专利名称：一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝 集方法。
背景技术：
特定血清型流感病毒感染、感染后恢复、隐性感染、以及疫苗接种的人或动 物，在其体液(如血清、支气管灌洗液、血浆、组织液等)中会出现流感病毒血凝素抗 体，通过检测特定血清型流感病毒的抗体，可以判断、诊断或确诊该人或该动物是否感 染(包括早期感染、隐性感染或感染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感 病毒疫苗、或评价其对特定血清型流感病毒的抵抗力等。
目前检测待检样品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗体的方法，主要有 血凝抑制实验(HAI)和中和实验，即将某一特定血清型的流感病毒先与待检样品混合， 然后加入红细胞或敏感细胞中，判断待检样品是否能够抑制该病毒的血凝反应或细胞病 变效应来进行判定，其缺点是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隐患。在涉及病 毒的实验中，根据国家有关法规(国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》、卫 生部《人间传染的病原微生物名录》、《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验 活动生物安全审批管理办法》)及WHO的规定与建议，包括人H2N2以及部分禽流感病 毒的操作要求在BSL-III (P3)实验室进行，因此，上述方法的开展对实验室条件要求很 高，不适用于现场检测和规模检测。文献也有报道，利用表达流感病毒HA的假病毒颗 粒来代替具有感染性的流感病毒进行HAI实验，但技术过于复杂。
上述方法的缺点还在于只能检测流感病毒HA的抗体。流感病毒表面主要存在 着2种抗原性较强的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神经氨酸酶NA，当流感病毒感染或隐 性感染或接种疫苗后，人或动物的机体会针对HA和NA都产生抗体，正是如此，流感病 毒中的甲型流感病毒根据HA的抗原性分为Hl H16等16个亚型，NA的抗原性分为 Nl N9等9个亚型，在甲型流感病毒中根据HA和NA亚型的不同组合方式形成了众多 亚型，如H5N1 (即H5亚型与Nl亚型组合)。因此，如检测流感病毒抗体，除需检测 HA血清型外，还需要对NA血清型进行检测。而目前对NA血清型抗体的检测则需要另 行通过神经氨酸酶酶活抑制的方法进行检测。
除经典的HAI和中和实验外，也有用ELISA方法和乳胶凝集实验方法来进行检 测的报道。ELISA和乳胶凝集的优势在于可以检测HA和NA的抗体。其中，ELISA方 法是利用重组表达和纯化的流感病毒HA和/或NA来检测相应的抗体，这需要获保持抗 原特异性的重组蛋白的表达与纯化，且由于流感病毒有众多亚型，即使同种亚型的血清 交叉反应强度不一，对不同血清型的HA和NA抗原都进行重组蛋白的表达与纯化，其工 作量大、工艺要求高、批间稳定性差。乳胶凝集方法相对于现有的其它方法(HAI、中 和实验以及ELISA方法)而言，反应时间短、适合现场检测，但仍存在一些不足。乳胶 凝集实验方法是将重组表达和纯化的流感病毒HA和/或NA蛋白偶联在惰性乳胶颗粒表面，利用凝集反应进行检测流感病毒相应的抗体，这同样需要重组表达和纯化的流感病 毒HA和NA，并需要获得保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，如需要检测不同血 清型的流感病毒HA和NA抗体，就需要对不同毒株的HA和NA进行重组表达和纯化， 与ELISA方法一样，存在工作量大、工艺要求高、批间稳定性差等问题。
由于检测流感病毒抗体对人或该动物是否感染(包括早期感染、隐性感染或感 染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感病毒疫苗、或评价其对特定血清 型流感病毒的抵抗力等有重要意义，而目前的HAI、中和实验、ELISA以及乳胶凝集 等检测手段，或需要使用具有感染性的病毒，或需要特定的实验条件和设备，或工艺复 杂，或检测耗时长等缺点，因此，一种简便、快速、工艺相对简单易控的，可以同时检 测流感病毒HA和NA抗体检测方法具有广泛的应用价值。
使用重组表达流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的真核细胞为凝集反应 基质，利用凝集反应，检测待检样品中是否存在相应流感病毒的抗体，这一方法相对于 上述传统方法而言，可以更安全更快速的检测流感病毒抗体。但由于该方法存在通量受 限、细胞消耗量大的缺点，因此，需要一种适合高通量检测、细胞用量更少、简便、快 速、工艺相对简单易控、可以同时检测流感病毒HA和NA抗体检测方法。发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中用于检测流感病毒抗体中存在的细胞消耗量 大、工艺复杂、检测耗时长、通量受限等缺点，提供一种简便、快速、细胞用量少、适 合高通量检测的用于检测流感病毒抗体的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明是将流感病毒血凝素基因和神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞，使真 核细胞表面重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，对重组表达细胞进行荧光标 记，该细胞表面的重组表达的血凝素和神经氨酸酶蛋白与待测样品的流感病毒血凝素抗 体和神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反应，荧光检测分析，根据荧光面积是否增加来判 定待测样品中是否存在流感病毒抗体。
作为一种优选方案，所述荧光标记为荧光素、荧光蛋白或其它能够发出荧光的 物质；所述荧光检测分析所用的设备为荧光显微镜、荧光光度计或多功能微孔板检测 仪。
利用RT-PCR克隆特定血清型流感病毒的HA和NA基因或其片段，构建真核表 达载体，转染真核细胞，细胞表面会存在重组表达的HA和NA，经醛化固定后，该细胞 即成为表面含有HA和NA抗原的致敏颗粒。该细胞在转染时可同时转染编码荧光蛋白 (绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白 等在激发光下可发射荧光的蛋白或多肽或突变体)的核酸，则该细胞即可被荧光标记。 荧光标记也可以使用荧光物质，如CFSE、SYTO> Cy3、Cy5、FITC等，对细胞进行标 记。荧光标记后的细胞与待检样品在微量凝集板中混合后，如待检样品中含有流感病毒 的抗体，即会在数分钟发生凝集反应，在荧光显微镜下可以清晰观察和判断出是否出现 凝集。同时也可经拍照成像后用图像分析软件，如Image Pro Plus等对各孔荧光面积进行 分析，利用细胞出现凝集后不易沉淀因而荧光免疫较大而判断是否出现凝集。
具体地，本发明采用的技术方案如下
将重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞，或重组表达神经氨酸酶(NA)的 真核细胞，或同时表达有HA和NA的真核细胞，或单独重组表达HA和NA的真核细胞 混合物，用荧光物质进行标记，荧光标记后的细胞与待检样品在微量凝集板中混合后， 如待检样品中含有流感病毒的抗体，即会在数分钟发生凝集反应，在荧光显微镜下可以 清晰观察和判断出是否出现凝集。同时也可经拍照成像后用图像分析软件，如Image Pro Plus等对各孔荧光面积进行分析，利用细胞出现凝集后不易沉淀因而荧光免疫较大而判 断是否出现凝集。如出现凝集，表明检测待检样品中是否存在相应流感病毒的抗体。
作为一种优选方案，所述重组表达为瞬时表达或稳定表达。
流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感病 毒的HA可以分为16个亚型、NA可以分为9个亚型，同时，由于流感病毒HA和NA的突 变和进化，即使是同一亚型的HA和NA，其交叉反应性的强弱不一。因此，检测某一特 定血清型流感病毒抗体时，使用本发明的方法，将重组表达该特定血清型毒株的HA的真 核细胞与待检样品进行凝集实验即可。上述的流感病毒HA，是指甲型流感病毒的HI、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 亚 型，以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的血凝素，可以根据检测目的的需要使用某一特 定血清型的HA或其部分。上述的流感病毒NA，是指甲型流感病毒的Ni、N2、N3、 N4、N5、N6、N7、N8、N9亚型以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的神经氨酸酶。上 述的重组表达流感病毒HA和NA可以是上述不同HA和NA的任一组合方式。
作为一种优选方案，所述流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体为tgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一种或几种的混合物。
如是进行较广泛血清型的流感病毒抗体检测，则可以根据所检测的目的血清型 毒株的HA和NA进行抗原性分析，选用抗原性保守或抗原交叉性强的HA和NA蛋白的 一部分进行重组表达真核细胞的构建，利用凝集反应对较广泛血清型的流感病毒抗体检 测。上述的流感病毒HA和NA，可以是某一流感病毒毒株HA和NA或其中一部分， 也可以是不同流感病毒毒株的HA和NA或其中一部分或不同HA和NA的拼接或混合， 也可以是对流感病毒HA和NA进行了突变和修饰，也可以是人工合成的天然不存在的序 列，但其核心是重组表达产物具有流感病毒HA和NA的抗原性。
上述的重组表达流感病毒HA和NA的真核细胞，是指将编码有流感病毒HA和 NA的基因片段导入真核细胞，在真核细胞表面重组表达流感病毒的HA和NA。真核细 胞可以是酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞，以及其它的真核细胞，重组表达的流感病毒 HA和NA位于细胞膜或细胞壁表面。其中，真核细胞优选哺乳动物细胞和昆虫细胞， 其重组表达的流感病毒血凝素可以有更为接近病毒感染人或动物所获得翻译后修饰、空 间构型和抗原性，其与流感病毒相应抗体的反应特异性更佳。进一步，优选哺乳动物细 胞重组表达流感病毒HA和NA。重组表达可以是瞬时表达，也可以是稳定表达。编码 有流感病毒HA和NA的基因片段可以是DNA，也可以是RNA，可以是单纯的含有启动 子和编码序列的片段，也可以是质粒，也可以是病毒载体，其可以仅编码流感病毒HA和 NA,也可以同时或独立混合编码其它蛋白或多肽或肽段，其目的是将编码流感病毒HA 和NA的基因片段在真核细胞中获得重组表达。导入真核细胞的方式可以使用电击、脂质体转染、病毒介导等，目的是将编码流感病毒HA和NA的基因片段进入真核细胞以得 到重组表达。上述的重组表达HA和NA的真核细胞，其核心在于获得在细胞表面表达 有流感病毒HA和NA的真核细胞，且该细胞被荧光物质进行了荧光标记，其目的是利用 荧光，可以高通量地以较少的细胞量，即可通过凝集实验检测流感病毒抗体。在本发明 的实施方案中，公布了荧光标记的重组表达流感病毒HA和NA的真核细胞的方法。
本发明检测方法所用的真核细胞为酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞或其它真核 细胞，重组表达的流感病毒血凝素位于细胞膜或细胞壁表面。使用真核细胞进行重组表 达的目的是活的具有翻译后修饰(如糖基化等)的流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白或其 部分肽段，以更好的与流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体或两者之一发生识别、结 合和凝集，获得更好的亲和性和特异性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法不涉及具有感染性的病毒颗 粒；相比ELISA、HAI和中和实验所需的数小时至数天，荧光标记的重组表达HA和NA 的细胞凝集反应小于60分钟，反应时间快速；利用通用引物和载体可对不同血清型的 HA和NA基因进行克隆与转染表达，即可得到不同HA和NA抗原的致敏细胞颗粒，可以 更加广泛地对不同血清型流感病毒抗体进行检测；相对于非荧光标记的重组表达HA和 NA的细胞凝集反应方法，本发明适合高通量检测、细胞用量更少(仅需未用荧光标记细 胞的 1/100 到 1/10)。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1绿色荧光蛋白标记的重组表达流感病毒HA和NA的真核细胞的方法
本实施例以一株H5 亚型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1) 为例，进行重组表达流感病毒血凝素HA真核表达细胞的制备。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在广东省的鸡中分离得到的一株H5N1亚型流 感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共数据库GenBank上获得，HA的序列号为 EU874899.2，NA的序列号为EU874900.2。将该株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AgCAAAAgCAgg-3，)和 SuperScript III 或 M-MLV 逆转录酶进行逆转录，得到病毒cDNA。根据该毒株HA的基因序列，设计一对用于HA 全长基因克隆的引物，其引物序列具体如下上游引物H5HA-F，序列为5’ -GCAAAG CTTACCATGGAGAAAATACTTCTTC-3‘，从 5，端依次为 3 个保护性碱基、HindIII 酶 切位点、KOZAK序列、起始密码子和配对区；下游引物H5HA-R，序列为5’ -CTCGG ATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3‘，从5’ 端依次为 3个保护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码子和配对区。利用这对引物，用高保真Taq酶对病毒cDNA进行 PCR扩增，扩增HA片段。
根据该毒株NA的基因序列，设计一对用于NA全长基因克隆的引物，其引物序 列具体如下上游引物 NlNA-F 序列为 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，从5’端依次为3个保护性碱基、HindIII酶切位点、KOZAK序列、起始密码子和配对区；下游引物N1NA-R，序列为5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，从5’端依次为3个保护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码子和配对区。 利用这对引物，用高保真Taq酶对病毒cDNA进行PCR扩增，扩增NA片段。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后HA基因片段后，与表达载体pcDNA3分别进 行使用Hind III和BamH I双酶切，再次电泳回收后利用T4DNA连接酶将酶切回收后的 HA片段与载体进行连接。NA片段与绿色荧光表达载体使用Hind III和BamH I双酶切 后，电泳回收进行连接，该载体编码的绿色荧光蛋白与多克隆位点间有一个核糖体进入 位点序列(IRES)，NA基因片段插入载体的启动子后、IRES前，当启动子启动转录时可 以得到一个编码有NA、IRES和绿色荧光蛋白的mRNA，最终翻译得到单独的NA和绿色 荧光蛋白。
连接产物分别转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布Amp抗性平板。菌落 经PCR后，提取质粒酶切鉴定和DNA测序，获得含有HA基因片段的真核表达质粒即 pcDNA-H5HA,获得含有HA基因片段的真核表达质粒即pIRES-EGFP_NlNA。含有 pcDNA-H5HA质粒和pIRES-EGFP_NlNA质粒的细菌，分别经含有50 μ g/ml的氨苄 青霉素(Amp)的LB培养过夜后，用高纯度质粒提取试剂盒提取pcDNA-H5HA质粒和 pIRES-EGFP-ΝΙΝΑ质粒，用于后续转染细胞和重组表达实验。
根据Lipofectamine 2000 试剂盒说明，将 2.5 μ g pcDNA_H5HA 质粒、 0.5 μ gpIRES-EGFP-ΝΙΝΑ 质粒和 10 μ 1 Lipofectamine 2000 转染复合物，转染一个:35mm直径培养皿含有生长密度约为80% -90%融合率的人胚肾HEK-239细胞，转染后《ι去除 转染复合物，更换新鲜的完全培养基(含有10%胎牛血清的DMEM培养基)。
转染后，HEK-239细胞即可瞬时重组表达HA、NA和绿色荧光蛋白，即得到瞬 时绿色荧光蛋白标记的重组表达流感病毒HA和NA的细胞。
为进一步优化，可以筛选获得稳定绿色荧光蛋白标记的重组表达HA和NA的细 胞在转染7Zh后将转染细胞吹打分散，将细胞悬液的1/20接种一个新的35mm直径培 养皿中，补充完全培养基至3ml，经过夜贴壁后，补加G418至浓度为600 μ g/ml。此后 每3至5天的更换一次含有600 μ g/ml G418的完全培养基，约3周后可见筛选出现的抗性 细胞集落。将抗性细胞集落经胰酶消化后，按10-20个细胞/ml接种96孔板培养，加入 含有600 μ g/ml G418的完全培养基培养至长至单层后，进行传代，获得用于检测的备份 培养96孔板。将检测用的96孔板的细胞用4%多聚甲醛室温固定5分钟，经PBS漂洗 后，加入Cy3荧光标记的抗H5亚型HA的抗体进行免疫荧光检测，同时观察绿色荧光， 选择红色和绿色荧光阳性信号强、红色和绿色荧光阳性细胞比例高的孔，对细胞继续重 复的克隆化和免疫荧光，至阳性细胞比例接近100%，即可得到稳定绿色荧光蛋白标记重 组表达该毒株HA和NA的细胞。
将绿色荧光蛋白标记瞬时或稳定重组表达该毒株HA和NA的细胞，经贴壁或悬 浮培养后，用含有2% BSA的PBS将细胞吹打分散，将细胞悬液进行离心，去除上清后 用含有2% BSA的PBS按IO5个/ml细胞密度进行重悬。去除上清，用等体积的PBS重 悬、离心进行洗涤2次，再次加入等体积的PBS，加入等体积的10%的冷甲醛，于4°C固 定2小时。经离心、PBS重悬的方式进行3次洗涤。最后将细胞沉淀，按IO5个/ml的 浓度重悬于含有0.2%尼泊尔金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的PBS缓冲液中，使其能够稳定地长时间保存，即得到了处理后的绿色荧光蛋白标记重组表达HA和NA抗原 的真核细胞。
将该绿色荧光蛋白标记重组表达HA和NA抗原的真核细胞的细胞悬液25 μ 1与 待检样品25 μ 1，在微量凝集板中混合，室温放置60分钟后，在荧光显微镜下观察。如 未发生凝集，则发出绿色荧光的细胞会沉淀在凝集板底部，镜下可见荧光细胞聚集在中 央；如发生凝集，则发出绿色荧光的细胞以絮状悬浮在液体中，镜下可见荧光细胞在视 野中分散，细胞与细胞间发生聚团。利用这一特征，也可以用荧光显微镜进行成像，利 用图像分析软件，通过设立荧光发光面积来实现软件判读凝集与否。待检样品发生凝集 时，说明待检样品中含有与该毒株HA和/或NA具有反应性的流感病毒HA和/或NA 抗体。
实施例2荧光素CFSE (羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)标记的重组表达流 感病毒HA和NA的真核细胞的方法
本实施例以一株Η5 亚型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1) 为例，进行重组表达流感病毒血凝素HA真核表达细胞的制备。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在广东省的鸡中分离得到的一株H5N1亚型流 感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共数据库GenBank上获得，HA的序列号为 EU874899.2，NA的序列号为EU874900.2。将该株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3，)禾Π SuperScript III 或 M-MLV逆转录酶进行逆转录，得到病毒cDNA。根据该毒株HA的基因序列，设计一对 用于HA全长基因克隆的引物，其引物序列具体如下上游引物H5HA-F，序列为5’ -G CAAAGCTTACCATGGAGAAAATAGTACTTCTTC-3‘，从 5，端依次为 3 个保护性碱 基、HindIII酶切位点、KOZAK序列、起始密码子和配对区；下游引物H5HA-R，序列 为 5，-CTCGGATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3，，从 5，端依次为 3 个保 护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码子和配对区。利用这对引物，用高保真Taq酶对 病毒cDNA进行PCR扩增，扩增HA片段。
根据该毒株NA的基因序列，设计一对用于NA全长基因克隆的引物，其引物序 列具体如下上游引物 NlNA-F 序列为 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，从5’端依次为3个保护性碱基、HindIII酶切位点、KOZAK序列、起始密 码子和配对区；下游引物N1NA-R，序列为5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，从5’端依次为3个保护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码子和配对区。 利用这对引物，用高保真Taq酶对病毒cDNA进行PCR扩增，扩增NA片段。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后HA和NA基因片段后，与表达载体pcDNA3 分别进行使用Hind III和BamH I双酶切，再次电泳回收后利用T4DNA连接酶将酶切回 收后的HA片段与载体进行连接、NA片段与载体进行连接，分别转化大肠杆菌DH5a感 受态细胞，涂布Amp抗性平板。菌落经PCR后，提取质粒酶切鉴定和DNA测序，获 得含有HA基因片段的真核表达质粒即pcDNA-H5HA，获得含有HA基因片段的真核表 达质粒即pcDNA-NlNA。含有pcDNA_H5HA质粒和pcDNA_NlNA质粒的细菌，分别 经含有50 μ g/ml的氨苄青霉素(Amp)的LB培养过夜后，用高纯度质粒提取试剂盒提取 pcDNA-H5HA质粒和pcDNA_NlNA质粒，用于后续转染细胞和重组表达实验。
根据Lipofectamine 2000 试剂盒说明，将 2.5 μ g pcDNA_H5HA 质粒、 0.5 μ gpcDNA-NlNA 质粒和 10 μ 1 Lipofectamine 2000 转染复合物，转染一个:35mm 直径培养皿含有生长密度约为80% -90%融合率的人胚肾HEK-239细胞，转染后《ι去除转染 复合物，更换新鲜的完全培养基(含有10%胎牛血清的DMEM培养基)。
转染后，HEK-239细胞即可瞬时重组表达HA和NA，即得到瞬时重组表达流感 病毒HA和NA的细胞。
为进一步优化，可以筛选获得稳定重组表达HA和NA的细胞在转染7Zh后将 转染细胞吹打分散，将细胞悬液的1/20接种一个新的35mm直径培养皿中，补充完全培 养基至3ml，经过夜贴壁后，补加G418至浓度为600μ§/ιη1。此后每3至5天的更换一次 含有600yg/mlG418的完全培养基，约3周后可见筛选出现的抗性细胞集落。将抗性细 胞集落经胰酶消化后，按10-20个细胞/ml接种96孔板培养，加入含有600 μ g/ml G418 的完全培养基培养至长至单层后，进行传代，获得用于检测的备份培养96孔板。将检测 用的96孔板的细胞用4%多聚甲醛室温固定5分钟，经PBS漂洗后，加入Cy3荧光标记 的抗H5亚型HA的抗体和FITC荧光标记的抗Nl亚型NA的抗体进行免疫荧光检测，选 择红色和绿色荧光阳性信号强、红色和绿色荧光阳性细胞比例高的孔，对细胞继续重复 的克隆化和免疫荧光，至阳性细胞比例接近100%，即可得到稳定重组表达该毒株HA和 NA的细胞。
瞬时或稳定重组表达该毒株HA和NA的细胞，经贴壁或悬浮培养后，用含有 2% BSA的PBS将细胞吹打分散，将细胞悬液进行离心，去除上清后用含有0.1% BSA的 PBS按IO7个/ml细胞密度进行重悬。每ml细胞悬液中，力卩入2 μ 1的5mmol/L的CFSE 母液，37°C放置10分钟，再加入5ml冰预冷的PBS，于冰水混合物中放置5分钟，离心 去除上清，用等体积的PBS重悬、离心进行洗涤2次，再次加入等体积的PBS，加入等 体积的10%的冷甲醛，于4°C固定2小时。经离心、PBS重悬的方式进行3次洗涤。最 后将细胞沉淀，按105个/ml的浓度重悬于含有0.2%尼泊尔金酯、2%BSA、20%甘油、 0.5%肝素的PBS缓冲液中，使其能够稳定地长时间保存，即得到了荧光素CFSE标记的 重组表达HA和NA抗原的真核细胞。
将该绿色荧光蛋白标记重组表达HA和NA抗原的真核细胞的细胞悬液25 μ 1与 待检样品25 μ 1，在微量凝集板中混合，室温放置60分钟后，在荧光显微镜下观察。如 未发生凝集，则发出绿色荧光的细胞会沉淀在凝集板底部，镜下可见荧光细胞聚集在中 央；如发生凝集，则发出绿色荧光的细胞以絮状悬浮在液体中，镜下可见荧光细胞在视 野中分散，细胞与细胞间发生聚团。利用这一特征，也可以用荧光显微镜进行成像，利 用图像分析软件，通过设立荧光发光面积来实现软件判读凝集与否。待检样品发生凝集 时，说明待检样品中含有与该毒株HA和/或NA具有反应性的流感病毒HA和/或NA 抗体。
实施例3绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白分别标记单独重组表达流感病毒HA和 NA的真核细胞的方法
本实施例以一株Η5 型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1)为例，进行重组表达流感病毒血凝素HA真核表达细胞的制备。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在广东省的鸡中分离得到的一株H5N1亚型流9感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共数据库GenBank上获得，HA的序列号为 EU874899.2，NA的序列号为EU874900.2。将该株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3，)禾Π SuperScript III 或 M-MLV逆转录酶进行逆转录，得到病毒cDNA。根据该毒株HA的基因序列，设计一对 用于HA全长基因克隆的引物，其引物序列具体如下上游引物H5HA-F，序列为5’ -G CAAAGCTTACCATGGAGAAAATAGTACTTCTTC-3，，从 5，端依次为 3 个保护性碱 基、HindIII酶切位点、KOZAK序列、起始密码子和配对区；下游引物H5HA-R，序列 为 5，-CTCGGATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3，，从 5，端依次为 3 个保 护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码子和配对区。利用这对引物，用高保真Taq酶对 病毒cDNA进行PCR扩增，扩增HA片段。
根据该毒株NA的基因序列，设计一对用于NA全长基因克隆的引物，其引物序 列具体如下上游引物 NlNA-F 序列为 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，从5’端依次为3个保护性碱基、HindIII酶切位点、KOZAK序列、起始密 码子和配对区；下游引物N1NA-R，序列为5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，从5’端依次为3个保护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码子和配对区。 利用这对引物，用高保真Taq酶对病毒cDNA进行PCR扩增，扩增NA片段。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后HA基因片段后，与红色荧光表达载体分别 进行使用Hind III和BamH I双酶切，再次电泳回收后利用T4DNA连接酶将酶切回收后 的HA片段与载体进行连接。该红色荧光表达载体，在编码的红色荧光蛋白与多克隆位 点间有一个核糖体进入位点序列(IRES)，HA基因片段插入载体的启动子后、IRES前， 当启动子启动转录时可以得到一个编码有HA、IRES和红色荧光蛋白的mRNA，最终翻 译得到单独的HA和红色荧光蛋白。NA片段与绿色荧光表达载体使用Hind III和BamH I双酶切后，电泳回收进行连接，该载体编码的绿色荧光蛋白与多克隆位点间有一个核糖 体进入位点序列(IRES)，NA基因片段插入载体的启动子后、IRES前，当启动子启动转 录时可以得到一个编码有NA、IRES和绿色荧光蛋白的mRNA，最终翻译得到单独的NA 和绿色荧光蛋白。
连接产物分别转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布Amp抗性平板。菌落 经PCR后，提取质粒酶切鉴定和DNA测序，获得含有HA基因片段的真核表达质粒即 pIRES-Red-H5HA,获得含有HA基因片段的真核表达质粒即pIRES-EGFP_NlNA。含 有pIRES-Red_H5HA质粒和pIRES_EGFP_NlNA质粒的细菌，分别经含有50 μ g/ml的氨 苄青霉素(Amp)的LB培养过夜后，用高纯度质粒提取试剂盒提取pIRES-Red_H5HA质 粒和pIRES-EGFP-ΝΙΝΑ质粒，用于后续转染细胞和重组表达实验。
根据Lipofectamine 2000 试剂盒说明，将 3 μ g pIRES-Red"H5HA 质粒和 10 μ ILipofectamine 2000转染复合物，转染一个35mm直径培养皿含有生长密度约为 80%-90(%融合率的人胚肾1^尺-239细胞，转染后《ι去除转染复合物，更换新鲜的完全 培养基(含有10%胎牛血清的DMEM培养基)。
转染后，HEK-239细胞即可瞬时重组表达HA，即得到红色荧光蛋白标记的瞬 时重组表达流感病毒HA的细胞。
为进一步优化，可以筛选获得稳定重组表达HA的细胞在转染7Zh后将转染细胞吹打分散，将细胞悬液的1/20接种一个新的35mm直径培养皿中，补充完全培养基至 3ml，经过夜贴壁后，补加G418至浓度为600yg/ml。此后每3至5天的更换一次含有 600yg/mlG418的完全培养基，约3周后可见筛选出现的抗性细胞集落。将抗性细胞集 落经胰酶消化后，按10-20个细胞/ml接种96孔板培养，加入含有600 μ g/ml G418的完 全培养基培养至长至单层后，于荧光显微镜下观察细胞的红色荧光，对细胞继续重复的 克隆化，至红色荧光阳性细胞比例接近100%，即可得到红色荧光蛋白标记的稳定重组表 达该毒株HA的细胞。
根据 Lipofectamine 2000 试剂盒说明，将 3 μ g pIRES-EGFP-NlNA 质粒和 10 μ ILipofectamine 2000转染复合物，转染一个35mm直径培养皿含有生长密度约为 80%-90(%融合率的人胚肾1^尺-239细胞，转染后《ι去除转染复合物，更换新鲜的完全 培养基(含有10%胎牛血清的DMEM培养基)。
转染后，HEK-239细胞即可瞬时重组表达NA，即得到绿色荧光蛋白标记的瞬时 重组表达流感病毒NA的细胞。
为进一步优化，可以筛选获得稳定重组表达NA的细胞在转染7Zh后将转染 细胞吹打分散，将细胞悬液的1/20接种一个新的35mm直径培养皿中，补充完全培养基 至3ml，经过夜贴壁后，补加G418至浓度为600 μ g/ml。此后每3至5天的更换一次含 有600 μ g/ml G418的完全培养基，约3周后可见筛选出现的抗性细胞集落。将抗性细 胞集落经胰酶消化后，按10-20个细胞/ml接种96孔板培养，加入含有600 μ g/ml G418 的完全培养基培养至长至单层后，荧光显微镜下观察绿色荧光，选择荧光阳性信号强、 荧光阳性细胞比例高的孔，对细胞继续重复的克隆化和免疫荧光，至阳性细胞比例接近 100%,即可得到绿色荧光蛋白标记的稳定重组表达该毒株NA的细胞。
红色荧光蛋白标记的瞬时或稳定重组表达该毒株HA的细胞，经培养后，用低 浓度胰酶(0.05%)温和消化细胞约5分钟，加入含有胎牛血清的培养基终止反应，将细 胞悬液进行离心，去除上清后用含有2% BSA的PBS进行重悬，获得胰酶处理后的细胞 悬液。为防止HA可能引起的细胞自凝集，在胰酶处理后的细胞悬液中加入神经氨酸酶 (又称神经氨酸苷酶，Neuraminidase)进行处理，消除重组表达的HA与细胞自身受体的 作用，避免细胞自身凝集。即，将细胞悬液经离心后，用50mM柠檬酸钠(pH 6.0)缓 冲液，将细胞按IO7个/ml进行重悬，每ml细胞悬液中加入200单位的神经氨酸酶，于 37°C条件下处理30分钟后离心，去除上清，用等体积的PBS重悬、离心进行洗涤2次， 再次加入等体积的PBS。上述经胰酶和神经氨酸酶处理的细胞悬液，加入等体积的10% 的冷甲醛，于4°C固定2小时。经离心、PBS重悬的方式进行3次洗涤。最后将细胞沉 淀，按IO5个/ml的浓度重悬于含有0.2%尼泊尔金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的 PBS缓冲液中，使其能够稳定地长时间保存，即得到了处理后的重组表达HA抗原的真核 细胞。
绿色荧光蛋白标记的瞬时或稳定重组表达该毒株NA的细胞，经贴壁或悬浮培养 后，用含有2% BSA的PBS将细胞吹打分散，将细胞悬液进行离心，去除上清后用含有 2% BSA的PBS按IO7个/ml细胞密度进行重悬。去除上清，用等体积的PBS重悬、离 心进行洗涤2次，再次加入等体积的PBS，加入等体积的10%的冷甲醛，于4°C固定2小 时。经离心、PBS重悬的方式进行3次洗涤。最后将细胞沉淀，按IO5个/ml的浓度重悬于含有0.2%尼泊尔金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的PBS缓冲液中，使其能够 稳定地长时间保存，即得到了处理后的重组表达NA抗原的真核细胞。
上述绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白分别标记的单独重组表达HA和NA的真核细 胞即可用检测，同时也可将两者按一定比例进行混合，混合比例为重组表达HA的真核细 胞含量为10%-95%，优选70%-80%，重组表达HA的真核细胞含量为5%-90%，优 选20% -30%,混合后的细胞在检测效果上与共同重组表达HA和NA的真核细胞类似。
将绿色荧光蛋白单独重组表达HA或NA的真核细胞悬液和红色荧光蛋白分别标 记的单独重组表达HA或NA的真核细胞悬液25 μ 1与待检样品25 μ 1，在微量凝集板中混 合，室温放置60分钟后，在荧光显微镜下观察。如未发生凝集，则发出绿色荧光的细胞 会沉淀在凝集板底部，镜下可见荧光细胞聚集在中央；如发生凝集，则发出绿色荧光的 细胞以絮状悬浮在液体中，镜下可见荧光细胞在视野中分散，细胞与细胞间发生聚团。 利用这一特征，也可以用荧光显微镜进行成像，利用图像分析软件，通过设立荧光发光 面积来实现软件判读凝集与否。待检样品发生凝集时，说明待检样品中含有与该毒株HA 和/或NA具有反应性的流感病毒HA和/或NA抗体。
将红色荧光蛋白标记重组表达HA抗原的真核细胞悬液(设为Α)、绿色荧光蛋 白标记重组表达NA抗原的真核细胞悬液(设为B)、绿色荧光蛋白标记的重组表达HA和 NA抗原的真核细胞悬液(或绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白分别标记的单独表达HA和NA 的真核细胞混合悬液，设为C)，各加25 μ 1加到洁净的微量凝集板中，然后各加入25 μ 1 的待检样品(血清、支气管灌洗液、血浆、组织液等)至3种不同的细胞悬液中混合，室 温放置60分钟后，在荧光显微镜下观察。如未发生凝集，则发出绿色荧光的细胞会沉淀 在凝集板底部，镜下可见荧光细胞聚集在中央；如发生凝集，则发出绿色荧光的细胞以 絮状悬浮在液体中，镜下可见荧光细胞在视野中分散，细胞与细胞间发生聚团。利用这 一特征，也可以用荧光显微镜进行成像，利用图像分析软件，通过设立荧光发光面积来 实现软件判读凝集与否。待检样品发生凝集时，说明待检样品中含有与该毒株HA和/ 或NA具有反应性的流感病毒HA和/或NA抗体。
设立阳性血清和阴性血清对照，如对照样品符合预期结果，待检样品发生与上 述细胞悬液均未凝集时，说明待检样品中不含有与该毒株HA和NA具有反应性的流感病 毒HA和NA抗体或抗体浓度低于该方法所能达到的检测浓度。设立阳性血清和阴性血 清对照，如对照样品符合预期结果，待检样品发生与上述细胞悬液均发生凝集时，说明 待检样品中含有与该毒株HA和NA具有反应性的流感病毒HA和NA抗体。
设立阳性血清和阴性血清对照，如对照样品符合预期结果，待检样品发生与细 胞悬液A和细胞悬液C均发生凝集时，而未与细胞悬液B发生凝集时，说明待检样品中 含有与该毒株HA具有反应性的流感病毒HA抗体，而不含有与该毒株NA具有反应性的 流感病毒NA抗体或抗体浓度低于该方法所能达到的检测浓度。
设立阳性血清和阴性血清对照，如对照样品符合预期结果，待检样品发生与细 胞悬液B和细胞悬液C均发生凝集时，而未与细胞悬液A发生凝集时，说明待检样品中 含有与该毒株NA具有反应性的流感病毒NA抗体，而不含有与该毒株HA具有反应性的 流感病毒HA抗体或抗体浓度低于该方法所能达到的检测浓度。
待检样品发生凝集时，说明待检样品中含有与该毒株HA和/或NA具有反应性的流感病毒HA和/或NA抗体。此时可以进一步进行相对定量分析，即，将待检样品1 进行连续的倍比稀释，然后分别与实施例2中的处理后的重组表达HA和/或NA抗原的 真核细胞悬液进行凝集反应，得到所能发生凝集的样品最高稀释度，设为dl。同样方法 可得到待检样品2的凝集反应阳性最高稀释度d2。以此横向比较不同待检样品中流感病 毒HA和/或NA抗体的浓度差异和相对比例。
权利要求
1.一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所述方法是将流感 病毒血凝素基因和神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感 病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，对重组表达细胞进行荧光标记，该细胞表面的重组表达 的血凝素和神经氨酸酶蛋白与待测样品的流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体结合， 发生凝集反应，荧光检测分析，根据荧光面积是否增加来判定待测样品中是否存在流感 病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞为同时共同重组表达流感病毒血凝 素和神经氨酸酶，或者分别重组表达流感病毒血凝素的真核细胞与重组表达神经氨酸酶 的真核细胞的混合。
3.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述重组表达为瞬时表达或稳定表达。
4.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述真核细胞表面重组表达的流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白为完整全长的流感病毒血 凝素和神经氨酸酶蛋白，或流感病毒血凝素蛋白和神经氨酸酶的一部分，或流感病毒血 凝素和神经氨酸酶的抗原表位，或将流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白全长或部分肽段 中的部分氨基酸进行突变或修饰。
5.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述真核细胞表面重组表达的血凝素为甲型流感病毒的HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、 H8、H9、H10, HlU H12、H13、H14、H15、H16亚型、乙型流感病毒或丙型流感病 毒的血凝素。
6.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述真核细胞表面重组表达的神经氨酸酶蛋白为甲型流感病毒的Ni、N2、N3、N4、N5、 N6、N7、N8、N9亚型、乙型流感病毒或丙型流感病毒的神经氨酸酶。
7.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体为IgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一种或几种 的混合物。
8.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述荧光标记为荧光素、荧光蛋白或其它能够发出荧光的物质。
9.根据权利要求1所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法，其特征在于所 述荧光检测分析所用的设备为荧光显微镜、荧光光度计或多功能微孔板检测仪。
10.根据权利要求1 9中任意一条权利要求所述的检测流感病毒抗体的荧光微量细 胞凝集方法，其特征在于所述真核细胞为酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞或其它真核细 胞，重组表达的流感病毒血凝素位于细胞膜或细胞壁表面。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法。本发明方法是将流感病毒血凝素基因和神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，对重组表达细胞进行荧光标记，该细胞表面的重组表达的血凝素和神经氨酸酶蛋白与待测样品的流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反应，通过荧光显微镜拍照，根据荧光面积是否增加来判定待测样品中是否存在流感病毒抗体。本发明检测方法使用荧光标记细胞，减少了细胞使用量，可进行高通量检测，可以实现流感病毒抗体的快速检测、早期检测、现场检测和评价。
文档编号G01N33/569GK102023213SQ20101029718
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者吴嘉伟, 吴彬冰, 孟燕萍, 李卫中, 李康生, 李蕊, 王革非, 蔡汉杰, 黄秀梅 申请人:汕头大学医学院