专利名称：傅立叶变换红外光谱技术对3种李斯特氏菌的分类鉴定的制作方法
技术领域：
本发明属于对3种李斯特氏菌的分类鉴定，具体地说是用傅立叶变换红外光谱 (FT-IR)技术对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes, L. monocytogenes)、
1 ! (Listeria iuanuii,L. iuanuii)(Listeria innocua,
L. innocua)进行快速分类鉴定。
背景技术：
李斯特菌在环境中广泛存在，是肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等食品中的重要病原菌。在李斯特菌属的分类种中，单核细胞增生李斯特菌对人类致病性最強，绵羊李斯特菌对人类也有一定的致病性。近年来，因李斯特菌污染食品导致的食品安全事故时有发生，李斯特菌特別是单核细胞增生李斯特氏菌已成为某些食品种类进出口贸易和食品质量监控中的ー个必检项目。因此，建立这些致病菌快速有效的分类、鉴定及检测技术对于保障食品安全、促进贸易发张具有重要的现实意义。FT4R技术以未损伤細胞的FT4R光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个細胞所有組成成分的化学键的振动情況，因此可以区分生化信息上的差別。FT4R提供整个微生物菌体生化組成成分的光谱定量信息，反应微生物的信息相比更全面。其优点在于分辨率高、鉴定时间短、成本低。但光谱技术在微生物分类鉴定中的应用尚不够系统和成熟，特別是对于某些归类范围内細菌的FT-IR鉴定方法，尚不够规范，有待对其进行统ー并形成标准方法。目前国内外还没有对单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌3种李斯特氏菌的规范、统ー的FT4R分类鉴定方法公开，也没有关于3种李斯特氏菌FT-IT光谱信息共享数据库的公开，该发明可弥补上述缺陷，建立3种李斯特氏菌的规范、统ー的FT-IR分类鉴定方法。

发明内容
本发明属于对3种李斯特氏菌的分类鉴定，具体地说是应用FT4R技木，结合化学计量学运算，实现对L. monocytogenes、L. iuanuii、L. innocua的分类鉴定。包括建立3种标准菌株光谱信息数据库，规范并统ー细菌培养条件、样品制备条件、光谱采集參数及数据分析方法。本发明所采用的技术方案为应用FT4R技术，建立L. monocytogenes, L. iuanuii,L. innocua 3种标准菌株的光谱信息数据库，同时规范并统ー細菌培养条件、样品制备条件、光谱采集參数及数据分析方法。采用相同細菌培养、样品制备及光谱采集方法，获得待测菌的光谱数据，与3种标准菌株的光谱信息数据库合井，并进行分级聚类分析 (hierarchical cluster analysis, HCA)，从而获得待测菌的归类图谱，实现对待测菌的分类鉴定。本发明涉及的3种李斯特氏菌的FT4R分类鉴定方法，依次包括下列步骤 (1)-(2)
(1)建立 L. monocytogenes,L. iuanuii、L. innocua 3 种李斯特氏菌红外光谱信息数据库①细菌的培养用无菌接种环挑取标准菌株L. monocytogenes、L. iuanuii、 L. innocua —环，接种于盛有15mL营养肉汤的大试管中，36°C 士 1°C静置培养18_Mh，使 0D_介于0.3 0.4范围；②硒化锌(ZnSe)窗片的制作吸取肉汤培养物ImL于1. 5mL离心管中，5000g离心5min，吸弃上清，加入ImL无菌生理盐水悬浮洗涤，5000g离心5min，再加入ImL超纯水悬浮洗涤，5000g离心5min，超纯水重复洗涤两次。最后用50 μ 1超纯水悬浮混勻。用微量移液器吸取菌悬液10 μ 1于窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑；③读取細菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱光谱參数为模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验參数为波段范围4000 eOOcnT1，光谱分辨率^m S 64次光谱累计求平均。每种菌至少做10次试验， 毎次做3个重复并取平均，获得10个有效光谱数据；④光谱预处理对3种李斯特氏菌4000 eoocnT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理透过率-吸光度转化、基线校正、一阶导数(平滑点数9点)、矢量归ー化、导数 i普一excel 数据转换，艮 P 建1 了李其jf特氏菌属内 L. monocytogenes>L. iuanuii >L. innocua 3 种菌的红外光谱信息数据库；⑤聚类方法的建立对3种李斯特氏菌的红外光谱进行分级聚类分析(HCA)，获得实现3种李斯特氏菌分类鉴定的方法參数HCA 皮尔森积矩相关系数(Ward，s method, Pearson r)。(2)对目标菌的分类鉴定采用上述細菌培养、硒化锌(ZnSe)窗片制作、光谱采集及光谱预处理方法，获得待测目标菌的红外光谱数据。将其与3种标准菌株的光谱信息数据库合井，按照上述方法进行分级聚类分析(HCA)，根据待测菌在数据库中的归类图谱，实现对待测菌的分类鉴定。L. monocytogenes^ L. iuanuii> L. innocu メ六 M M ^ M Μ M ^ r^ M M 白勺 L. monocytogenes、L· iuanuii> L. innocua中。


图1 应用HCA对3种李斯特氏菌标准菌株的分类图；图2 实施例中应用HCA对供试样品中3种添加李斯特氏菌和1种非可疑菌的分类鉴定图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步说明。实施例供试样品制备将解冻后的冷冻鲐鲅鱼500g剪碎均质后，向其中分别添加 5X102CFU/mLL. monocytogenes、L. iuanuii、L. innocu 标准菌株溶液各 10mL，搅拌混勻，7令冻备用。
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按下述方法检测供试样品包括纯净水，0.9%生理盐水，无水乙醇，营养肉汤，李斯特氏菌增菌用培养基及显色培养基等；按照以下程序进行检测(1)細菌培养将冷冻鲐鲅鱼供试样品解冻后，称取25g样品作为待测样品，对其分别进行增菌和显色培养基选择培养后，用无菌接种环挑取可疑菌落ー环，分別接种于盛有15mL营养肉汤的大试管中，36°C 士 1°C静置培养18-24h，使0D600介于0. 3 0.4范围。同时挑取非可疑菌落ー环进行培养，培养方法相同；(2)硒化锌(ZnSe)窗片的制作吸取各肉汤培养物ImL于1.5mL离心管中，5000g离心5min，吸弃上清，分别加入ImL无菌生理盐水悬浮洗涤，5000g离心5min，再加入ImL超纯水悬浮洗涤，5000g离心 5min，超纯水重复洗涤两次。最后用50 μ 1超纯水悬浮混勻。用微量移液器吸取菌悬液 10μ 1于窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑；(3)读取細菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱光谱參数为模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和 CO2的吸收光谱干扰)。实验參数为波段范围4000 600CHT1，光谱分辨率^m S 64次光谱累计求平均。每种可菌做3个重复并取平均；(4)光谱预处理对待测菌4000 eOOcnT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理透过率-吸光度转化、基线校正、一阶导数(平滑点数9点)、矢量归ー化、导数谱-excel数据转换；(5)数据分析将待测菌光谱数据与3种标准菌株的光谱信息数据库合井，应用Matlab 6. 5和 Statistica 6.0软件，对数据进行HCA (皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method, Pearson r))L. monocytogenesW L. monocytogenes；L. iuanuii 聚类到到数据库中的L. iuanuii聚类群中；L. innocua 聚类到数据库中的L. irmocua聚类群中；非3种李斯特氏菌应单独聚类。分类鉴定情况见图2。
权利要求
1.一种单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌的傅立叶变换红外光谱分类鉴定方法，其特征在于数据库的建立(Listeria monocytogenes, L. monocytogenes) > % 李:^fT牛寺 1 (Listeria iuanuii, L. iuanuiiノ、；^1 李:^ff牛寺 1 " (Listeria innocua, L. innocua) 3种菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理透过率-吸光度转化、基线校正、一阶导数(平滑点数9点)、矢量归ー化、导数谱-excel数据转换，即建立了李斯特氏菌属内しmonocytogenes、L. iuanuii、L. innocua 3种菌的红外光谱信息数据库。
2.根据权利要求1所述的3种李斯特氏菌的傅立叶变换红外光谱分类鉴定方法，其特征是依次包括以下步骤(1)細菌的培养用无菌接禾中环挑取可疑L. monocytogenes、L. iuanuii、L. innocua ー环，接禾中于盛有 15mL营养肉汤的大试管中，36°C 士 1°C静置培养18_Mh，使OD6。。介于0. 3 0. 4范围。(2)硒化锌(ZnSe)窗片的制作吸取肉汤培养物ImL于1.5mL离心管中，5000g离心5min，吸弃上清，加入ImL无菌生理盐水悬浮洗涤，5000g离心5min，再加入ImL超纯水悬浮洗涤，5000g离心5min，超纯水重复洗涤两次。最后用50 μ 1超纯水悬浮混勻。用微量移液器吸取菌悬液10 μ 1于かな窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑。(3)读取細菌4000 eOOcnT1波数范围的红外光谱光谱參数为模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2 的吸收光谱干扰)。实验參数为波段范围4000 600cm—1，光谱分辨率^m S 64次光谱累计求平均。(4)光谱预处理根据权利要求1，对光谱进行处理，得到由光谱转换的excel数据。(5)对数据进行分级聚类分析(HCA)HCA 皮尔森积矩相关系数(Ward，s method, Pearson r)；L.monocytogenes、L.iuanuii、L.innocua分别聚类到数据库中对应的 L. monocytogenes、L· iuanuii> L. innocua中。
全文摘要
本发明属于对3种李斯特氏菌的分类鉴定，具体地说是用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)技术结合化学计量学运算(分级聚类分析)对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，L.monocytogenes)、绵羊李斯特氏菌(Listeria iuanuii，L.iuanuii)、英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua，L.innocua)进行分类鉴定。方法包括3种李斯特氏菌FT-IR光谱信息数据库的建立、细菌的培养、硒化锌(ZnSe)窗片的制作、光谱采集及预处理，最后采用分级聚类分析进行结果判定。其优点在于分辨率高、快速、操作简单、成本低。
文档编号G01N21/35GK102590127SQ20111046200
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者刘玉敏, 崔凤杰, 李兆杰, 杨丽君, 王静 申请人:威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心