专利名称：用于筛选抑制神经变性的化合物的方法
技术领域：
本发明一般涉及筛选抑制神经元变性的化合物的方法。更具体的说，该方法涉及 筛选在神经元变性的触发性事件后抑制APP自神经元脱落的化合物。
背景技术：
本领域已经鉴定了属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的多种配体和受体。在这些配 体中有肿瘤坏死因子-α ( “ TNF-α ”)、肿瘤坏死因子-β ( “ TNF-β ”或“淋巴毒素-α，，)、 淋巴毒素- β ("LT-β ”)、CD30 配体、CD27 配体、CD40 配体、0X-40 配体、4-1BB 配体、LIGHT、 Apo-I配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也称作Apo2L或TRAIL)、Apo-3 配体(也称作TTOAK)、APRIL、OPG配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)和TALL-I (也 称作 BlyS, BAFF 或 THANK)(参见例如 Ashkenazi, Nature Review, 2 :420-430(2002)； Ashkenaziand Dixit, Science,281 1305-1308 (1998) ；Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. CellBiol. ,11 :255-260(2000) ；Golstein, Curr. Biol.，7 :750-753(1997) ；ffallach, Cytokine Reference, Academic Press,2000, pages 377-411 ；Locksley 等，Cell,104 487-501(2001) ；Gruss and Dower, Blood, 85 :3378-3404(1995) ；Schmid 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 1881 (1986) ；Dealtry 等，Eur. J. Immunol.，17 :689 (1987) ；Pitti 等， J. Biol. Chem. ,271 :12687-12690(1996) ；Wiley 等，Immunity，3 :673-682(1995) ；Browning 等，Cell, 72 :847-856(1993) ；Armitage 等，Nature, 357 :80-82(1992) ；WO 97/01633，公开 于 1997 年 1 月 16 日；W097/25428,公开于 1997 年 7 月 17 日；Marsters 等，Curr. Biol.，8 525-528(1998) ；Chicheportiche 等，J. Biol. Chem. , 272 :32401-32410 (1997) ；Hahne 等， J.Exp. Med.，188 :1185-1190(1998) ；WO 98/28426，公开于 1998 年 7 月 2 日；W098/46751，公 开于 1998 年 10 月 22 日；WO 98/18921，公开于 1998 年 5 月 7 日；Moore 等，Science, 285 260-263(1999) ；Shu 等，J. Leukocyte Biol. ,65 :680(1999) ；Schneider 等，J. Exp. Med.， 189 :1747-1756(1999) ；Mukhopadhyay 等，J. Biol. Chem. ,274 15978-15981 (1999)) 由这些TNF家族配体介导的多种细胞应答的诱发通常是通过它们与特定细胞 受体结合而开始的。在迄今为止已经鉴定的TNF受体超家族成员中包括TNFR1、TNFR2、 P75-NGFR、TACI, GITR、CD27、0X-40、CD30、CD40、HVEM、Fas (也称作 Apo-I 或 CD95)、 DR4 (也称作 TRAIL-R1)、DR5 (也称作 Apo_2 或 TRAIL-R2)、DR6 (也称作 TR9，在文献 中也称作TNF受体超家族成员21或TNFRSF21)、DcRl、DcR2、护骨蛋白(OPG)、RANK和 Apo-3 (也称作 DR3 或 TRAMP)(参见例如 Ashkenazi，Nature Reviews, 2 :420-430 (2002)；Ashkenazi and Dixit, Science,281 1305-1308 (1998) ；Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin.Cell Biol. ，11 :255-260(2000) ；Golstein, Curr.Biol. ,7 :750-753 (1997)； ffallach, Cytokine Reference, Academic Press,2000, pages 377-411 ；Locksley 等， Cell,104 :487-501(2001) ；Gruss and Dower, Blood,85 :3378-3404(1995) ；Hohman 等， J. Biol. Chem. ,264 :14927-14934(1989) ；Brockhaus 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :3127-3131 (1990) ；EP 417，563，公开于 1991 年 3 月 20 日；Loetscher 等，Cell,61 351(1990) ；Schall 等，Cell, 61 :361(1990) ；Smith 等，Science，248 1019-1023 (1990)； Lewis 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :2830-2834 (1991) ；Goodwin 等，Mol. Cell. Biol., 11 :3020-3026(1991) ；Stamenkovic 等，EMBO J.，8 :1403-1410(1989) ；Mallett 等，EMBO J.，9 :1063-1068(1990) ；Anderson 等，Nature, 390 :175-179(1997) ；Chicheportiche 等， J. Biol. Chem.，272 :32401-32410(1997) ；Pan 等，Science，276 :111-113 (1997) ；Pan 等， Science,277 :815-818(1997) ；Sheridan 等，Science,277 :818-821(1997) ；Degli-Esposti 等，J. Exp. Med.，186 :1165-1170(1997) ；Marsters 等，Curr. Biol.，7 1003-1006 (1997)； Tsuda ^f, BBRC,234 :137-142(1997) ；Nocentini Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 6216-6221 (1997) ；vonBulow 等，Science, 278 :138-141 (1997) Johnson 等，Cell, 47 545-554(1986) ；Radeke 等，Nature, 325 :593-597(1987) ；Pan 等，FEBS Lett.，431 351-356(1998))。大多数这些TNF受体家族成员共享细胞表面受体的典型结构，包括胞外区、跨膜 区和胞内区，而其它成员则天然发现是缺少跨膜和胞内结构域的可溶性蛋白质。典型TNFR 的胞外部分包含从NH2-末端起始的多个富含半胱氨酸结构域(CRD)的重复氨基酸序列样 式。关于TNF受体和配体家族的综述一般参见例如Wallach，CytokineReference, Academic Press,2000,页 377-411 ；Locksley 等，Cell，104 :487-501 (2001) ；Ware, Cytokine & Growth Factor Reviews,14 :181-184(2003) ；Liu 等，Immunity,15(1) 23-34(2001)；及 Bossen 等，J.Biol Chem. 281(20) :13964-71 (2006)。称作DR6受体(在文献中也称作“TR9”；在文献中也称作TNF受体超家族成员 21或TNFRSF21)的TNFR家族成员已经被描述为I型跨膜受体，其具有四个胞外富含半胱 氨酸的基序和一个胞质死亡结构域结构(Pan等，FEBSLett.，431 :351-356(1998)；还可参 见美国专利 6，358，508 ；6，667，390 ；6，919，078 ；6，949，358)。已经报道了 DR6 在某些转 染细胞系中的过表达导致凋亡及NF-kB和JNK 二者的活化(Pan等，FEBS Letters, 431 351-356(1998))。在DR6缺陷小鼠模型中，T细胞在JNK活化方面受到实质性损伤，而且在 用蛋白质抗原攻击DR6 (-/")小鼠时，发现它们的T细胞过度增殖并展现出通向Th2应答的 深刻极化(而Thl分化没有受到同等影响)Ghao等，J. Exp. Med. , 194 1441-1448 (2001)) 0 还报道了在体外对DR6的靶向破坏导致增强的T辅助细胞2( 分化(aiao等，见上文)。 DR6拮抗剂或拮抗剂在调控B细胞介导的疾患中的各种用途记载于2005年3月31日公布 的US 2005/0069540. DR6受体可能在调节OVA诱导的小鼠哮喘模型中的气道炎症中发挥 作用(Venkataraman 等，Immunol. Lett.，106 :42-47 (2006))。使用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(M0G(35-55))诱导的实验性自身免疫性脑脊髓 炎模型，发现与野生型(WT)同窝出生者相比，DR6-/-小鼠对CNS疾病的发作和进展二者高度有抗性。如此，DR6可能涉及调节实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导和进展中的白细胞 浸润和功能(Schmidt 等，J. Immunol.，175 :2286_2四2 (2005))。虽然已经鉴定了多个TNF配体和受体家族成员具有各式各样的生物学活性和特 性，但是很少的此类配体和受体有报道涉及神经学相关功能。例如，2004年8月沈日公布 的102004/0715 记载了在鼠模型中抑制⑶95 (Fas)配体/受体复合物来治疗脊髓损伤。发明概述在本发明的实施方案中，提供了分离的死亡受体6( “DR6”)拮抗剂。本文中所公 开的拮抗剂的某些实施方案抑制或阻断DR6与一种或多种其关联配体之间的相互作用。在 优选的实施方案中，本文中所公开的DR6拮抗剂抑制或阻断DR6与其关联配体淀粉状蛋白 前体蛋白(amyloid precursor protein，“APP”)之间的相互作用。DR6拮抗剂的实施方 案可包括抗体，诸如DR6或APP抗体。此类DR6拮抗性抗体可以是例如单克隆抗体、嵌合 抗体、人源化抗体、或人抗体。在本发明的某些实施方案中，DR6拮抗剂可包括抗DR6抗体， 其结合DR6胞外结构域多肽或其片段，且任选可结合包含图IA氨基酸1-349或42-349的 DR6多肽。或者，DR6拮抗剂可包括抗APP抗体，其结合APP多肽，且任选的是可结合包含图 IB (SEQ ID NO 6)氨基酸 66-81 的 APP 多肽。DR6拮抗剂还包括DR6免疫粘附素、DR6变体、DR6片段、其共价修饰形式、或其融合 蛋白，以及小分子拮抗剂。举例而言，DR6拮抗剂可包括PEG化DR6或融合至异源序列(诸 如表位标签、抗体片段(诸如人Fe)、或亮氨酸拉链)的可溶性胞外结构域形式DR6。本发明的例示性实施方案还包括抑制或阻断DR6对APP的结合的方法，包括在DR6 对APP的结合受到抑制的条件下将DR6多肽和/或APP多肽暴露于一种或多种DR6拮抗剂。 在此类方法中所使用的典型DR6拮抗剂包括结合DR6或APP的抗体，以及可溶性DR6多肽。 任选的是，通过观察抑制DR6与APP之间的结合的能力来选择这些方法中所使用的DR6拮 抗剂。在本发明的某些实施方案中，使用此类方法来例如在体外组织培养中抑制神经元细 胞的凋亡和/或增强神经元细胞的生长和/或存活。所述方法涵盖使用单一类型的DR6拮 抗剂分子或两种或更多类型的DR6拮抗剂的组合。本发明的实施方案还提供了用于增强哺乳动物中的神经元细胞或组织的生长或 再生或存活的方法，包括对哺乳动物施用有效量的DR6拮抗剂。在任选的实施方案中，DR6 拮抗剂的施用在所述哺乳动物中增强神经元细胞或组织的生长并阻断神经元细胞或组织 的细胞死亡和变性(degeneration)。神经元细胞或组织可包括例如运动神经元、感觉神经 元、连合神经元(commissuralneuron)、轴突、小胶质、和/或少突胶质细胞。在本发明的有 些实施方案中，此类方法中所使用的DR6拮抗剂可包括结合APP并抑制其结合DR6的能力 的抗体。在本发明的其它实施方案中，此类方法中所使用的DR6拮抗剂可包括结合DR6并 抑制其结合APP的能力的抗体。或者，DR6拮抗剂可包括DR6免疫粘附素、连接至非蛋白质 性质聚合物(其选自下组聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯(polyoxyalkylene))的DR6多 肽、或DR6多肽变体。所述方法中所采用的DR6免疫粘附素可包含融合至免疫球蛋白Fc区 的可溶性DR6受体。另外，本发明的DR6拮抗剂可包括小分子。本发明的实施方案还提供了用于治疗神经学病症的方法，包括对哺乳动物施用有 效量的DR6拮抗剂。在任选的实施方案中，所述方法包括治疗哺乳动物中的阿耳茨海默氏 病。此类方法中所使用的DR6拮抗剂可包括结合APP并抑制其结合DR6的能力的抗体。DR6拮抗剂还可包括DR6抗体。或者，DR6拮抗剂可包括DR6免疫粘附素、连接至非蛋白质性质 聚合物(其选自下组聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯)的DR6多肽、DR6抗体或DR6变体。 所述方法中所采用的DR6免疫粘附素可包含融合至免疫球蛋白Fc区的可溶性DR6受体。所 述方法中所采用的抗DR6抗体可结合包含图IA氨基酸1-349或42-349的DR6受体。本发明的实施方案还包括用于诊断患有神经学病症的或对神经学病症易感的患 者的方法，包括自所述患者获取样品并对所述样品测试具有与SEQID NO :1之DR6多肽序列 不同的多肽序列的DR6多肽变体的存在。典型的是，在此类方法中，所述多肽变体被鉴定为 具有与对SEQ ID NO 1之DR6多肽序列观察到的亲和力不同的对APP多肽的亲和力。本发明的实施方案还提供了用于鉴定抑制DR6对APP的结合的感兴趣分子的方 法。此类方法可包括在存在或不存在感兴趣分子的情况中组合DR6和APP ；然后检测在存 在所述感兴趣分子的情况中对DR6结合APP的抑制。任选的是，使用在细胞表面上表达DR6 的哺乳动物细胞实施此类方法；并进一步包括检测对DR6活化或信号传导的抑制。本发明 的实施方案进一步包括通过此类方法鉴定的分子。任选的是，感兴趣分子是结合APP的抗 体、结合DR6的抗体或可溶性DR6多肽。本发明的实施方案还提供了能够特异性结合APP配体、DR6受体和/或能够调控与 DR6和/或其配体和/或共受体(co-receptor)有关的生物学活性、且在各种神经学病症 的治疗中有用的抗体。在具体的实施方案中，提供了特异性结合DR6多肽的胞外结构域序 列的抗体(在下文实施例中有进一步描述)。典型的抗体是那些结合APP或DR6且对抑制 DR6与APP之间的结合的能力进行了进一步选择的。任选的是，所述抗体是单克隆抗体。任 选的是，所述单克隆抗体包括由分别以编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC 的杂交瘤分泌的3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7、或1Ε5. 5. 7抗体。还提供了结合与分别以ATCC编号PTA-8095、ΡΤΑ-8094、或ΡΤΑ-8096保藏的杂交 瘤细胞系生成的3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7单克隆抗体所结合表位相同的表位的抗体。 一方面，本发明关注显示至少具有与抗体3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7相同的对DR6的亲 和力和/或展现出至少具有与抗体3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7相同的生物学活性和/或 效力的抗DR6抗体，包括3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7、或1Ε5. 5. 7抗体。在其它具体的实施方案中，提供了生成单克隆抗体3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7 且分别以编号PTA-8095、ΡΤΑ-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的杂交瘤细胞系，及由分别以 编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的杂交瘤分泌的单克隆抗体3F4. 4. 8、 4B6. 9. 7、或 1E5. 5. 7。还提供了分离的抗DR6单克隆抗体，包括结合DR6多肽且竞争性抑制由分别以 ATCC编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的杂交瘤生成的单克隆抗体结合所述DR6 多肽的抗体。还提供了嵌合的或人源化的抗DR6抗体，其特异性结合DR6多肽且包含(a) 自由分另U以编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC杂交瘤分泌的3F4. 4. 8、 4B6. 9. 7、或1E5. 5. 7抗体衍生的序列。任选的是，此类抗体可包含自3F4. 4. 8、4Β6· 9. 7、或 1Ε5. 5. 7抗体衍生的重链、轻链或可变区。又一方面，本发明关注编码本文抗DR6抗体或抗体片段的分离的核酸分子、包含 此类核酸分子的载体、包含此类核酸分子的宿主细胞、和用于生产本文抗体和抗体片段的 方法。
7
本发明进一步涉及包含本文中所定义的DR6拮抗剂和载体的组合物。所述载体可 以是药学可接受载体，而且组合物可进一步包含别的药剂。另一方面，本发明关注制品，其包括容器和装在所述容器内的组合物，其中所述组 合物包含本发明的DR6拮抗剂。所述制品可进一步包括关于在体外或在体内使用DR6拮抗 剂的说明。在一个优选的实施方案中，所述说明关注神经学病症的治疗。在一个相关方面，本发明的实施方案包括试剂盒，其包括第一容器、所述容器上的 标签、和装在所述容器内的组合物。在此类试剂盒中，所述组合物包含有效抑制至少一种类 型的哺乳动物神经元细胞中的凋亡的DR6拮抗剂，所述容器上的所述标签或包括在所述容 器中的包装插页指示所述组合物可用于抑制至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋 亡。任选的是，所述试剂盒还包括别的部件(element)，诸如装有药学可接受缓冲剂的第二 容器；和/或关于使用所述DR6拮抗剂来抑制至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋 亡的说明。本发明进一步提供了本文所述DR6拮抗剂和组合物用于制备或制造药物的用途， 所述药物用于治疗哺乳动物中的神经学病症，包括用于治疗阿耳茨海默氏病。本发明还提供一种用于筛选抑制神经元变性的化合物的方法，其中将候选化合物 添加至基于细胞的测定法，其中存在神经元变性的触发性事件，其在正常情况中会导致APP 自神经元表面脱落。如果在候选化合物存在下没有观察到脱落，那么该候选化合物是神经 元变性的抑制剂，而且可用作神经学疾病和病症诸如但不限于阿尔茨海默氏病及与损伤有 关的变性(degeneration，退化)的疗法。附图简述图IA显示了人DR6 cDNA的核苷酸序列(

图1A_1，SEQ ID NO 2)、其推导氨基酸序 列(图1A-2，SEQ ID NO 1)以及其结构域体系结构的示意图(图1A-3)。在DR6示意图中， 指示了结构域边界，包括推定的信号肽、富含半胱氨酸的结构域基序、跨膜结构域和死亡结 构域。在此示意图中，指示了推定的信号肽、富含半胱氨酸的结构域基序、跨膜结构域、和死 亡结构域的推定结构域边界。图IB显示了人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的695同等型的 cDNA的核苷酸序列(图IB-I，SEQ ID NO 5)及其推导氨基酸序列(图1B-2，SEQ ID NO 6)。图IC显示了人淀粉状蛋白前体蛋白的751同等型的氨基酸序列(SEQ ID NO :7)。图 ID显示了人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的770同等型的cDNA的核苷酸序列(图1D_1，SEQ ID NO 8)及其推导氨基酸序列(图 1D-2，SEQ ID NO 9)。参见例如 UniProtKB/Swiss-prot 条目P05067及相关公开内容，包括分别涉及同等型ID P05067-1、同等型ID P05067-4和同 等型 IDP05067-8 的(http //expasy. org/uniprot/P05067)。图2A显示了在发育阶段E10. 5-E12. 5，DR6在发育中的中枢神经系统中强表达，包 括脊髓的运动和连合神经元及背根神经节神经元。图2B显示了在轴突和细胞主体上表达 的DR6蛋白。图2C显示了在分化中的神经元中表达的DR6 mRNA。图3显示了背侧脊髓外植体存活测定法中轴突变性和神经元细胞死亡的示意图； 指示了通过电穿孔将RNA干扰siRNA剂与表达GFP的质粒一起导入胚胎连合神经元中。图4A图示了在背侧脊髓存活测定法中小干扰RNA对DR6表达的抑制阻断连合轴 突变性(commissural axon degeneration)并阻止神经元细胞死亡。图4B显示了 RNAi抗 性DR6 cDNA挽救被DR6 siRNA所阻断的变性表型。
图5显示了在背侧脊髓存活测定法中拮抗性DR6抗体帮助阻断轴突变性和神经元 细胞死亡。图6提供了神经元的机制示意图和照片，显示了在外植体存活测定法中由c-Jim N-末端激酶(JNK)的药理学抑制作用引起的DR6下游胞内信号传导的下调阻止轴突变性和 神经元细胞死亡。图7显示了在离体(ex vivo)全胚胎培养物中拮抗性DR6抗体对脊髓运动和中间 神经元(interneuron)的存活的神经保护性效果。图8提供了用经过切割的胱天蛋白酶-3抗体免疫染色的E15. 5脊髓颈段切片的 照片，以显示DR6的丢失导致DR6缺无胚胎的脊髓和背根神经节中神经元细胞死亡的降低。图9A显示了来自表达经过切割的胱天蛋白酶-3的E15. 5 DR6 KO胚胎的神经元 细胞的定量，其展示DR6缺无胚胎中的神经元细胞死亡与DR6+/-同窝出生者对照(DR6杂 合)相比降低大约50%。图9B提供了细胞的照片，显示了 DR6是运动轴突变性所需要的， 正如在存在和不存在神经营养性生长因子的情况中正常和DR6敲除小鼠的比较所证实的。 图9C提供了细胞的照片，显示了损伤诱发的轴突变性在DR6敲除小鼠中被延迟了。图IOA提供了神经元的照片，显示了抗DR6抗体抑制各种营养因子被剥夺的神经 元中由于神经因子(NGF)供应断绝所导致的轴突变性。图IOB提供了来自连合、感觉和运 动神经元中凋亡细胞主体的TUNEL染色显像的进一步照片数据，其显示了抗DR6抗体抑制 各式各样的营养因子被剥夺的神经元的变性。图IlA提供了连合神经元的照片，显示了 DR6-FC能延迟连合轴突变性。图IlB提 供了感觉神经元的照片，显示了 DR6-Fc能延迟由NGF供应断绝诱发的感觉轴突变性。图12A提供了神经元的照片，使用DR6-AP显示了轴突上的DR6结合位点。图12B 提供了在存在和不存在NGF的情况中的神经元的照片，显示了在NGF剥夺后DR6配体结合 位点自轴突丢失。图12C提供了处于发育阶段E12. 5的BAX缺无感觉轴突的研究的照片， 显示了 分泌酶(BACE)抑制剂能阻断NGF供应断绝后DR6-AP结合位点自感觉轴突的消 失。图13Α提供了自多种Western印迹规程得到的数据的照片，其中用DR6-AP (左上) 或抗N-APP抗体(右上)探查来自神经元细胞的多肽，以及如下的多肽(1)因其结合DR6 的能力而选择的；和然后的( 用抗N-APP抗体探查的(下面的，“DR6-ECD下拉”)。此数据 将淀粉状蛋白前体蛋白(APP)鉴定为DR6胞外域结合配体。图1 提供了自多种印迹实验 得到的数据的照片，其容许显现用DR6-AP探查的轴突条件培养基中的DR6配体(包括APP 多肽)。此印迹数据鉴定了许多APP多肽，包括位于35kDa的N-末端APP以及C99-APP和 C83/C89APP 多肽。图14A提供了神经元的照片，显示了 APP胞外域在NGF剥夺后不久脱落。图14B 提供了细胞的照片，显示了 DR6胞外域结合培养细胞所生成的APP。图14C提供了细胞的照 片，显示了 DR6是感觉轴突上的N-APP主要受体，而且APP结合位点在DR6缺无小鼠的神经 元细胞中被显著消减。图14D提供了细胞的照片，显示了 DR6功能阻断性抗体破坏DR6胞 外域与N-APP之间的相互作用。图15A提供了神经元的照片，显示了在连合轴突测定法中针对N-末端APP的多克 隆抗体阻断轴突变性。图15B提供了神经元的照片，显示了诊断N-末端APP的多克隆抗体以及22C11抗APP单克隆抗体抑制由NGF消除诱导的局部轴突变性。图15C提供了神经元 的照片，显示了添加N-APP能挽救被β-分泌酶(BACE)活性的抑制作用所阻断的轴突变 性。图15D提供了神经元的照片，显示了通过RNAi实现的APP消除使神经元细胞对N-APP 诱导的死亡敏感化。图16Α提供了神经元的照片，显示了 DR6功能是N-APP诱导的轴突变性所需要的， 但不是Αβ (Abeta)触发的变性所需要的。图16Β提供了神经元的照片，显示了功能阻断性 01 6抗体未能阻断4 0触发的轴突变性。图17Α提供了神经元的照片，显示了对JNK和上游胱天蛋白酶-8的抑制延迟了轴 突变性，但是下游胱天蛋白酶-3则不然。图17Β提供了来自Ε12.5外植体培养物的运动神 经元的照片，显示了胱天蛋白酶-3在细胞主体中发挥功能，而胱天蛋白酶-6在轴突中发挥 功能。图17C提供了感觉神经元的照片，显示了虽然胱天蛋白酶-3不是轴突变性所需要的， 但是BAX是所需要的。图17D提供了连合神经元的照片，显示了胱天蛋白酶-3在细胞主体 中发挥功能，而胱天蛋白酶-6在轴突中发挥功能。发明详述本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通 常利用常规方法得以采用，诸如例如广泛应用的分子克隆方法，记载于Sambrook et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual第 2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y0适当时，涉及使用市售试剂盒和试剂的规程一般依照制 造商规定的方案和/或参数进行，除非另有说明。在描述本发明的方法和测定法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法、 方案、细胞系、动物种或属、构建物和试剂，因为它们当然可以有所变化。还应当理解本文中 所使用的术语只是为了描述具体实施方案，并非意图限制本发明的范围，只有所附权利要 求才对本发明范围进行了限制。必须注意的是，在用于本文及所附权利要求时，单数形式“一个/种”、“该”和“所 述”等包括复数所指物，除非另有明确规定。如此，例如，提到“一处遗传改变”包括多处此 类改变，提到“一种探针”包括一种或多种探针及其本领域技术人员知道的等效物，诸如此 类。说明书和相关权利要求中所述所有数值(例如氨基酸22-81、1-3Μ等)理解为以术语 “约”修饰。将本文中提到的所有出版物收入本文作为参考，以披露和描述与所引用出版物有 关的方法和/或材料。引用本文中所引用的出版物是因为它们是在本申请的提交日之前公 开的。本文中的任何文字都不应解释为承认本发明的发明人没有资格凭借更早的优先权日 或在先发明日而早于所述出版物。此外，实际发表日可能与所显示的有所不同，需要独立查 证。I.定义术语“淀粉状蛋白前体蛋白”或“APP”包括由APP前mRNA所编码的多种多肽同等 型(isoform)，例如图1B-1D分别显示APP695、APP751和App770同等型(自APP前mRNA的 可变剪接转录物翻译得到的同等型)，以及APP同等型的翻译后加工部分。正如本领域已知 的，自APP基因转录得到的APP前mRNA经历外显子可变剪接以产生多种同等型(参见例如 Sandbrink 等，AnnNY Acad. Sci. 777 :281-287(1996)；及与 PubMed NCBI 蛋白编号 P05067有关的信息)。此可变外显子剪接产生695、751、和770个氨基酸的三种主要同等型(参 见例如 Kang 等，Nature 325:733-736(1987) ；Kitaguchi 等，Nature 331:530-532(1988)； Ponte 等，Nature 331 :525-527(1988)；及 Tanzi 等，Nature 331 :528-532 (1988)) 这些 同等型中的两种(App751和APP77tl)包含56个残基的插入物，其与Kunitz家族的丝氨酸蛋白 酶抑制物(KPI)高度同源且遍在表达。相反，缺乏KPI基序的较短同等型APP695主要在神 经系统中(例如在神经元和神经胶质细胞中)表达，而且为此常常称作“神经元APP”(参 见例如 Tanzi 等，Science 235 :880-884(1988) ；Neve 等，Neuron 1 :669-677(1988)；及 Haas 等，J. Neurosci. 11 :3783-3793(1991))。APP 各同等型(包括 695、751 和 770)经历 重大翻译后加工事件(参见例如Esch等，1990 Science 248 :1122-1124 ;Sisodia等，1990 Science 248 :492-495)。例如，每一种这些同等型受到多种分泌酶和/或分泌酶复合物的 切割，该事件产生APP片段，包括包含APP胞外域的N-末端分泌多肽(sAPP α和SAPP β )。 由α -分泌酶或β -分泌酶进行的切割分别导致可溶性N-末端APP多肽sAPP α和sAPP β 的产生和胞外释放，及相应膜锚定的C-末端片段C83和C99的保留。γ -分泌酶对C83的 后续加工产生Ρ3多肽。这是主要的分泌途径，而且是不产生淀粉状蛋白的。或者，早老蛋 白/呆蛋白(presenilin/nicastrin)介导的Y -分泌酶对C99的加工释放淀粉状蛋白β 多肽、淀粉状蛋白-β 40(Αβ 40)和淀粉状蛋白-β 42(Αβ 42)，即淀粉状蛋白斑块的主要成 分，及细胞毒性C-末端片段γ-CTF (50)、γ-CTF (57)和Y-CTF (59)。有证据提示每种切割 事件的相对重要性取决于细胞类型。例如，非神经元细胞优先由α-分泌酶途径加工ΑΡΡ， 其在Αβ序列内切割ΑΡΡ，由此排除Αβ的形成(参见例如hch等，1990 Science 248 1122-1124 ;Sisodia 等，1990 Science 248:492-495)。相反，神经元细胞由 β -分泌酶途 径加工APP695的大得多的部分，这通过至少两种酶类别的联合活性产生完整A β。在神经 元细胞中，β-分泌酶在Αβ结构域的氨基末端切割APP695，释放一种不同的N-末端片段 (sAPP β ) 0另外，Y-分泌酶在羧基末端的另一位点切割ΑΡΡ，产生长40个(Α β 40)或42 个(Αβ 42)氨基酸的 A β 种类(参见例如 Seubert 等，1993 Nature 361 :260-263 ；Suzuki 等，1994 Science 264:1336-1340 ；及 Turner 等，1996 J. Biol. Chem. 271 :8966-8970)。术语“APP”、“APP蛋白”和“APP多肽”在用于本文时涵盖天然APP序列和APP变 体及其加工片段。这些术语涵盖在多种哺乳动物(包括人)中表达APP。APP可以是内源表 达的，正如在多种人组织谱系中所天然发生的，或者可以是通过重组或合成方法而表达的。 “天然序列APP”包括与衍生自自然界的APP具有相同氨基酸序列的多肽(例如695、751和 770同等型及其加工部分)。如此，天然序列APP可具有来自任何哺乳动物(包括人)的天 然存在APP的氨基酸序列。此类天然序列APP可以从自然界分离，或者可通过重组或合成 手段生成。术语“天然序列APP”明确涵盖天然存在的加工和/或分泌形式的(例如包含例 如胞外结构域序列的可溶形式)、天然存在变体形式(例如可变剪接和/或蛋白水解加工形 式)和天然存在等位变体。APP变体可包括天然序列APP的片段或删除突变体。在本发明的实施方案中有用的APP多肽包括那些上文和如下非限制性例子中所 描述的。可以选择这些例示形式，用于本发明的各个实施方案。在本发明的有些实施方案 中，APP多肽包含全长APP同等型，诸如图1B-1D所示APP695和/或APP751和/或APP77tl同等 型。在本发明的其它实施方案中，APP多肽包含APP的翻译后加工形式，例如经历了分泌酶 (诸如α -分泌酶、β -分泌酶或 -分泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，诸如sAPPa或sAPPii)。在本发明的相关实施方案中，可以选择APP多肽，以包含一个或多 个特定结构域，诸如N-末端胞外域(参见例如Quast等，FASEB J. 2003 ；17(12) :1739-41), 肝素结合结构域(参见例如 Rossjohn 等，Nat. Struct. Biol. 1999Apr ；6 (4) :327-31)、铜 II 型(参见例如 Hesse 等，FEBS Letters 349(1) :109-116(1994))或 Kunitz 蛋白酶抑制剂 结构域(参见例如Ponte等，Nature ；331 (6156) :525-7 (1988))。在本发明的有些实施方 案中，APP多肽包含观察到包含受到本文中所公开的DR6拮抗剂(诸如抗体或DR6免疫粘 附素)识别的表位的序列，例如APP695的氨基酸22-81，一种包含单克隆抗体22C11所结合 的表位的序列(参见例如 Hilbich 等，J. Biol. Chem. 268(35) :26571-26577 (1993))。在本发明的某些实施方案中，APP多肽不包含一种或多种特定结构域或序列，例如 不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例如实施例12中公开的人重组N-APP 多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的APP多肽(例如APP695)、或不包含阿耳茨海 默氏病β淀粉状蛋白(Abeta (Α β ))序列的APP多肽(例如sAPP β，一种不包含A β 4。禾口 / 或 Αβ42 序列的多肽)(参见例如 Bond 等，J. Struct Biol. 2003 Feb ； 141 (2) :156-70)。 在本发明的其它实施方案中，本发明的实施方案中所使用的APP多肽包含一种或多种结构 域或序列但不包含其它结构域或序列，例如包含N-末端胞外域(或至少其观察到受到DR6 拮抗剂(诸如单克隆抗体22C11)结合的部分)但不包含一个或多个分泌酶切割位点C端 的结构域或序列(诸如β淀粉状蛋白(Α β，Abeta)序列)的APP多肽(例如sAPP α或 sAPPβ)。术语“胞外结构域”、“胞外域”或“ECD”指APP基本上不含跨膜结构域和胞质结构 域的形式。可溶性ECD通常将具有少于的所述跨膜结构域和胞质结构域，优选将具有少 于0.5%的所述结构域。可以理解，为本发明多肽鉴定的任何跨膜结构域是依照本领域常规 用于鉴定该种类型疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有 可能的是最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。在优选的实施方案中，ECD将 由多肽不含跨膜结构域和胞质或胞内结构域的(而且不是膜结合的)可溶性胞外结构域序 列组成。术语“ APP变体”意指如下文所定义的、与具有图1B-1D所示氨基酸序列的人APP具 有至少约80%，优选至少约85%、86%、87%、88%、89%，更优选至少约90%、91%、92%、 93%、94%，最优选至少约95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的APP多肽，或 其可溶性片段，或其可溶性胞外结构域。此类变体包括例如在图1B-1D全长或成熟序列的 N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的APP多肽或者在多肽的内部序列或结构 域中插入或删除一个或多个氨基酸残基的APP多肽，包括来自其它物种的变体，但排除天 然序列APP多肽。“DR6”或“DR6受体”包括本领域所指的其多核苷酸和多肽序列如图1Α_1至1Α_2 所示的受体。Pan等人记载了称作“DR6”或“TR9”的TNF受体家族成员的多核苷酸和多肽 序列(Pan等，FEBS Lett.，431 :351-356(1998)；还可参见美国专利6，；358，508 ；6，667，390 ； 6，919，078 ；6, 949，358)。人DR6受体是655个氨基酸的蛋白质(见图1A-2)，其具有推定的 信号序列(氨基酸1-41)、胞外结构域(氨基酸42-349)、跨膜结构域(氨基酸350-369)、接 着是胞质结构域(氨基酸370-65 。术语“DR6受体”在用于本文时涵盖天然序列受体和 受体变体。这些术语涵盖在多种哺乳动物(包括人)中表达的DR6受体。DR6受体可以是内源表达的，正如在多种人组织谱系中天然存在的，或者可以是通过重组或合成方法而表 达的。“天然序列DR6受体”包括与衍生自自然界的DR6受体具有相同氨基酸序列的多肽。 如此，天然序列DR6受体可具有来自任何哺乳动物(包括人)的天然存在DR6受体的氨基 酸序列。此类天然序列DR6受体可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术 语“天然序列DR6受体”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的受体(例如包含例如胞外 结构域序列的可溶形式)、天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体。 受体变体可包括天然序列DR6受体的片段或删除突变体。术语“胞外结构域”、“胞外域”或“ECD”指DR6受体基本上不含跨膜结构域和胞质 结构域的形式。可溶性ECD通常将具有少于的所述跨膜结构域和/或胞质结构域，优选 将具有少于0.5%的所述结构域。可以理解，为本发明多肽鉴定的任何跨膜结构域是依照 本领域常规用于鉴定该种类型疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变 化，但最有可能的是最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。在优选的实施方案 中，ECD将由多肽不含跨膜结构域和胞质或胞内结构域的(而且不是膜结合的)可溶性胞 外结构域序列组成。术语“DR6变体”意指如下文所定义的，与具有图IA所示推导氨基酸序列的人 DR6具有至少约80 %，优选至少约85%、86 %、87%、88 %、89%，更优选至少约90 %、91 %、 92%,93%,94%,最优选至少约95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的DR6多 肽，或其可溶性片段，或其可溶性胞外结构域。此类变体包括例如在图IA全长或成熟序列 的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的DR6多肽或者在多肽的内部序列或结 构域中插入或删除一个或多个氨基酸残基的DR6多肽，包括来自其它物种的变体，但排除 天然序列DR6多肽。任选的是，DR6变体包括包含图IA氨基酸1-349或42-349及至多10 处保守氨基酸替代的可溶形式DR6受体。优选的是，此类变体起DR6拮抗剂的作用，如下文 所定义的。术语“DR6拮抗剂”以最广义使用，包括任何在体外、原位、在体内或回体(ex vivo) 部分或完全阻断、抑制、或中和DR6受体结合其关联配体(优选其关联配体APP)，或者激 活神经元细胞或组织中的一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径之能力的分子。举例 而言，DR6拮抗剂可部分或完全阻断、抑制、或中和DR6受体激活导致神经元细胞或组织中 凋亡或细胞死亡的神经元细胞或组织中一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力。 DR6拮抗剂可通过多种机制来起部分或完全阻断、抑制、或中和DR6的作用，包括但不限于 通过阻断、抑制、或中和关联配体对DR6的结合、DR6与其关联配体(例如APP)间复合物的 形成、DR6受体的寡聚化、DR6受体与异源共同受体间复合物的形成、关联配体对DR6受体 /异源共同受体复合物的结合、或DR6受体、异源共同受体、及其关联配体间复合物的形成。 DR6拮抗剂可以以直接或间接方式发挥功能。本发明所涵盖的DR6拮抗剂包括但不限于APP 抗体、DR6抗体、免疫粘附素、DR6免疫粘附素、DR6融合蛋白、共价修饰形式DR6、DR6变体及 其融合蛋白、或高级寡聚物形式DR6 ( 二聚体、聚集体)、或同聚物或异聚物形式DR6、小分子 (诸如JNK信号传导级联的药理学抑制物，包括Jim N-末端激酶JNK活性的小分子和肽抑 制物)、在信号转导途径中在JNK上游发挥功能的蛋白激酶MLK和MKK活性的药理学抑制 物、JNK结合支架蛋白JIP-I的药理学抑制物、JNK结合其底物(诸如c-Jim或AP-I转录 因子复合物)的药理学抑制物、JNK介导的其底物(诸如JNK结合域(JBD)肽)和/或JNK的底物结合域的磷酸化的药理学抑制物和/或包含JNK底物磷酸化位点的肽抑制物、阻断 ATP结合JNK的小分子、和阻断底物结合JNK的小分子。为了测定DR6拮抗剂是否部分或完全阻断、抑制或中和DR6受体激活神经元细胞 或组织中的一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力，可实施测定法来评估DR6拮 抗剂对例如各种神经元细胞或组织的影响(如实施例中所述)，以及在中风/脑缺血的体 内模型、神经变性性疾病的体内模型(诸如帕金森氏病的小鼠模型、阿耳茨海默氏病的小 鼠模型、肌萎缩性侧索硬化ALS的小鼠模型、脊髓性肌萎缩SMA的小鼠模型、局灶性和整体 性脑缺血的小鼠/大鼠模型(例如常见的颈动脉闭塞模型或大脑中动脉闭塞模型)中、或 在离体(ex vivo)全胚胎培养物中。可以以已知的体外或体内测定格式来实施各种测定 法，诸如下文描述的或如本领域已知的和文献中记载的(参见例如McGowan等，Trends in Genetics, 22 :281-289(2006) ；Fleming 等，NeuroRx,2 :495-503(2005) ；Wong 等，Nature Neuroscience,5 =633-639 (2002)) 0用于测定DR6拮抗剂是否部分或完全阻断、抑制或中和 DR6受体激活神经元细胞或组织中一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力的测定 法的一个实施方案包括在存在或不存在DR6拮抗剂或潜在DR6拮抗剂(即感兴趣分子)的 情况中将DR6和APP组合，然后在存在此DR6拮抗剂或潜在DR6拮抗剂的情况中检测对DR6 结合APP的抑制。“核酸”意图包括任何DNA或RNA，例如组织样品中存在的染色体、线粒体、病毒和 /或细菌核酸。术语“核酸”涵盖双链核酸分子的两条链或其中之一，包括完整核酸分子的 任何片段或部分。“基因”意指在编码或转录蛋白质或调控其它基因表达方面具有功能性作用的任 何核酸序列或其部分。基因可以完全由负责编码功能性蛋白质的核酸组成，或者只有部分 核酸负责编码或表达蛋白质。核酸序列可以在基因的外显子、内含子、起始或终止区、启动 子序列、其它调控序列或独特邻近区中包含遗传异常。术语“氨基酸”指所有天然存在的L-α -氨基酸。此定义意图包括正亮氨酸、鸟氨 酸和高半胱氨酸。氨基酸通过单字母或三字母标示鉴别AspD天冬氨酸IleI异亮氨酸
ThrT苏氨酸LeuL亮氨酸
SerS丝氨酸TyrY酪氨酸
GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸
ProP脯氨酸HisH组氨酸
GlyG甘氨酸LysK赖氨酸
AlaA丙氨酸ArgR精氨酸
CysC半胱氨酸TrpW色氨酸
ValV缬氨酸GlnQ谷氨酰胺
MetM甲硫氨酸AsnN天冬酰胺在附图中，可采用某些其它单字母或三字母标示来指向和鉴定序列中给定位置处 的两种或多种氨基酸或核苷酸。“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种肽或蛋白质时，意指已经鉴定且与/由 其天然环境的一种成分分开和/或回收的肽或蛋白质。肽或蛋白质的天然环境的污染性成分指通常会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质 性质的溶质。在优选的实施方案中，将肽或蛋白质纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪 获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或( 根据使用考马斯蓝或优选 银染色的非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质，或C3)根据质谱或肽作图技术， 达到同质。既然肽或蛋白质的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的物质包括重 组细胞内的原位肽或蛋白质。然而，分离的肽或蛋白质通常通过至少一个纯化步骤来制备。关于本文中所鉴定的序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定义为对比序列 并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一 性的一部分，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以以 本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性。本领域技术 人员可决定测量序列对比的适宜参数，包括指派对所比较的全长序列获得最大对比所需的 算法。为了本发明，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2来获得百分比氨基酸序列同一性 值，ALIGN-2程序由Genentech公司编写，其源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权 局(US Copyright Office，Washington，DC，20559)，并以美国版权注册号 TXU510087 注册。 公众可通过Genentech公司(South San Francisco, CA)得到ALIGN-2程序。所有序列比 较参数由ALIGN-2程序设定且不变。杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针 长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火， 而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中 时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同一性程度越高，可使用的相 对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也 就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)。“高严格性条件”，如本文中所定义的，通过如下各项定义(1)采用低离子强度和 高温进行清洗；0. 015M氯化钠/0. 0015M柠檬酸钠/0. 十二烷基硫酸钠，于50°C ； (2)在 杂交过程中采用变性剂；50% (ν/ν)甲酰胺及0. 牛血清清蛋白/0. l%Ficoll/0. 聚 乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6. 5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42°C ；或(3) 采用 50% 甲酰胺，5x SSC (0. 75M NaCl，0. 075M 柠檬酸钠)，50mM 磷酸钠(pH 6. 8)，0.1%焦 磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA (50 μ g/ml)，0. SDSjP 10%硫酸右 旋糖苷，于42 °C，及于42 °C在0. h SSC (氯化钠/柠檬酸钠)和50 %甲酰胺中于55 °C清洗， 接着于55°C在含EDTA的0. Ix SSC中进行高严格性清洗。“中等严格条件，，可以如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A LaboratoryManual, New York, Cold Spring Harbor Press (1989)中所述鉴定，包括于 37°C在含 20% 甲酰胺， 5x SSC(150mM NaCl，15mM 柠檬酸三钠)，50mM 磷酸钠(pH 7. 6)，5x Denhardt 氏溶液，10% 硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37_50°C在 Ix SSC中清洗滤膜。技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探 针长度等因素。术语“引物”指与互补RNA或DNA靶多核苷酸杂交并充当通过核苷酸转移酶的作 用从单核苷酸逐步合成多核苷酸的起点(如例如聚合酶链反应中所发生的)的寡核苷酸序列。术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA 序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位 点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。 例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分 泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编 码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它 与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且 在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过 在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核 苷酸衔接头或接头。术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融 合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的 (例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底 物化合物或组合物的化学改变。在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与 免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同 于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免 疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配 体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫 球蛋白获得，诸如 IgG-l、IgG-2、IgG-3 或 IgG_4 亚型、IgA (包括 IgA-I 和 IgA_2)、IgE、IgD 或1#。"DR6受体抗体”、“DR6抗体”、或“抗DR6抗体”以广义使用，指结合至少一种形式 DR6受体(优选人DR6受体，诸如图IA所示DR6序列)或其胞外结构域序列的抗体。任选 的是，DR6抗体与异源序列或分子融合或连接。优选的是，异源序列允许或帮助抗体形成更 高等级或寡聚复合物。术语“抗DR6抗体”及其语法等同物具体涵盖下文实施例部分中所 描述的DR6单克隆抗体。任选的是，DR6抗体结合DR6受体但不与任何其它肿瘤坏死因子家 族受体Ufi^nDR4、DR5、TNFRl、TNFR2、Fas)结合或发生交叉反应。任选的是，根据BIAcore 结合测定法的测量，本发明的DR6抗体在约0. 067 μ M到约0. 033 μ M的浓度范围内结合DR6 受体。术语“抗APP抗体”、“ΑΡΡ抗体”及语法等同物以广义使用，指结合至少一种形式 APP (优选人ΑΡΡ，诸如本文具体所述APP多肽同等型)的抗体。优选的是，APP抗体是DR6 拮抗性抗体。例如，在本文中所公开的用于生成和/或鉴定DR6拮抗剂的方法中，可以使用 APP和/或其一部分的一种或多种同等型作为免疫原来免疫动物(例如小鼠，作为生成单克 隆抗体的过程的一部分)和/或作为探针来筛选化合物文库(例如重组抗体库)。在本发 明的实施方案中有用的典型APP多肽包括如下非限制性例子。可以选择这些例示形式，用 于本发明的各个实施方案。在本发明的有些实施方案中，APP多肽包含全长APP同等型，诸 如图1所示APP695和/或APP751和/或APP77tl同等型。在本发明的其它实施方案中，APP多肽包含APP的翻译后加工形式，例如经历了分泌酶(诸如α-分泌酶、β-分泌酶或Y-分 泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，诸如sAPP α或sAPP β )。在本发明的相 关实施方案中，可以选择APP多肽，以包含一个或多个特定结构域，诸如N-末端胞外域(参 见例如Quast等，FASEB J. 2003 ；17(12) :1739-41)、肝素结合结构域(参见例如Rossjohn 等，Nat. Struct. Biol. 1999 Apr ；6 (4) :327-31)、铜 II 型(参见例如 Hesse 等，FEBSLetters 349(1) :109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制剂结构域(参见例如Ponte等，Nature ； 331 (6156) :525-7(1988))。在本发明的有些实施方案中，APP多肽包含观察到包含受到本 文中所公开的DR6拮抗剂(诸如抗体或DR6免疫粘附素)识别的表位的序列，例如APP695 的氨基酸22-81，一种包含单克隆抗体22C11所结合的表位的序列(参见例如Hilbich等， J.Biol. Chem. 268(35) :26571-26577 (1993))。在本发明的某些实施方案中，APP多肽不包 含一种或多种特定结构域或序列，例如不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例 如实施例12中公开的人重组N-APP多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的APP多 肽(例如APP695)、或不包含阿耳茨海默氏病β淀粉状蛋白(Abeta，Αβ)序列的APP多肽 (例如sAPP β，一种不包含A β 40禾口 /或A β 42序列的多肽)(参见例如Bond等，J. Struct Biol.2003Feb ； 141 (2) :156_70)。在本发明的其它实施方案中，本发明的实施方案中所使 用的APP多肽包含一种或多种结构域或序列但不包含其它结构域或序列，例如包含N-末端 胞外域(或至少其观察到受到DR6拮抗剂(诸如单克隆抗体22C11)结合的部分)但不包 含一个或多个分泌酶切割位点C端的结构域或序列(诸如β淀粉状蛋白(Αβ)序列)的 APP多肽(例如sAPP α或sAPP β )。任选的是，抗APP抗体会抑制APP多肽对DR6的结合， 而且会在10 μ g/ml至50 μ g/ml的浓度结合至APP多肽，如本文中所描述的和/或如定量 的基于细胞的结合测定法中所测量的。术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由 至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现 出期望的生物学活性。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含抗体的抗原结合区或可变区。抗体 片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由 抗体片段形成的多特异性抗体。“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约 150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的 数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二 硫键。每条重链在一端具有一个可变域(Vh)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一 个可变域(VJ，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而 轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之 间形成界面。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定 抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可 变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区或互补决定区的三个区段。可变域中更 加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大 多采取折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的 高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效 应器功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有 一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶 处理产生一个F (ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共 价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变 域的三个高变区相互作用而在Vh-Vl 二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个高变区 一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的 三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab'片段与Fab片段 的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个 或多个半胱氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇 基的Fab'的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在成对Fab‘片段之间有铰链半胱氨酸 的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻 链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体可归入不同的类。完整抗体有五大类IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl和IgA2。将与不同类的抗体对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y和μ。不同类 的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于 一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在Vh与\结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv 能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见PlUckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编，Springer-Verlag, New York, 第 269-315 页，1994。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链 (Vh-Vl)中包含相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域。通过使用过短的接头使得同一条 链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产 生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993)。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体 是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不 同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它 们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为 要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首 次由Kohler等(197 Nature 256 :495记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA 方法来制备(参见例如美国专利No. 4，816，567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson 等(1991)Nature352 :624-6 及 Marks 等(1991) J. Mol. Biol. 222 :581-597 中记载的技术 从噬菌体抗体库分离。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的 一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而 链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或 同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4，816，567 ； Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。本文中感兴趣的嵌合抗 体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒、 恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体(美国专利 No. 5，693, 780)。非人(例如鼠)抗体的“人源化式指以最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残 基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵 长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR) 残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有 找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含 至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人 免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任 选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参 见 Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-329(1988)；禾口 Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包 含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(Ll)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)及重链可变域中的残基 31-35 (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3)； Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))和 / 或那些来自“高 变环”的残基(例如轻链可变域中的残基^-32(L1)、50-52(I^)和91-96 (U)及重链可变 域中的残基 26-32 (HI)、53-55(H2)和 96_101(H3) ；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的 残基。“结合”目的抗原的抗体指能够以足够亲和力和/或亲合力结合该抗原，使得该抗 体可作为治疗剂或诊断剂用于靶向表达该抗原的细胞的抗体。为了本发明，“免疫疗法”指用抗体治疗哺乳动物(优选人类患者)的方法，其中抗 体可以是未偶联的或“裸露的”抗体，或者抗体可以偶联或融合有异源分子或试剂，诸如一 种或多种细胞毒剂，由此产生“免疫偶联物”。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其 天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其 它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry 法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得 至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或C3)根据还原性或非还原性条件下 的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成 分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至 少一个纯化步骤来制备。术语“带标签的”在用于本文时指包含抗体或多肽且其与“标签多肽”融合的嵌合 分子。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体或者提供一些其它功能诸 如寡聚的能力(例如具有亮氨酸拉链结构域的肽所发生的)，但又足够短使得其不干扰所 述抗体或多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得标签特异性抗体基本上不与其 它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常约8个到约50 个氨基酸残基之间(优选约10个到约20个残基之间)。术语“Fe受体”或“FcR”用于描述能结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然 序列人FcR。此外，优选的FcR是能结合IgG抗体的FcR (γ受体)，包括Fc γ RI、Fc γ RII、 和Fc γ RIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括 Fc y RIIA ( “活化受体”)和FcyRIIB( “抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别 主要在于其胞质结构域。活化受体Fc y RIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸 的活化基序(ITAM)。抑制受体Fc γ RIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的 抑制基序(ITIM)(参见Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997))。FcR 的综述参 见 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-492(1991) ；Capel 等，Immunomethods 4 :25-34(1994)；及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-341 (1995)。术语“FcR” 在本 文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，Fcto，其负责 将母体 IgG 转移给胎儿(Guyer 等，J. Immunol. 117 :587(1976)及 Kim 等，J. Immunol. 24 249 (1994) )。FcR在本文中包括多态性，诸如编码Fc γ RIIIa的基因中导致位于受体 能结合IgGl的区域中第158位氨基酸或为苯丙氨酸(F)或为缬氨酸(V)的遗传二态 性。纯合缬氨酸FCYRIIIa(FCYlIIa-158V)已经在体外显示出相对于纯合苯丙氨酸 FcyRIIIa(FcyRIIIa-158F)或杂合(Fe y IIIa-158F/V)受体具有更高的对人IgGl的亲和 力且介导升高的ADCC。术语“多元醇”在用于本文时泛指多羟基醇化合物。多元醇可以是例如任何水溶 性聚(亚烷基氧化物)聚合物，而且可具有线性链或分支链。优选的多元醇包括那些在一 个或多个羟基位置用化学基团诸如具有1至4个碳的烷基取代的多元醇。典型的是，多元 醇是聚(亚烷基二醇)，优选聚(乙二醇)(PEG)。然而，本领域技术人员认识到，其它多元 醇诸如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中关于PEG描述的偶联技术得 以采用。多元醇包括本领域众所周知的那些类型以及可公开获得的那些类型，诸如从商业 来源获得，诸如Nektar 公司。术语“偶联”(conjugate)在本文中依照其最广泛的定义使用，指接合或连接到一 起。若分子像接合在一起时那样起作用或运作，则它们是“偶联”的。
表述“有效量”指药剂(例如DR6拮抗剂等)有效预防、缓解或治疗所讨论病症或 疾患的量。本发明的DR6拮抗剂在减缓或终止变性性神经学病症的进展中或者在增强受损 神经元细胞或组织的修复和帮助恢复正确神经功能中会是有用的。术语“处理”、“治疗”和“疗法”在用于本文时指治疗性处理、预防性处理、和防范 性处理。连续治疗或施用指以至少每天一次为基础、期间没有中断一天或多天的处理。间 歇治疗或施用或者间歇方式的治疗或施用指本质上并非连续而是循环的处理。在用于本文时，术语“病症”一般指任何会受益于本文所述DR6拮抗剂治疗的疾 患。这包括慢性和急性病症，以及那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。“神经元细胞或组织”一般指运动神经元、中间神经元(包括但不限于连合神经 元)、感觉神经元(包括但不限于背根神经节神经元)、黑质的多巴胺(DA)神经元、纹状体 DA神经元、皮层神经元、脑干神经元、脊髓中间神经元和运动神经元、海马神经元(包括但 不限于海马的CAl锥体神经元)、和前脑神经元。术语神经元细胞或组织在本文中意图指由 细胞体、轴突和树突组成的神经元细胞，以及指可形成此类神经元细胞一部分的轴突或树 突。“神经学病症”在本文中用于指包括神经变性性疾患、以中枢或周围神经系统的 功能障碍或以神经元细胞或组织的坏死和/或凋亡为特征的神经元细胞或组织损害损 伤、及与营养因子剥夺有关的神经元细胞或组织损伤在内的疾患。神经变性性疾病的例 子包括家族性和散发性肌萎缩性侧索硬化(分别为FALS和ALQ、家族性和散发性帕金 森氏病、亨庭顿氏病(亨廷顿舞蹈症)、家族性和散发性阿耳茨海默氏病、脊髓性肌萎缩 (SMA)、视神经病(opticalneuropathies)(诸如青光眼或涉及视网膜变性、糖尿病神经病 变、或黄斑变性的伴生疾病(associated disease))、由于内耳感觉细胞或神经元变性引 起的听力损失、癫痫、贝耳氏麻痹(Bell’ s palsy)、与染色体17连锁的伴有帕金森综合征 (parkinsonism)的额颞痴呆(FTDP-17)、多发性硬化、弥漫性大脑皮层萎缩、Lewy小体痴 呆、皮克病(Pick disease)、三核苷酸重复病(trinucleotide!·印eat disease)、朊病毒病 症(prion disorder)、和夏德二氏综合征(Shy-Dragersyndrome)。神经元细胞或组织损伤 可源自危及神经元细胞或组织的存活或正确功能的多种不同原因，包括但不限于源自例 如限制(暂时地或永久地)血流的缺血状况的急性和非急性损伤，就像在整体性和局灶性 脑缺血(中风)中那样；对例如大脑组织或脊髓的切口或切伤；神经元组织中的损害或斑 块(placques)；对细胞的生长和存活所需要的营养因子的剥夺；暴露于神经毒素，诸如化 疗剂；以及偶发的其它疾病状态(incidental to other disease states)诸如慢性代谢病 诸如糖尿病或肾功能不全。“受试者”或“患者”指需要治疗的任何单个受试者，包括人。还意图作为受试者包 括的有参加临床研究试验而没有显示出任何疾病临床征候的任何受试者、参加流行病学研 究的受试者、或作为对照的受试者。术语“哺乳动物”在用于本文时指归入哺乳类的任何哺乳动物，包括人、牛、马、犬、 和猫。在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物指人。II.本发明的例示性方法和材料先前的研究检验了神经系统发育过程中的细胞死亡现象(Hamburger等， J.Neurosci.，1 :60-71 (1981) ；Oppenheim, Ann.Rev. Neurosci.，14 :453-501 (1991)；0' Leary 等，T. Neurosci. , 6 3692-3705 (1986) ；Henderson 等，Nature, 363 266-270(1993) Yuen 等，Brain Dev. ,18 :362-368 (1996))。认为神经元细胞的死亡在多种 神经学病症(诸如家族性和散发性肌萎缩性侧索硬化(分别为FALS和ALQ、家族性和散发 性帕金森氏病、亨庭顿氏病、家族性和散发性阿耳茨海默氏病和脊髓性肌萎缩(SMA))的形 成和 / 或进展中发挥作用(Price 等，Science, 282 1079-1083 (1998))。申请人:出人意料地发现DR6 (TNFR家族的一个成员)在胚胎和成人中枢神经系统 (包括大脑皮层、海马、运动神经元和脊髓的中间神经元)中高度表达。如下文实施例中所 述，申请人进行了多种实验测定法来检验DR6作为神经元细胞存活或死亡的调节物可能发 挥的作用。连合神经元的存活依赖来自其中间靶物之一(脊髓的底板)的营养支持。在体外 外植体培养物中，申请人发现通过RNA干扰来抑制DR6表达阻断连合神经元的轴突变性。还 在背侧脊髓存活测定法中测试了抗DR6单克隆抗体，确定了通过DR6特异性抗体3F4. 4. 8、 4B6. 9. 7和1E5. 5. 7抑制DR6受体信号传导阻止体外外植体培养物中连合神经元的轴突变 性。已经在文献中报道了 DR6经JNK的活化来发信号(Pan等，见上文1998 Jhao等，见上 文2001)。因而，为了调查DR6-JNK信号传导在轴突变性中的作用，进行了背侧脊髓存活测 定法，其中用肽抑制剂L-JNK-I阻断连合神经元中的JNK信号传导途径。此JNK信号传导 抑制部分阻断背侧脊髓存活测定法中的轴突变性。如此，认为DR6至少部分经JNK途径发 出轴突变性过程信号。为了更好地理解发育过程中DR6在神经元细胞死亡的调节中的生理 作用，在全胚培养系统中用抗DR6抗体阻断DR6信号传导。惊人的是，某些DR6特异性抗体 对DR6信号传导的抑制在此系统中针对天然发生的发育性细胞死亡保护脊髓神经元。因 此，DR6拮抗剂(诸如DR6拮抗性抗体)可用于降低神经学病症(诸如神经变性性病症，例 如ALS、SMA、阿耳茨海默氏病、和帕金森氏病、FTDP-17、亨庭顿氏病)和中风中发生的神经 元细胞死亡。为了检验DR6在体内是否真正地发挥促凋亡受体的功能，申请人分析了处于 发育阶段E15. 5的DR6敲除胚的表型。与DR6作为神经元细胞存活的负调节物的作用一致， 在DR6缺失脊髓和背根神经节中检测到与DR6杂合同窝出生者对照相比神经元细胞死亡降 低大约40%至50%。申请人:还出人意料地发现淀粉状蛋白前体蛋白(APP)是DR6受体的关联配体， 而且APP发挥经DR6受体触发轴突变性的功能。先前假设淀粉状蛋白前体蛋白在阿耳茨 海默氏病中发挥一些尽管没有完全了解的作用(Selkoe, J.Biol. Chem. 271 :18295(1996)； Scheuner ；等，Nature Med. 2 :864(1996) ；Goate，等，Nature 349 :704(1991))。认为DR6拮抗剂在治疗各种神经学病症中会是尤其有用的。本发明因而提供了 DR6拮抗剂组合物和用于在哺乳动物中抑制、阻断和中和DR6活性的方法，包括施用有效量 的DR6拮抗剂。优选的是，所采用的DR6拮抗剂量会是有效阻断轴突变性和神经元细胞死 亡的量。这可以依照例如下文和实施例中所描述的方法来实现。所述方法中可采用的DR6拮抗剂包括但不限于DR6和/或APP免疫粘附素、包含 DR6和/或APP的融合蛋白、DR6和/或APP的共价修饰形式、DR6和/或APP变体、其融合 蛋白、及DR6和/或APP抗体。本文中描述了可用于生成拮抗剂的多种技术。例如，描述了 用于制备DR6和APP多肽的方法和技术。还描述了 DR6和APP多肽的进一步修饰、及针对 DR6和APP的抗体。本文中所公开的方法具有许多实施方案。本发明提供了抑制DR6结合APP的方法，包括在DR6对APP的结合受到抑制的条件下将DR6多肽和/或APP多肽暴露于一种或多种 DR6拮抗剂。本发明的相关实施方案提供了抑制对包含SEQ ID NO 1氨基酸1-655的DR6 多肽和包含SEQ ID NO 6氨基酸66-81的APP多肽(例如sAPP β )的结合的方法，该方法 包括将DR6多肽和APP多肽与结合DR6或APP的分离的拮抗剂组合，其中所述分离的拮抗 剂选自结合APP的抗体、结合DR6的抗体和包含SEQ ID NO 1氨基酸1-354的可溶性DR6 多肽中的至少一种；且所述分离的拮抗剂是根据其抑制DR6和APP结合的能力选择的；使 得DR6对APP的结合受到抑制。任选的是，在此类方法中，一种或多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体(例如竞争 性抑制由分别以ATCC编号ΡΤΑ-8095、ΡΤΑ-8094、或ΡΤΑ-8096保藏的杂交瘤细胞系生成的 3F4. 4. 8、4Β6. 9. 7、或1Ε5. 5. 7单克隆抗体的结合的结合DR6的抗体)、包含SEQ ID Ν0:1氨 基酸1-354的可溶性DR6多肽(例如DR6免疫粘附素)、或结合APP的抗体(例如单克隆抗 体22C11)。在本发明的某些实施方案中，DR6拮抗剂是连接至一种或多种选自下组的非蛋 白质性质聚合物的结合DR6的抗体、结合APP的抗体或可溶性DR6多肽聚乙二醇、聚丙二 醇、和聚氧化烯。在这些方法的任选实施方案中，DR6多肽是在一种或多种哺乳动物细胞(例如连 合神经元细胞、感觉神经元细胞或运动神经元细胞)的细胞表面上表达的，而且所述一种 或多种DR6拮抗剂的结合抑制DR6活化或信号传导。在本发明的一个此类实施方案中，所 述方法是在体外实施的，用以抑制一种或多种表达DR6的哺乳动物细胞中的凋亡，从而增 强组织培养物中神经元细胞的生长和/或再生和/或存活。举例而言，此类DR6拮抗剂作为 组织培养基(例如那些设计用于繁殖神经元细胞培养物的)的体外添加剂是有用的。具体 而言，正如本领域已知的，某些神经元细胞培养物的繁殖可能由于此类细胞经历凋亡的倾 向而成问题。例如，有些神经元培养物在缺乏外源因子(诸如神经生长因子)时死亡。本文 中所提供的公开内容显示了 DR6拮抗剂可用于此类神经元细胞培养物以增强细胞生长和/ 或再生和/或存活，例如以与此类培养物中神经生长因子的使用类似的方式进行。在本发明的其它实施方案中，可以在患有神经学疾患或病症的哺乳动物中体内实 施抑制DR6结合APP的方法。任选的是，神经学疾患或病症是肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏 病、亨庭顿氏病或阿耳茨海默氏病。或者，神经学疾患或病症包括源自中风、对大脑或脊髓 组织的创伤、或神经元组织中的损害的神经元细胞或组织损伤。本发明的其它实施方案提供了治疗患有神经学疾患或病症的哺乳动物的方法，包 括对所述哺乳动物施用有效量的一种或多种DR6拮抗剂。典型的是，在此类方法中，一种或 多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体、包含SEQ IDNO 1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、 和结合APP的抗体。在本发明的任选实施方案中，神经学疾患或病症是肌萎缩性侧索硬化、 帕金森氏病、亨庭顿氏病或阿耳茨海默氏病。或者，神经学疾患或病症包括源自中风、对大 脑或脊髓组织的创伤、或神经元组织中的损害的神经元细胞或组织损伤。在本发明的各种 实施方案中，对所述哺乳动物施用一种或多种别的治疗剂。在本发明的某些例示性实施方 案中，所述一种或多种别的治疗剂选自NGF、凋亡抑制剂、EGFR抑制剂、β -分泌酶抑制剂、 Y-分泌酶抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、抗Αβ (Abeta)抗体和NMDA受体拮抗剂。任选的是，所 述一种或多种DR6拮抗剂和/或别的治疗剂是经注射、输注或灌注施用于哺乳动物的。 本发明的其它实施方案提供了鉴定抑制DR6结合APP的感兴趣分子的方法，该方法包括在存在或不存在感兴趣分子的情况中组合DR6和APP，然后检测在存在所述感兴趣 分子的情况中对DR6结合APP的抑制。本发明的相关实施方案提供了确定某组合物是否调 控包含SEQ ID NO :1氨基酸1-655(和任选的SEQ ID NO :1氨基酸1-354)的DR6多肽和包 含SEQ ID NO 6氨基酸66-81的APP多肽(例如APP695、sAPP α或SAPP β )之间结合的方 法，该方法包括将组合物与DR6和APP组合，然后将存在该组合物时的DR6和APP之间的结 合与不存在该组合物时的DR6和APP之间的结合进行比较，由此确定该组合物是否调控DR6 和APP之间的结合。任选的是，此类方法中的结合差异通过表面等离振子共振(SPR)技术 (例如可自Biacore Life kiences获得的)来测量。本发明的实施方案进一步包括依照 这些方法鉴定的感兴趣分子。本发明的其它实施方案包括诊断患有神经学病症的或对神经学病症易感的患者 的方法，包括自所述患者获取样品并对所述样品测试具有与SEQ IDNO :1之DR6多肽序列不 同的多肽序列的DR6多肽变体的存在。任选的是，该方法进一步包括鉴定所述多肽变体是 否具有与对SEQ ID NO :1之DR6多肽序列观察到的亲和力不同的对APP多肽的亲和力。本 发明的相关实施方案包括确定哺乳动物中是否存在包含SEQ ID N0:1氨基酸1-655的DR6 多肽变体的方法，该方法包括将哺乳动物中所表达的DR6多肽的序列与SEQ ID N0:1进行 比较，由此确定该哺乳动物中是否存在DR6多肽变体。这些方法的某些实施方案可包括进 一步的步骤，即鉴定观察到在哺乳动物中存在的多肽变体是否是APP结合变体，其中APP结 合变体表征为所具有的对包含SEQ ID NO :6氨基酸66-81的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)多 肽(例如APP695、sAPP α或sAPP β )的结合亲和力不同于包含SEQ ID NO 1的DR6多肽对 包含SEQ IDNO :6氨基酸66-81的APP多肽的结合亲和力。任选的是，此类方法中结合亲和 力的差异是通过表面等离振子共振(SPR)技术(例如可自Biacore Lif必ciences获得的) 测量的。这些方法的有些实施方案可包括选择具有在肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨庭 顿氏病或阿耳茨海默氏病中观察到的症状或疾患的患者个体的步骤。在本文所述全长天然序列DR6和APP多肽之外，可制备DR6和/或APP多肽变体。 DR6和/或APP变体可通过将适宜核苷酸变化引入编码DNA和/或通过期望多肽的合成来 制备。本领域技术人员会领会，氨基酸变化可能改变DR6和/或APP多肽的翻译后加工，诸 如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。本文所述DR6和/或APP多肽中的变异可以例如使用关于保守和非保守突变的任 何技术和指导方针来产生，例如美国专利No. 5，364，934中所提出的。变异可以是一个或多 个编码多肽的密码子的替代、删除或插入，其导致与天然序列多肽相比氨基酸序列中的变 化。任选地，变异是通过在DR6和/或APP多肽的一个或多个结构域中用任何其它氨基酸 替代至少一个氨基酸实现的。确定哪个氨基酸残基可以被插入、替代或删除而不会不利地 影响期望活性的指导可以通过比较DR6多肽的序列与同源的已知蛋白质分子的序列，并使 高度同源性的区域中产生的氨基酸序列变化的数目最小化而发现。氨基酸替代可以是用另 一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸替代一个氨基酸的结果，诸如用丝氨酸替代亮 氨酸，即保守氨基酸替代。任选地，插入或删除可以在大约1至5个氨基酸的范围中。可以 如下确定容许的变异，即在序列中系统地产生氨基酸的插入、删除或替代，并对所得的变体 测试DR6和/或APP拮抗活性。本文中提供了 DR6和/或APP多肽片段。此类片段可以是在N端或C端截短的，或者可以缺少内部残基，例如在与全长天然蛋白相比时。某些片段缺少对于DR6多肽的期 望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。DR6和/或APP多肽可以通过许多常规技术中的任一种来制备。可以化学合成期 望的肽片段。备选的方法涉及通过酶促消化生成多肽片段，例如通过用已知在由特定氨基 酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或通过用合适的限制酶消化DNA并分离 期望片段来实现。另一种合适的技术涉及分离并扩增编码期望多肽片段的DNA片段，其通 过聚合酶链式反应(PCR)实现。在PCR中的5’和3’引物上采用限定DNA片段的期望端的 寡核苷酸。在具体的实施方案中，下表中优选替代的标题下显示了感兴趣的保守替代。如果 此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文 参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。表
权利要求
1.一种用于筛选抑制神经变性的化合物的方法，包括(a)培养在它们的表面上表达APP的神经元；并(b)在候选化合物存在或缺失下刺激所述神经元中的APP脱落；其中在所述候选化合物存在下的观察APP脱落与在所述候选化合物缺失下的观察APP 脱落相比降低指示所述候选化合物是神经变性的抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中脱落是通过营养因子剥夺来刺激的。
3.权利要求2的方法，其中所述营养因子是NGF。
4.权利要求1的方法，其中所述神经元是感觉神经元。
5.权利要求1的方法，其中所述神经元是运动神经元。
6.权利要求1的方法，其中所述脱落是通过对所述神经元的机械损伤来刺激的。
7.权利要求1的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的脱落相比所述候选化合 物将观察脱落降低10-30%。
8.权利要求1的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的脱落相比所述候选化合 物将观察脱落降低30-50%。
9.权利要求1的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的脱落相比所述候选化合 物将观察脱落降低50-70%。
10.权利要求1的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的脱落相比所述候选化 合物将观察脱落降低70-90%。
11.权利要求1的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的脱落相比所述候选化 合物将观察脱落降低90-100%。
12.一种用于筛选抑制神经变性的化合物的方法，包括(a)培养在它们的表面上表达APP的神经元；并(b)在候选化合物存在或缺失下刺激所述神经元的神经变性；其中在所述候选化合物存在下的观察神经变性与在所述候选化合物缺失下的观察神 经变性相比降低指示所述候选化合物是神经变性的抑制剂。
13.权利要求12的方法，其中神经变性是通过营养因子剥夺来刺激的。
14.权利要求13的方法，其中所述营养因子是NGF。
15.权利要求12的方法，其中所述神经元是感觉神经元。
16.权利要求12的方法，其中所述神经元是运动神经元。
17.权利要求12的方法，其中所述脱落是通过对所述神经元的机械损伤来刺激的。
18.权利要求12的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的神经变性相比所述候 选化合物将观察神经变性降低10-30%。
19.权利要求12的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的神经变性相比所述候 选化合物将观察神经变性降低30-50%。
20.权利要求12的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的神经变性相比所述候 选化合物将观察神经变性降低50-70%。
21.权利要求12的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的神经变性相比所述候 选化合物将观察神经变性降低70-90%。
22.权利要求12的方法，其中与所述候选化合物缺失下观察到的神经变性相比所述候选化合物将观察神经变性降低90-100%。
全文摘要
呈现了用于筛选抑制神经变性的化合物的方法。APP脱落可作为神经变性的有用标志，而抑制APP脱落的化合物可用作神经变性的抑制剂。此类化合物可用于治疗和/或预防各种神经学疾病、病症和神经元损伤，而且可增强哺乳动物神经元细胞或组织的生长、再生或存活。
文档编号G01N33/50GK102124336SQ200980131368
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者安纳托利·尼古莱夫, 马克·特西尔-拉维格尼 申请人:健泰科生物技术公司