专利名称：一种体液中17种有毒生物碱的同时检测方法
技术领域：
本发明涉及化学检测领域，特别涉及一种体液中17种有毒生物碱的同时检测方法。
背景技术：
天然结构生物碱是中草药的重要药效成分，也是毒性成分，引发了不少中毒甚至 致死事件。钩吻素子、乌头碱、马钱子碱、士的宁、阿托品、东莨菪碱、秋水仙碱、延胡索乙素、 草乌甲素、毛果芸香碱、毒扁豆碱、茶碱、麻黄碱、八角枫碱、麦角新碱、山梗菜碱和氧化苦参 碱17种生物碱具有一定毒性，如秋水仙碱的小鼠经口 LD5tl低至0. 8mg/kg，而对人来说，口 服l_2mg的乌头碱通常就能致死，成人口服5-10mg 士的宁就会有中毒现象。另外，乌头碱、 马钱子碱、士的宁等生物碱的治疗量和中毒量很接近，因此，因不当治疗、临床用药过量、误 食、蓄意投毒、自杀等原因引起的中毒甚至致死事件时有发生。
液相色谱-质谱联用(liquid chromatography tandem massspectrometry, LC-MS/MS)技术具有液相色谱的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度，并且可以得 到化合物的相对分子质量、特征结构碎片等信息，在定性方面十分可靠，在定量方面， 其多反应监测(MRM)模式能有效地降低背景噪音提高信噪比，大大提高分析的灵敏度 和选择性，在中毒样品的痕量分析方面具有很大的优势。近年来，国内外对体液中有 毒生物碱检测的研究较多(Y. Jiang, J. Wang, Y. W. Wang, H. Li，J. P. Fawcett, J. K，Gu, J. Chromatogr B 850 (2007) 564-568 ；W. Y. Weng, H. N. Xu, J. M. Huang, G. Q. Wang, T. Shen, J. F. Zhang, J. Chromatogra. B 816 (2005)315-320 ；P. H. Qiu, X. H Chen, X. Chen, L. Lin, C. C. Ai, J. Chromatogr. B875 (2008) 471-477 ；M. Hayashida, H. Hayakawa, K. Wada, T. Yamada, M. Nihira, Y. Ohno, Legal Medicine, 2003 (5) :S101_104.)，但是，大部分的研究只限于对某 一种或来源相同的某几种有毒生物碱的检测，对来源不同的多种有毒生物碱的检测研究较 少，且覆盖的种类范围不广，无法应对中毒事故发生时快速筛查的需求。此外，在中毒事件 发生后，胃液也是一种常见的检测样品，但是对胃液中有毒生物碱成分的检测研究几乎未 见报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种检测范围广、快速、同时 检测、灵敏度高的体液中17种有毒生物碱的同时检测方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一种体液中17种有毒生物碱的同时检测方法，包括下述步骤(1)对体液进行碱化处理；所述体液包括血液和胃液；(2)对碱化处理后的体液进行液液萃取，得到前处理后的体液；(3)采用高效液相色谱_质谱联用仪对前处理后的体液进行分离、检测；(4)定性分析当体液中出现两组定性离子对与表1中某种组分的一致时，可初步判断该体液中含有该组分；然后用标准溶液做对比，如果体液和标准溶液中的保留时间和 两组定性离子对的响应值比例一致时，即可确认体液中含有该组分；表1标准的17种有毒生物碱的定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量和保 留时间 (5)定量分析当体液中测得组分的浓度在表2所述的线性范围之内时，按照线性 方程计算该组分浓度；当体液中测得组分的浓度在线性范围之外时，将体液稀释至线性范 围以内再按照线性方程计算该组分浓度。表2 :17种有毒生物碱的线性方程、线性范围、相关系数。 步骤1中，所述碱化处理是采用硼酸缓冲液和/或NaOH水溶液进行处理，调节样 品的PH值为9。当体液为血液时，用硼酸缓冲溶液进行碱化处理；当体液为胃液时，先用氢 氧化钠溶液调节至中性后再用硼酸缓冲溶液进行碱化处理。步骤2中，所述液液萃取是先后采用氯仿、氯仿_乙醚混合溶剂提取样品，然后将 有机层取出并合并，在水浴下氮气吹干、用甲醇定容、过滤，得到前处理后的体液。步骤3中，液相色谱分析条件为流动相0. 2%甲酸水溶液(A)+甲醇⑶；流速 0. 6mL/min ；梯度洗脱程序0 Imin 28% 34% B，1 6min34 % 35% B，6 7min 35% 62% B，7 IOmin 62% 70% B。步骤3中，质谱分析条件为电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式 (MRM)，干燥气温度350°C，干燥气流速10L/min，雾化气压力40psi，毛细管电压4000V。本发明与现有技术相比具有如下优点和效果(1)本发明的方法涵盖范围广，覆盖了常见的17种有毒生物碱，在中毒事件发生 后能一次性对中毒者的血液、胃液进行毒物筛查，弥补了逐一筛查费时费力的不足。(2)本发明通过液液萃取，各组分的回收率高，重复性好，经过处理后的样品色谱峰少，对质谱离子源、毛细管柱、八级杆等部件污染少。(3)本发明采用液相色谱-质谱联用技术进行定性、定量分析，各组分色谱峰分离 效果好，分析时间短，选择性好，灵敏度高、稳定可靠，适用于中毒样品中有毒生物碱成分的 筛查和法医毒物分析，能为医院抢救和公安局侦查工作提供技术支持。


图1为优化色谱和质谱分析条件后所得的17种有毒生物碱LC-MS/MS分析色谱 图。(图中各色谱峰依次为1.八角枫碱(Anabasine)2.毛果芸香碱(Pilocarpine) 3.氧 化苦参碱(0xymatrine)4.麦角新碱(Ergometrine) 5.东直菪碱(Scopolamine) 6.毒扁豆 碱(Eserine)7.麻黄碱(Epherdrine)8.马钱子碱(Brucine)9. 士的宁(Strychnine) 10. 茶碱(Theophylline) 11.阿托品(Atropine) 12.钩吻素子(Koumine) 13.延胡索乙素 (Tetrahydropalmatine) 14.山梗菜碱(Lobeline) 15.乌头碱(Aconitine) 16.草乌甲素 (Bulleyaconitine) 17. fC/K'flljM (Colchicine))图2为实施例1中血液样品的MRM色谱图(图中A为乌头碱)。图3为实施例2中血液样品的MRM色谱图(其中A为排查17种有毒生物碱的MRM 色谱图，B为提取出秋水仙碱的MRM色谱图，1为秋水仙碱)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。1、对血液和胃液样品进行碱化处理 (1)血液取血液样品0. 5mL,加入lmLpH 9的硼酸缓冲液，充分混勻。(2)胃液取胃液0. 5mL,加入30 i L lmol/L NaOH水溶液，充分混勻，加入 lmLpH ^ 9的硼酸缓冲液，充分混勻。2、对碱化处理后的血液、胃液进行液液萃取加入6mL氯仿，涡流5min，4500r/min离心lOmin，取有机层；向水层中加入6mL氯 仿-乙醚(2 l，v/v)混合溶剂，涡流5min，4500r/min离心lOmin，取有机层，再向水层中 加入6mL氯仿-乙醚(2 1，v/v)混合溶剂，重复提取一次，合并有机层，55°C水浴下氮气 吹至干，甲醇定容至lmL，过0. 22 y m微孔滤膜，得到前处理后的血液和胃液，取5 y L进行 LC-MS/MS 分析。3、高效液相色谱_质谱联用分析采用安捷伦公司的Agilent 1200 RRLC高分离度快速液相色谱仪、Agilent 6410 Triple Quad三重四极杆质谱仪进行样品分析，使用UltimateXB_C18 (4. 6 X 250mm，5 y m) 反相色谱柱进行分离。色谱和质谱分析条件如下色谱分析条件流动相0. 2%甲酸水溶液(A)+甲醇(B)；流速0. 6mL/min ；梯度 洗脱程序0 lmin 28% 34%B，1 6min 34% 35% B，6 7min 35% 62%B，7 lOmin 62% 70% B。质谱分析条件电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式(MRM)，干燥气 温度350°C，干燥气流速10L/min，雾化气压力40psi，毛细管电压4000V。4、定性分析当样品中某种有毒生物碱的保留时间、定性离子对以及两组定性离
9子对的响应值比例与标准品的一致时即可确认该成分。在上述质谱分析条件下用各组分的标准溶液进行子离子扫描，在各组分的碎片离 子中选择响应较好的两组离子对作为定性离子对，选择其中响应较好的一组作为定量离子 对，优化各离子对的碎裂电压和碰撞能量以得到最佳的相应值。在上述优化的色谱和质谱 分析条件下，17种有毒生物碱的定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量和保留时间 如表1所示。表117种有毒生物碱的定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量和保留时间 5、制作各组分的标准曲线，用外标法进行定量计算取空白血液或尿液0. 5mL,加入100 u L相应浓度的混合标准溶液，经上述碱化、提 取操作，在上述色谱分离和质谱分析条件下测定17种有毒生物碱的线性方程、线性范围、 相关系数，其结果如表2所示。当样品中测得组分的浓度在线性范围之内时，按照线性方程 计算样品浓度；当样品中测得组分的浓度在线性范围之外时，将样品稀释至线性范围以内 再按照线性方程计算样品浓度。表2 :17种有毒生物碱的线性方程、线性范围、相关系数。
11 实施例1某县公安局送来死者血液一份，要求进行毒物分析。死者生前服用自制药酒后不 治身亡。用上述所建方法分析，根据表1中所列17种有毒生物碱的定性离子对排查这17 种有毒生物碱，发现乌头碱的两组定性离子对。与标准溶液的谱图对比，发现保留时间和定 性离子对响应比例均一致，确认血液中含有乌头碱，根据表2所列中乌头碱的线性方程计 算得到样品中乌头碱的含量为107. 0 μ g/L(如图2所示)，据此可判断为乌头碱中毒致死。实施例2某医院送来病人血液一份，要求进行毒物分析。病人服用自制草药后出现腹部持 续疼痛，腹泻，呕吐，四肢无力等症状。用上述所建方法分析，根据表1中所列17种有毒生物 碱的定性离子对排查这17种有毒生物碱，发现秋水仙碱的两组定性离子对。与标准溶液的 谱图对比，发现保留时间和定性离子对响应比例均一致，确认血液中含有乌头碱，根据表2 所列中秋水仙碱的线性方程计算得到样品中秋水仙碱的含量为17. 9 μ g/L(如图3所示)， 据此可判断为秋水仙碱中毒。
权利要求
一种体液中17种有毒生物碱的同时检测方法，其特征在于包括下述步骤(1)对体液进行碱化处理；所述体液包括血液和胃液；(2)对碱化处理后的体液进行液液萃取，得到前处理后的体液；(3)采用高效液相色谱-质谱联用仪对前处理后的体液进行分离、检测；(4)定性分析当体液中出现两组定性离子对与表1所述的某种组分的一致时，可初步判断该体液中含有该组分；然后用标准溶液做对比，如果体液和标准溶液中的保留时间和两组定性离子对的响应值比例一致时，即可确认体液中含有该组分；表1标准的17种有毒生物碱的定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量和保留时间(5)定量分析当体液中测得组分的浓度在表2所述的线性范围之内时，按照线性方程计算该组分浓度；当体液中测得组分的浓度在线性范围之外时，将体液稀释至线性范围以内再按照线性方程计算该组分浓度；表217种有毒生物碱的线性方程、线性范围、相关系数
2.根据权利要求1所述的体液中17种有毒生物碱的同时检测方法，其特征在于步骤 1中，所述碱化处理是采用硼酸缓冲液和/或NaOH水溶液进行处理，调节样品的ρΗ值为9。
3.根据权利要求1所述的体液中17种有毒生物碱的同时检测方法，其特征在于步骤 2中，所述液液萃取是先后采用氯仿、氯仿-乙醚混合溶剂提取样品，然后将有机层取出并 合并，在水浴下氮气吹干、用甲醇定容、过滤，得到前处理后的体液。
4.根据权利要求1所述的体液中17种有毒生物碱的同时检测方法，其特征在于步骤 3中，液相色谱分析条件为流动相0. 2%甲酸水溶液(A)+甲醇⑶；流速0.6mL/min ；梯 度洗脱程序0 Imin 28% 34% B，1 6min 34% 35% B，6 7min 35% 62% B， 7 IOmin 62% 70% B。
5.根据权利要求1所述的体液中17种有毒生物碱的同时检测方法，其特征在于步骤 3中，质谱分析条件为电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测模式，干燥气温度350°C， 干燥气流速10L/min，雾化气压力40psi，毛细管电压4000V。
全文摘要
本发明公开了一种采用高效液相色谱-质谱联用技术对体液中17种有毒生物碱进行同时检测的方法。该方法是将体液经过碱化处理、液液萃取、用C18反相色谱柱进行分离后采用高效液相色谱-质谱联用仪在多反应监测模式下进行检测，然后进行定性和定量分析。本发明涵盖范围广，覆盖了常见的17种有毒生物碱，在中毒事件发生后能一次性对中毒者的血液、胃液进行毒物筛查，弥补了逐一筛查费时费力的不足。
文档编号G01N30/06GK101871918SQ20101017134
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者吴惠勤, 熊小婷 申请人:中科院广州化学有限公司;广东省测试分析研究所