊娠中发现的相比是否升高。利用检测FVII和FVIIa是否与组织因子复合的简单免 疫测定法已经发现了来自患有P-EC的女性的血浆样品中的这种升高的FVII。
背景技术：
充分确定在正常妊娠过程中，局部高凝固状态对胎盘止血非常重要。然而，这在 先兆子痫并发症，即一种未知病因的复杂多系统病症的发生中更加意义重大。患有P-EC 的女性中经常观察到小胎盘血栓，这提示除胎盘脉管系统的血栓形成性质外，血栓形成的 患病因素可以导致或促成该病症的发展(Bremme和BlombSck (1996)Gynecol. Obstet. Invest.(妇科和产科研究)11，20- )。血栓形成可以危害胎盘灌注和胎儿生长发育，从而 可能导致胎宫内死亡。因此，在解释P-EC的许多特性方面存在对血管内凝固不断增长的兴 趣(参见例如 Howie 等(1976)Lancet(柳叶刀)2,323-325 ;Howie，(1977)Clin. Obstet. Gynaecol.(临床妇产科学)4，595Hl ；Schjetlin 等(I999)Acta Obstet. Gynecol. Scand. 78,191-197).然而，P_EC的诊断目前通常基于高血压、蛋白尿和其他相关症状的临 床观察，尽管这样的诊断具有缺陷并且不总对分娩时机提供可靠的指导以确保胎儿成活的 最佳机会。虽然其他人以前已经针对P-EC的发展观察了凝固因子，但是0ian等利用一期凝
固测定发现在妊娠末三个月中患有严重P-EC的妊娠女性中的因子VII活性显著低于正常 妊娠组(Br. J. Obstet. Gynaecol.(英国妇产科杂志)(1985)92,511-517)并且严重P-EC和 降低的因子VII活性之间的这些关系已经由Sandset等提出(Ilirombosis Res.(血栓形 成研究)(1989)迪，665-670)。其他人报告了在患有P-EC的妊娠女性中的因子VII水平与 正常妊娠对照相比存在较低的差别或无显著差别(功6丨111这等(1997)C0ll.Antr0p0l.l， 127-137 ；Schjetlein等(1999)同前)。然而，尽管Schjetlin等为其研究使用了 FVII ELISA测定，但是这与本发明人的FVII/FVIIa测定不同；其使用多克隆抗体以进行抗原捕 获和检测二者。而且，较低的FVII仅存在于来自患有P-EC和胎儿生长迟缓的女性的血浆 样品中。Djelmi§等使用Radonja诊断剂。然而，该试剂的灵敏性和精确特异性本发明人不 得而知，并且可能同样与他们使用的FVII ELISA技术不同，所述FVII ELISA技术如上所示 无论是否与组织因子相复合，均主要检测FVII和FVIIa抗原两者。相反，Bremme和Blomback (Gynecol. Obstet. Invest.(妇产科学研究)同前) 报告在生育后6-15个月时具有P-EC早期诊断并在哺乳期结束后至少1个月时进行血液 采样的女性中的血浆因子VII水平升高，但是由ELISA测定检测的特别高水平的FVII仅 存在于来自具有严重P-EC早期诊断的女性的通过该测定测试的13份血浆“剩余”样品 中的3份中，其作为主要用于理解P-EC后发生原发性高血压的危险因素的更广泛研究 的一部分，并且在妊娠过程中没有进行FVII水平的测量。此外，用于被研究的中度和严重P-EC组二者的排除标准不包括这样的病症，如肾病(kidneydisease)、葡萄糖耐受不 良(glucose intolerance)、遗传性高血糖症(hereditaryhyerglycemia)、遗传性高血压 (hereditary Hypertension)禾口临界性高血压(borderline Hypertension),或吸烟(尽管 已知吸烟和凝固激活之间存在联系)。此外，已知在正常妊娠和P-EC女性两者中，止血标志 物在产后5-6周正常化。例如，已经报告了 von Willebrand因子在患有中度和严重P_EC 的女性中增加，但是在产后5周时恢复正常(Deng等(1994)Obstet. Gynecol.(妇产科医 学)M，941-945)。根据来自英国皇家妇产科学院(Royal Collegeof Obstetricians and Gynaecologists,UK)的信息，大多数患有P-EC的女性在分娩后6周内恢复正常。因此，由 Bremme和BlombSck在分娩后更长时间点获得的FVII结果不能推断出关于P-EC发展的临 床相关性。因子VII在血管壁损伤后结合组织因子(TF)并且受蛋白酶裂解活化为FVIIa。在 Ca2+和脂质存在下，TF:FVII FVIIa复合物活化FIX和FX，从而最终导致凝血酶生成和纤维 蛋白凝块形成。TF受到组织因子途径抑制剂(TFPI)的抑制。通过使用结合FVII的抗体从而捕获并检测FVII和FVIIa两者(单独地或与TF 复合)以确定血浆样品中的总FVII蛋白，本发明人现在已经发现在患有P-EC的妊娠末三 个月的妊娠女性的血液中总血浆FVII蛋白与正常妊娠对照中和健康非妊娠的年龄相一致 女性中的总血浆FVII蛋白相比，显著升高。相反，没有观察到FVIIa，TF或TFPI的相似的 变化。因此，升高的总FVII蛋白水平，其高于在正常妊娠中所预期的水平，现在被提议作为 P-EC的有效标志物。发明概述本发明因此提供了一种诊断妊娠女性中P-EC的方法，所述方法包括确定来自所 述女性的血液或血浆样品中的总FVII蛋白(因子VII和因子Vila)与来自无P_EC的年龄 相一致的妊娠女性的可比较样品中的总FVII蛋白水平相比，是否升高。利用血浆样品，发 现妊娠末三个月中的总FVII蛋白的这种测量对通过高血压和蛋白尿诊断的严重P-EC个体 提供高度灵敏性和特异性。严重P-EC被定义为入院时心脏舒张血压> IlOmmHg,或在相隔 4小时的两个或更多个连续时刻> 90mmHg ；和在妊娠第20周后出现的蛋白尿(> 300mg蛋 白/日或尿蛋白/肌酸酐比> 30mg/mmol)。相反，作为对照使用的正常妊娠女性的心脏收 缩/心脏舒张血压低于120/80mmHg且无高血压或蛋白尿史。附图简述

图1 研究的组中的总血浆FVII水平(ng/ml)的分布组1 常规诊断为患有严重 P-EC的妊娠女性；组2 年龄相一致的正常妊娠女性(正常妊娠)和组3 年龄相一致的非 妊娠健康女性(非妊娠)。水平线表示各组的中位数。图2 患有P-EC的女性vs健康非妊娠女性中血浆FVII水平的相对操作特征(ROC) 曲线的曲线下面积(AUC)。图3 患有P-EC的女性vs正常妊娠女性中血浆FVII水平的ROC曲线的AUC。发明详述如上所述，本发明依赖于测量妊娠女性血浆样品中的总FVII蛋白(FVII和 FVIIa)。该测量可以优选采用使用关于结合的抗原的捕获抗体和检测系统的免疫测定形 式，从而确定FVII和FVIIa 二者，无论其是否与TF复合。该免疫测定采取常规酶联免疫吸附(ELISA)测定的形式，例如使用IMUBIND 因子VII ELlSA试剂盒(American Diagnostica Inc.(美国诊断公司)，Mamford，康涅狄格州，美国)，其中抗FVII/FVIIa多 克隆抗体用作捕获抗体且结合FVII和FVIIa的生物素化单克隆抗体用于检测结合的抗原。 应该认识到等价的免疫测定可以与例如识别相同FVII表位的不同的标记的单克隆抗体和 /或不同的捕获抗体(单克隆或多克隆)一起使用。实际上，可以使用任何免疫测定，条件 是它对总FVII抗原提供相同的检测特异性。方便地，捕获抗原可以利用生物素化抗体和在 使用以上所示试剂盒时，加入酶标记的生物素特异性结合配偶体，例如，辣根过氧化物酶标 记的链霉抗生物素来检测。当使用该酶标记的抗体检测时，灵敏性可以通过使用硫酸终止 溶液，例如通过举例示范的0. 5N硫酸来增高。然而，可以使用关于结合的抗原的其他检测 系统，其包括标记第二抗体。可以使用在免疫测定技术中常规使用的任何类型的可检测的 标记物。通过举例，可以备选地使用荧光标记物和化学发光标记物。可以选择使用如上的FVII蛋白测定作为P-EC的初步筛选，随后测量血压和尿蛋 白或尿蛋白/肌酸比。血浆FVII蛋白的测定也可以用于确认通过确定高血压和/或蛋白 尿所指示的P-EC的诊断。以下实施例举例说明本发明并利用如上所示的用于总因子VII蛋白的ELISA测定 试剂盒和测定FVIIa，TF和TFPI的其他ELISA法来进行。
实施例材料和方法受试者南安普敦和西南汉斯地方研究伦理委员会(Southampton and Southffest Hants Local Research Ethics Committee)授予该研究以伦理委员会的批准书。已经从所有参 与者征得知情同意，并记录了各受试者的相关临床详细信息。研究了总共57名年龄相一致 的女性。这些包括健康的非妊娠女性(n = 22 ；平均年龄=四士6. 04)，正常的妊娠女性(η =15 ；平均年龄=30. 4士5. 04)，和患有P-EC的女性(n = 20 ；平均年龄=29. 1 士5. 59)， 其处于妊娠末三个月。如上所述，严重P-EC被定义为入院时心脏舒张血压> IlOmmHg, 或在相隔4小时的两个或更多个连续时刻> 90mmHg ；和在妊娠第20周后出现的蛋白尿 (> 300mg蛋白/日或尿蛋白/肌酸酐比> 30mg/mmol)。健康非妊娠或正常的妊娠女 性(对照组)的心脏收缩/心脏舒张血压低于120/80mmHg且无高血压或蛋白尿史。这 三组共同的排除标准是慢性高血压、凝固障碍(coagulation disturbance)或止血异常 (haemostaticabnormalities)、心血管疾病(cardiovascular diseases)、癌症(cancer)、 糖尿病(diabetes)、肾病和肝病(renal and hepatic diseases)、抗凝血剂或皮质类固醇 治疗、和吸烟。这些女性中没有一人在生育期中患有高血压或在以前的妊娠中患有P-EC。样品采集利用21-号针头将5ml静脉血按9体积血液比1体积抗凝剂溶液的比例采集到装 有3. 8%柠檬酸三钠抗凝剂溶液的真空采血管(Becton-Dickinson)。在根据制造商关于各 测定的说明(American DiagnosticaInc.(美国诊断公司)，Mamford，康涅狄格州，美国) 在1. 5ml Eppendorf管中离心全血后；立即分离血浆样品并保存在_70°C，以用于分批分 析。关于各测定，使用以前未解冻的等分试样。
测量TF依赖因子根据制造商的说明书使用可商购的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒 (IMUBIND !American Diagnostica Inc.(美国诊断公司)，Mamford，康涅狄格州，美 国)来测量血浆中的FVII，FVIIa, TF和TFPI。使用的测定进一步记述如下。血浆-TFTF水平通过IMUBIND TF ELISA测定来确定。将测试样品加入至用捕获抗体 (鼠抗人TF单克隆抗体)预包被的微滴定板的两个孔中。然后，使用特异性识别结合的TF 的生物素化抗体片段来检测TF。链霉抗生物素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)的随后结合完 成抗体酶检测复合物的形成。TMB底物的添加及其随后与HRP的反应产生具有结合的酶的 蓝色溶液。用硫酸终止反应，并在450nm读吸光度。然后在减去来自空白孔的本底值后，从 标准曲线自动计算数值。IMUBIND TF ELISA测定识别TF-apo，TF和TF:FVII复合物。 关于该测定没有观察到来自其他凝血因子或促凝血活性抑制剂的显著干扰。检测下限为约 10pg/ml。测定内和测定间的变异系数分别为4. 5%和7. 5% (American Diagnostica Inc. (美国诊断公司)，Stamford，康涅狄格州，美国)。血浆-FVIIFVII水平利用IMUBIND 因子VII ELlSA试剂盒测量。简言之，IMUBIND FVII ELISA使用抗FVII/FVIIa多克隆抗体作为捕获抗体。稀释的含有FVII/FVIIa的血浆样品 在用抗FVII/FVIIa捕获抗体预包被的微测试孔中温育。用缓冲液洗涤后，利用生物素化抗 FVII单克隆抗体检测免疫捕获的FVII。添加辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素(HRP)完 成抗体酶检测复合物的形成。添加TMB底物及其随后与HRP的反应产生蓝色溶液。通过添加 0. 5M硫酸终止溶液终止反应并提高灵敏性，由此产生黄色。FVII水平通过在450nm处测量 稀释的样品溶液的吸光度和将其与利用已知量FVII产生的标准曲线进行比较来确定。该 测定测量天然FVII和FVIIa以及重组人FVIIa (NovoSeven )。该ELISA还测量与TF复 合的 FVII 和 FVIIa(TF/FVII，TF/FVIIa)。该测定的工作范围是 l_50ng/ml FVII (American Diagnostica Inc.(美国诊断公司)，Mamford，康涅狄格州，美国)。血浆-FVIIaFVIIa水平通过IMUBIND 因子Vila ELISA测定来量化。该测定使用FVIIa的 生物素化酶抑制剂和作为捕获抗体的抗FVII/FVIIa单克隆抗体。含有FVIIa的样品与生 物素化抑制剂一起温育，所述抑制剂与FVIIa而非FVII共价连接。然后将该样品加入至用 FVIIa捕获抗体预包被的微测试孔中。通过使链霉抗生物素缀合的辣根过氧化物酶(HRP) 缀合物与免疫捕获的FVIIa/生物素化抑制剂复合物结合来检测FVIIa。添加TMB底物及其 随后与HRP的反应在存在结合的FVIIa的条件下产生蓝色溶液。通过添加0. 5N硫酸终止 溶液增加灵敏性，由此产生黄色。FVIIa水平通过在450nm处测量样品溶液的吸光度和针 对利用已知量FVIIa形成的标准曲线进行比较来确定。该测定识别天然和重组人FVIIa和 FVIIa/TF复合物。该测定中未检测出显著量的FVII。在进行该测定过程中，FVII不自动 激活FVIIa。该检测下限通过向缺少FVII的血浆的平均光学密度值(n = 15)加上2个标 准差并从标准曲线计算相应的浓度来确定。发现汇集的正常血浆中的FVIIa水平为5+2ng/ ml (American Diagnostica Inc.(美国诊断公司)，Mamford，康涅狄格州，美国)。总血浆-TFPI
总TFPI水平利用IMUBIND 总TFPI ELISA评估。简言之，将测试样品添加至 用捕获抗体预包被的微滴定板的两个孔中。然后利用特异于TFPIKimitz结构域1的生物 素化单克隆抗体检测TFPI。链霉抗生物素缀合的辣根过氧化物酶的随后结合完成抗体酶 检测复合物的形成。添加TMB底物及其随后与HRP的反应产生具有结合的TFPI的蓝色溶 液。用硫酸终止反应，并在450nm处读吸光度。然后在减去来自空白孔的本底值后，从标 准曲线自动计算数值。IMUBIND 总TFPI ELISA测定识别处于复合物和截短形式的 天然和重组人TFPI。关于该测定没有观察到来自其他凝血因子的显著交叉反应性或干扰 (American Diagnostica he.(美国诊断公司)，Mamford，康涅狄格州，美国)。该测定 的检测下限是0. 18ng/ml。关于5ng/ml TFPI的测定内和测定间变异系数分别是6. 5%和 5. 5% (AmericanDiagnostica Inc.(美国诊断公司)，Mamford，康涅狄格州，美国)。统计学分析数据包括在数据库中并通过西格玛统计学(Sigma Stat)软件系统1. O版来分析。 数据非正态分布，且汇总统计学表述为中位数和四分位数间间距(IQR)。两组或更多组之间 的差异通过Mann-Whitney U-检验或通过秩(Ranks)或Dunn方法的Kruskal-Wallis单向 分析评估。认为P <0.05是统计学显著的。可靠性测量利用以下常规公式评估>灵敏性=真阳性/真阳性+假阴性>特异性=真阴性/真阴性+假阳性>阳性预测值=真阳性/真阳性+假阳性>阴性预测值=真阴性/真阴性+假阴性灵敏性和特异性还通过测量相对操作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)和95% 置信区间(Cl)来确定。结果总之，在患有P-EC的女性中的总血浆FVII蛋白水平与在健康、非妊娠或正常的 妊娠女性组中的总血浆FVII蛋白水平相比显著提高。然而，在研究的其他止血因子，即 FVIIa, TF和TFPI中不存在相似的变化。血浆FVII在与健康非妊娠(n = 22 ；中位数=182. 88 ；IQR = 143. 5-270. 52)或正常妊娠组 (n = 15 ；中位数=160. 88 ；IQR = 107. 14-333. 8)相比时，对于患有P-EC的女性血浆FVII 水平显示出更高的中位数和IQR间距(n = 20 ；中位数=482. 63 ；IQR = 418. 28-563. 70)。 这针对健康非妊娠组(P < 0. 001)或正常的妊娠女性组(P < 0. 001)是统计学显著的。结 果的分布显示在图1中。血浆-FVIIa血浆FVIIa水平的中位数和IQR在所研究的三个组；即患有P-EC的女性(n = 20 ； 中位数=4. 34 ；IQR = 3. 28-7. 16)，健康非妊娠(n = 22 ；中位数=4. 51 ；IQR = 3. 45-6. 31) 或正常妊娠组(n = 15 ；中位数=4. 72 ；IQR = 3. 17-5. 31)中没有差异。血浆-TF血浆TF水平在三组针对彼此测试时，不显示出有意义的差异。关于这些组的中位 数和IQR为患有P-EC的女性(n = 20 ；中位数=24. 85 ；IQR = 4. 0-45. 71)，健康非妊娠 组(n = 22 ；中位数=16. 5 ；IQR = 11. 63-26. 71)和正常的妊娠女性组(n = 15 ；中位数=11. 54 ； IQR = 6. 62-17. 04)。血浆-TFPIP-EC和健康非妊娠女性组在与正常的妊娠女性组相比较时，表现出略微更高的 血浆TFPI水平的中位数和IQR间距。然而，在这三组的血浆TFPI水平之间不存在显著差 异。关于这三组的中位数和IQR间距为患有P-EC的女性(n = 20冲位数=36. 17 ；IQR =28. 76-44. 61)，健康非妊娠女性(n = 22 ；中位数=36. 79 ；IQR = 30. 36-45. 48)和正常 的妊娠女性(n = 15 ；中位数=30. 4 ；IQR = 24。检测P-EC中FVII水平的可靠性血浆FVII水平可以以很高的灵敏性(90% )和特异性(80% )在妊娠末三个月时 将患有P-EC的女性与健康非妊娠女性或正常妊娠女性相区分。其他可靠性测量指标包括 真阳性(86% )；假阳性(14% )；真阴性(86% )；假阴性(14% )。因此，阳性预测值和阴 性预测值是86%。利用ROC曲线，血浆FVII水平再次表现出检测P-EC中的灵敏性和特异 性。针对健康非妊娠女性或正常的妊娠女性组的相对操作特征(ROC)曲线的AUC和95%置 信区间(Cl)分别为(0. 94 ；90% CI = 0. 87-1. 0 ;Ρ < 0. 001 ；图 2)和(0. 941 ；90% CI = 0. 88-1. 0 ;Ρ < 0. 001 ；图3)。这些总结在表1中。表1
权利要求
1.一种诊断妊娠女性中先兆子痫(P-EC)的方法，所述方法包括确定来自所述女性的 血液或血浆样品中的总FVII蛋白(因子VII和因子Vila)与来自无P_EC的年龄相一致的 妊娠女性的可比较样品中的总FVII蛋白水平相比是否升高。
2.权利要求1中所述的方法，其中所述样品在妊娠的妊娠末三个月中获得。
3.权利要求1或权利要求2中所述的方法，其中所述样品是血浆样品。
4.权利要求3中所述的方法，所述方法是检测因子VII和因子VIIa是否与组织因子复 合的免疫测定法。
5.权利要求4中所述的方法，所述方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，紧接着所述方法后测量血压和尿蛋白或尿肌酸 /蛋白比。
7.权利要求1-5中任一项所述的方法，所述方法用于确认通过确定高血压和/或蛋白 尿所指示的P-EC诊断。
全文摘要
与正常妊娠中总血浆FVII蛋白相比，妊娠女性中升高的总血浆FVII蛋白，包括活化的FVII(FVIIa)已经被发现是先兆子痫妊娠并发症的指标。
文档编号G01N33/68GK102099686SQ200980128324
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月22日 优先权日2008年5月23日
发明者卢奇·玛丽亚·圣安娜·迪斯, 巴希尔·A·卢瓦里德 申请人:南安普敦大学, 米纳斯吉拉斯联合大学