专利名称：一种炭疽芽孢杆菌的抗原胶体金检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种炭疽芽孢杆菌抗原的检测试纸和在
检测炭疽芽孢杆菌中的应用。
背景技术：
炭疽是由炭疽杆菌所引起的一种人畜共患急性传染病。人们从认识这种疾病并与 其斗争已经有100多年的历史，积累了丰富的防治经验。然而，目前阶段，炭疽对人类仍然 构成威胁，在世界各地频繁出现爆发流行，特别是在发展中国家。近年来在非洲最严重的人 间流行发病达万余人，每年有大批的牲畜死亡，造成重大的经济损失，人类炭疽病例也不断 发生。 人是通过直接或间接接触感染动物而发病，主要是剥食病畜肉、吸入污染炭疽芽 孢的气溶胶而感染。所以，人类发病多为继发感染，其传染源为患病的草食动物。动物炭疽 通常是食入了被污染的水、草后感染炭疽。人类对炭疽普遍易感，其感染途径经消化道、呼 吸道或皮肤接触而使人致病。其中皮肤炭疽是最常见的形式，易发生于接触污染的动物或 动物制品的工业或农业部门中。 现有的免疫学检测方法常采用荚膜抗体作酶标或荧光抗体染色进行诊断，分子生 物学有PCR方法，还有多种传统的检验方法，包括细菌分离培养、溶血性实验、荚膜染色、噬 菌体裂解实验、串珠实验等，但上述方法耗时长，而且必须进行大量的纯化细菌，要求购买 昂贵的仪器，操作繁琐复杂，需要专业人士具备熟练的操作技能才能准确检测。

实用新型内容本实用新型的目的是提供一种方便、快捷地检测炭疽芽孢杆菌的试纸。该试纸的 工作原理是利用特异性抗原_抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试 纸上结合的捕获抗体显色。 本实用新型能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的炭疽芽孢 杆菌或芽孢，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。 本实用新型涉及一种方便、快捷地检测炭疽芽孢杆菌的检测试纸，它包含 (1)反应支持物；(2)吸水垫； (3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗炭疽芽孢杆菌疫苗株sterne (St)多克隆抗体条 带和质控兔抗羊IgG的条带； (4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的炭疽芽孢杆菌抗体。 本发明涉及的上述炭疽芽孢杆菌的检测试纸，它还包含样品垫，该样品垫的材料
选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。 本发明涉及的上述炭疽芽孢杆菌的检测试纸，其中反应支持物选用PVC板。 本发明涉及的上述炭疽芽孢杆菌的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。[0015] 本发明涉及的上述炭疽芽孢杆菌的检测试纸，其中金标抗体保护膜的材料选自聚 脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的羊抗St抗体。 另一方面，本发明涉及的上述炭疽芽孢杆菌的检测试纸，其中，吸水垫、硝酸纤维 膜、金标抗体保护膜、样品垫和反应支持物按照附图1所示方式构成；反应支持物5位于底 层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗St多克隆抗体包被的检 测条带，并且C处是兔抗羊IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝酸纤维膜上部的 一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的羊抗St多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维 膜2上部的相对于金标抗体保护膜3而言的另一侧并与2部分重叠；样品垫4位于2上与 l相反的一侧并与3部分重叠。 又一方面，本实用新型涉及的上述炭疽芽孢杆菌的检测试纸，以吸水垫一侧为起 始端，样品垫一侧为末端，羊抗St多克隆抗体的检测条带位于接近末端，兔抗羊IgG包被的 质控条带接近于起始端。 本实用新型检测炭疽芽孢杆菌的试纸的制备方法，该方法包括以下步骤胶体金
探针的制备，金标垫的制备，硝酸纤维膜的喷涂包被。 1、胶体金探针的制备 (1)将HAuCl4先配制为0. 01 %水溶液，磁力搅拌下准确加入lml 1 %的HAuCl4，同 时加入1. 5-3ml 1 %的柠檬酸三钠水溶液，颜色稳定后继续加热，冷却至室温后加纯水补足 至100ml，4t:避光保存； (2)用K2C03调ra值为约7-9，优选为约7. 8-8. 9，更优选约8. 2-8. 5 ; (3)将胶体金调至pH 8. 2-8. 5，用5mM PB(pH 7. 2)稀释抗体至0. 2mg/ml ; (4)保持胶体金稳定。 本实用新型还披露一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的方法，该方法 包括 a.取10只洁净的1. 5ml离心管，分别加入胶体金溶液lml ; b.在1-10号管内分别力B入10ii l、20ii l、30ii l、40ii l、50ii l、60ii 1、70ii 1、
80iil、90iil、100ii1的5mM PB，再依次加入稀释好的0. 2mg/ml的待标记抗体90iU、
80 ii l、70ii l、60ii l、50ii l、40ii l、30ii l、20ii 1、10ii 1、0ii l，混匀，放置2分钟； c.在10个管内分别加入10% NaCl溶液100 iU，混匀后室温静置2小时，观察颜
色变化。 未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化， 而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(l号管)相比， 颜色最接近、含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为lml胶体金所必须的抗体稳定 剂量，在此基础上再加20%单抗，即为抗体最佳标记剂量。本实用新型经过反复试验和分 析，得出的结果表明维持胶体金溶液适宜抗体量为8-15ug，优选抗体量10-12ug，更优选 10. 5-11.5ug，最优选为llug。 2、金标垫的制备 取上述pH的胶体金以lml/管分装于1.5ml的离心管中。每支管中加入8-15ug 标记剂量，优选抗体量10-12ug，更优选10. 5-11. 5ug，最优选为llug的抗体，轻摇混匀后放 置。每管中加入10X的BSA100ia，混匀放置。将上面初步制得的胶体金探针在12000rpm、4t:下离心30分钟，弃上清液。每支离心管中加入lml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上 清液，管底得到暗红色的疏松状沉淀，加入500 ii 1重悬液重悬后于4°C ， 1000rpm，离心10分 钟；取上清液，均匀滴在lcm宽的玻璃纤维上，37t:干燥。 3、硝酸纤维膜的喷涂包被 (1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗St多克隆抗体和质控兔 抗羊IgG两个条带的硝酸纤维膜； 在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s，更优选是45-55mm/s，最 优选是50mm/s ;所述兔抗St多克隆抗体，其加入量为l_5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液 可以为PBS ;质控兔抗羊IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0. l-5mg/ml更优选是 0. 5-2. 5mg/ml，最优选为lmg/ml ; (2)制备含有胶体金标记的羊抗St的金标抗体保护膜，具体为将胶体金标记的 羊抗St均匀涂布在玻璃纤维膜上来制备，其中，抗体用PB稀释，pH为7-9，优选7. 5-9，最
适ra值为8. 5。 本实用新型所述试纸在检测炭疽芽孢杆菌中的应用，参见附图2。 利用本实用新型试纸检测炭疽芽孢杆菌的方法中，先将待测标本放入装有稀释液 的小瓶内，再用移液器将样品混合液加入试纸"4"处(即末端)，样品中的液体依靠虹吸作 用上行，一般需10-15分钟判读结果 如标本中含有炭疽芽孢杆菌，则它将与试纸上胶体金标记的炭疽芽孢杆菌多克隆 抗体形成相应的复合物，液体展开上行并与硝酸纤维膜上的炭疽芽孢杆菌多克隆抗体结 合，形成红色线条，即在"T"处形成红色条带。 无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记多克隆抗体继续随液体继续上行并与该 膜上的兔抗羊IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失 效，此线就不会出现，说明试纸失效。 阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说 明试纸失效。如若肉眼无法辨别T处红色条带，可利用金标免疫分析仪进行半定量检测。 本实用新型的技术方案是采用纯化的炭疽芽孢杆菌多克隆抗体、和兔抗羊IgG 分别固相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的羊抗炭疽多抗，应用膜层析双抗体夹心法的 原理检测标本中的炭疽芽孢杆菌。

图1A本实用新型试纸的正面示意图。 图1B本实用新型试纸的侧面示意图。 其中，图1A和1B :1 :吸水垫；2 :硝酸纤维膜(A :包被抗St多克隆抗体检测条带； C :包被兔抗羊IgG的质控条带)；3 :含有胶体金标记羊抗St多克隆抗体的玻璃纤维膜；4 : 样品垫；5 :反应支持物。
图2 :检测结果示意图；T、 C两条线阳性；C 一条线阴性；无效。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。[0046] 实施例1、检测炭疽芽孢杆菌的胶体金试纸的制备 1、胶体金探针的制备 (1)将HAuCl4先配制成0. 01 %水溶液，取100ml纯水加热至沸腾。磁力搅拌下准 确加入lml 1%的HAuCl4，同时加入1. 5ml质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定 后继续加热煮沸15分钟，冷却至室温后加纯水补足至100ml，4t:避光保存。 (2) K2C03调PH值为8. 28. 5左右。 (3)将胶体金调至适宜的pH，优选8. 0-8. 5，更优选8. 2，用5mMPB (pH 7. 2)稀释抗
体至0. 2mg/ml 。 2、金标垫的制备 取pH 8. 2的胶体金以lml/管的量分装于1. 5ml的离心管中。每支管中加入最佳 标记剂量的抗体，轻摇混匀后放置5分钟或稍长，此步为抗体与金颗粒结合。每管中加入 10%的BSA100iU，混匀放置10分钟或稍长，此步为封闭。将上面初步制得的胶体金探针 以12000rpm，离心30分钟，4。C，弃上清。每支离心管中加入lml重悬液悬浮沉淀后同上离 心。弃上清，留下管底暗红色疏松状沉淀，加入500 ii 1重悬液重悬后于4°C ， 1000rpm，离心 10分钟；取上清液，均匀的滴加在lcm宽的玻璃纤维上，37。干燥2. 5-3小时。 3、硝酸纤维膜的喷涂包被 (1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗St多克隆抗体(1. 5mg/ml) 和质控兔抗羊IgG(购自鼎国生物技术公司，lmg/ml)两个条带的硝酸纤维膜； (2)含有胶体金标记羊抗St llug的玻璃纤维膜，PB稀释；最适ra值为8. 5 实施例2、炭疽芽孢杆菌抗原检测试纸 参见图l，反应支持物为6. 2cmX0. 4cm PCV板；吸水垫为2cmX0. 4cm的滤油纸； 1. 8cmX0. 4cm的硝酸纤维膜依次包被羊抗兔IgG(购自鼎国生物技术公司，lmg/ml)，兔抗 S t多克隆抗体2mg/ml ;含有0. 4cmX0. 4cm胶体金标记的兔抗St多克隆抗体(标金浓度 llug PB稀释；最适ra值为8. 5)玻璃纤维膜；样品垫为2. 7cmX0.4cm的玻璃纤维；即形成 了炭疽芽孢杆菌抗原检测试纸。 实施例3、检测方法 参见附图2，将待测标本与样品稀释液混匀，再用移液器将样品混合液加入试纸样 品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果 如含有炭疽芽孢杆菌抗原，则与试纸上胶体金标记的羊抗St多抗形成相应的复 合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的流兔抗St多抗结合，形成红色线条，即在"T"处形成红 色条带。 无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记多抗继续向上爬行与包被在膜上的兔抗 羊IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就 不会出现，说明试纸失效。 阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说 明试纸失效。 实施例4、 DJM-3定量金标免疫分析仪半定量检测 1、可先用检测法检测炭疽芽孢杆菌试纸条20个阴性值，利用金标仪检测试其T/C 的比值平均计算出炭疽芽孢杆菌试纸条的定阈值。
6[0065] 2、其次利用定阈值来用金标仪机器检测炭疽芽孢杆菌试纸条能达到的最低浓度。 3、判读结果时大于或等于定阈值为阳性，小于定阈值为阴性。 本实用新型所述的试纸可以配合小型仪器可进行半定量检测，不需专业培训，结 果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检 测，适合流行病学调查，并对炭疽芽孢杆菌的感染诊断起到辅助作用。
权利要求一种检测试纸，其特征在于，它包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗炭疽芽孢杆菌疫苗株sterne(St)多克隆抗体条带和质控兔抗羊IgG的条带；(4)金标抗体保护膜，该膜中含有胶体金标记的炭疽芽孢杆菌抗体；(5)样品垫；所述反应支持物位于底层，所述硝酸纤维膜位于反应支持物上的中部，所述金标抗体保护膜位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，所述吸水垫位于硝酸纤维膜上部的相对于金标抗体保护膜而言的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠；所述样品垫位于硝酸纤维膜上与吸水垫相反的一侧并与金标抗体保护膜部分重叠。
2. 根据权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述硝酸纤维膜上有T、C两个标记处，其 中T处是兔抗炭疽芽孢杆菌疫苗株sterne (St)多克隆抗体条带，并且C处是质控兔抗羊 IgG的条带。
3. 根据上述权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述吸水垫一侧为起始端，所述样品 垫一侧为末端，所述检测抗体的条带位于接近末端，所述质控条带接近于起始端。
专利摘要本实用新型公开了一种检测试纸，该试纸包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有炭疽芽孢杆菌抗体和质控抗体的检测条带质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的炭疽芽孢杆菌抗体。本实用新型试纸可以配合小型仪器可进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对炭疽芽孢杆菌的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/543GK201464477SQ20092010571
公开日2010年5月12日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者孙肖红, 张晓龙, 李伟, 杨宇, 王静, 胡孔新, 谢士嘉 申请人:中国检验检疫科学研究院