专利名称：间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒及测定方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒。
背景技术：
糖尿病(diabetes)是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，糖尿病(血糖)一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。目前临床常规检查是检测患者血糖浓度，但是血糖测定只能代表即刻的血糖水·平，不能显示一段时间内血糖浓度的变化情况，因此不能作为评价疾病控制程度的指标。血液中的葡萄糖与白蛋白和其他蛋白分子N未端发生非酶促糖化反应，形成糖化血清蛋白。由于血清中白蛋白的半衰期约21天，糖化血清蛋白测定可有效反映患者过去I 2周内平均血糖水平，而且不受当时血糖浓度的影响，是糖尿病病人评价疾病控制程度非常适宜的良好指标。较早测定糖化血清白蛋白(GA)的方法采用的是HPLC方法，费时费力，且不能满足大规模临床测定需求。目前最主要的检测糖化血清白蛋白(GA)的方法是由日本旭化成提供的酶法，该方法使用特定的蛋白水解酶切除血清白蛋白特殊的糖基化区域(Lys 525，参考文献中白蛋白第525号位置的赖氨酸，同NCBI数据库最新白蛋白549号位的赖氨酸)，后续再通过通用的生化显色反应测定被切除糖基化区域的多少，已达定量测定GA目的，同时使用通用生化白蛋白测定试剂测定血清白蛋白浓度，即可计算出糖化血清白蛋白比例，对临床诊断提供参考。但是酶法在生化检测中要抵抗胆红素、脂浊、维生素C干扰，需要在试剂中添加大量干扰消除物质(1-3%)以及对应的多种保护剂(1_3%)，不但使得试剂配方复杂化，会带来意想不到的交叉干扰作用，同时大幅度提高试剂成本；而免疫法由于抗体所特有的特异性好优点，以及检测原理上的不同，上述物质基本无干扰作用，仅需要添加极为微量(通用的是
O.05%)的IEPS即可，甚至特异性最优秀的抗体可不添加，因此试剂配方相对简单，交叉干扰作用微乎其微，成本也相对较低。此外，欧洲专利#201187记载一种制备特异性抗糖化血红蛋白单克隆抗体的方法；美国专利#522392记载了一种制备特异性抗糖化白蛋白单克隆抗体的方法；美国专利5470759记载另一种利用特异性抗糖化血红蛋白单克隆抗体，建立免疫凝集试验和免疫浊度试验测定糖化血红蛋白。在这些技术方案中，特异性的单克隆抗体都是针对糖化血红蛋白或糖化白蛋白的糖化区域进行特异性识别的。这些直接识别糖基化氨基酸区域的单抗目前是抗体制备难点，难以获得抗体，试剂开发以及推广应用受限。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒，该试剂盒区别于现有技术针对糖基化的糖化区域进行特异性识别，采用特异性单克隆抗体高度特异性地识别非糖基化的特定糖基化区域，测定此特定位置非糖化血清白蛋白含量，该方案所用的单抗易于制备，并且成本较低，便于广泛应用和推广。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒，包括针对血清白蛋白的糖基化区域 制备的特异性单克隆抗体，该特异性单克隆抗体高度特异性地识别非糖基化的糖基化区域；还包括特异性识别糖基化区域的对位区域的单克隆抗体；由所述的特异性单克隆抗体和单克隆抗体制备成为免疫比浊试剂。该技术方案中的“该特异性单克隆抗体高度特异性地识别非糖基化的糖基化区域”中，糖基化区域是指血液中的葡萄糖与白蛋白和其他蛋白分子N未端发生非酶促糖化反应的区域，现有技术是针对糖基化的糖化区域进行特异性识别，及识别的是糖化白蛋白中糖基化反应之后的复合物；而本发明与现有技术的手段完全相反，采用识别非糖基化的特定糖基化区域特异性单克隆抗体，测定出该特定区域没有进行糖化反应的白蛋白的浓度，再通过现有技术测定总白蛋白浓度，用总白蛋白浓度减去没有进行糖化反应的白蛋白的浓度即得到糖化白蛋白浓度。进一步地，所述糖基化区域为SEQ ID NO :1中的Lys 525区域。目前已知的血清白蛋白可发生糖化位点有很多，如LYS 51 ；LYS 137 ；LYS 162 ；LYS 225 ； LYS 234 ； LYS276 ； LYS 313 ； LYS 323 ； LYS 351 ； LYS 278 ；LYS 413 ； LYS 424 ； LYS 494 ；LYS 534 ；
LYS 536 ；LYS 525 ； LYS 545 ；LYS 573......等，白蛋白可发生糖基化的区域至少有20个位
点，采用哪一个位点作为识别区域，直接影响到糖化白蛋白测定的准确性。试验证明，选用SEQ ID NO :1中的Lys 525区域，即SEQ ID NO 1的第525位的Lys，该位置点的Lys作为识别位点，其准确性得到显著性的提高。我们针对这一特殊糖基化区域(Lys 525)制备特异性单抗，高度特异性地识别非糖基化的这一区域。再加上一株特异性识别白蛋白Lys 525对位区域(与Lys 525无空间位阻，由商业化抗体公司完成配对筛选)的单抗，由两株单抗混合制备成为免疫比浊试剂。通过与重组非糖基化白蛋白标准品比较，可以定量测定出在Lys525区域非糖基化的白蛋白浓度(B)，同时也使用通用生化白蛋白测定试剂测定总白蛋白浓度(A),由仪器自动计算出GA浓度=A-B,即可计算出糖化血清白蛋白比例,对评价糖尿病的控制程度提供参考。同时，获得能够切除某一特定蛋白区域的酶的成本(至少几十万的投入)远远高于制备识别这一区域的单抗(5000以内，商业抗体公司提供制备服务)，最终检测试剂成本免疫试剂远低于酶法试剂。所述糖基化区域的对位区域为SEQ ID N0:1中第120 420之间的氨基酸序列区域。即SEQ ID N0:1中第120 420之间的任何一个氨基酸作为对位区域，用于构成本发明技术方案的免疫比浊试剂，以便于利用该试剂采用免疫比浊法测定糖化白蛋白的浓度。具体地，所述检测试剂盒由试剂I和试剂2构成，其中，
试剂I的组分及其质量百分比为
pH6. 0-8. O的磷酸盐缓冲液2%，
200-600Mm/L 的 NaCl :1· 2 3. 5%,
PEG6000 3 5%,吐温-20 2%,
干扰消除蛋白IEPS :0. 05%,
防腐剂 ProClin300 :0. 03%,
纯化水87. 45% 91. 75% ；
试剂2的组分及其质量百分比为 pH6. 0-8. O磷酸盐缓冲液2%，
PEG6000 1 3%,
稳定剂5 10%，
防腐剂 ProClin300 :0. 03%,
O.1-1. Omg/ml的抗人血清白蛋白非糖基化的糖基化区域单克隆抗体0. I 1%,
0.1-lmg/ml的抗人血清白蛋白糖基化区域的对位区域的单克隆抗体0. I 1%, 纯化水84. 8% 90%ο在试剂I和试剂2中，PEG6000指分子量为6000的聚乙二醇；稳定剂种类主要有甘露醇、山梨醇、海藻糖、蔗糖、甘油、吐温-20、聚乙二醇6000等，当然，商业化的稳定剂公司也提供标准化的稳定剂，如著名稳定剂公司SurModics提供的SG02，SCO I, SZO I, SA02等；干扰消除蛋白IEPS如Roche的Marka33、菲鹏生物的阻断剂系列等等，防腐剂ProClin300为购买的现有产品。一种糖化血清白蛋白测定方法，在全自动生化分析仪上测定样品中总白蛋白浓度，同时采用权利要求I至4任一项所述的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒测定血清白蛋白在糖基化区域非糖基化的白蛋白浓度，根据测定的总白蛋白浓度和血清白蛋白在糖基化区域非糖基化的白蛋白浓度，人工计算或由医院Lis系统自动计算得到糖化血清白蛋白浓度和糖化血清白蛋白百分比浓度。该方法采用的全自动生化分析仪为现有检测设备，如日立7060、奥利巴斯全自动生化分析仪等，本发明的试剂盒通过这些全自动分析设备，可以快速的检测和计算出样品的糖化白蛋白浓度，一般仅需要5-10分钟左右，其他专利涉及的elisa法，发光免疫法测定一般需要30分钟到I个小时左右。与现有技术相比较，本发明的有益效果是
1、本发明采用识别非糖基化的特定糖基化区域特异性单克隆抗体，测定出该特定区域没有进行糖化反应的白蛋白的浓度，再通过现有技术测定总白蛋白浓度，用总白蛋白浓度减去没有进行糖化反应的白蛋白的浓度即得到糖化白蛋白浓度；该方案所用的单抗易于制备，并且成本较低，便于广泛应用和推广。2、本发明选用SEQ ID NO 1中的Lys 525区域作为识别位点，使得测定结果的准确性得到显著性的提高。3、采用本发明提供的试剂配方，能够准确的测定糖化白蛋白的含量，并且在测定抗干扰的能力上具有非常好的效果。
4、本发明的试剂盒配合全自动生化分析仪，可以快速的检测和计算出样品的糖化白蛋白浓度，一般仅需要5-10分钟。


图I是本发明采用配方I以Lys 494区域非糖基化单抗测定与旭化成酶法测定糖化白蛋白浓度的相关性示意 图2是本发明采用配方2以Lys534区域非糖基化单抗测定与旭化成酶法测定糖化白蛋白浓度的相关性示意 图3是本发明采用配方3以Lys 573区域非糖基化单抗测定与旭化成酶法测定糖化白蛋白浓度的相关性示意 图4是本发明采用配方I以Lys 525区域非糖基化单抗测定与旭化成酶法测定糖化白蛋白浓度的相关性示意 图5是本发明采用配方2以Lys 525区域非糖基化单抗测定与旭化成酶法测定糖化白蛋白浓度的相关性示意 图6是本发明采用配方3以Lys 525区域非糖基化单抗测定与旭化成酶法测定糖化白 蛋白浓度的相关性示意 图7是本实施例的三种不同试剂配方与不同浓度的Lys525非糖基化白蛋白反应的工作曲线；
图8是实施例I的配方抗胆红素干扰的测试结果 图9是实施例I的配方抗VC干扰的测试结果 图10是实施例I的配方抗脂浊干扰的测试结果 图11是实施例2的配方抗胆红素干扰的测试结果 图12是实施例2的配方抗VC干扰的测试结果 图13是实施例2的配方抗脂浊干扰的测试结果 图14是实施例3的配方抗胆红素干扰的测试结果 图15是实施例3的配方抗VC干扰的测试结果 图16是实施例3的配方抗脂浊干扰的测试结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不仅限于下述实施例。实施例I :
本实施例的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒由试剂I (Rl)和试剂2 (R2)组成，其具体配方(配方I)如下(重量百分比)
Rl
磷酸盐缓冲液(PH6. O) 2%
NaCl :1. 2%
PEG6000 3%
吐温-20 2%
干扰消除蛋白IEPS :0. 05%
防腐剂 ProClin300 :0. 03%
纯化水91. 75%
R2
磷酸盐缓冲液(PH6. 0-8. O) 2%PEG6000 1%
稳定剂5%
防腐剂 ProClin300 :0. 03%
抗人血清白蛋白非糖基化Lys525区域单克隆抗体(I. Omg/ml) 1%
抗人血清白蛋白单克隆抗体(Lys525对位Val 120区域)(I. Omg/ml) 1%
纯化水90%。实施例2
本实施例的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒由试剂I (Rl)和试剂2 (R2)组成，其具体配方(配方2)如下(重量百分比)
Rl
磷酸盐缓冲液(PH6. O) 2%
NaCl :2. 4%
PEG6000 4%
吐温-20 2%
干扰消除蛋白IEPS :0. 05%
防腐剂 ProClin300 :0. 03%
纯化水89. 55%
R2
磷酸盐缓冲液(PH6. 0-8. O) 2%
PEG6000 2%
稳定剂8%
防腐剂 ProClin300 :0. 03%
抗人血清白蛋白非糖基化Lys525区域单克隆抗体(O. 5mg/ml) :0. 5%
抗人血清白蛋白单克隆抗体(Lys525对位Ala 320区域)(O. 5mg/ml) :0. 5%纯化水
87%。实施例3
本实施例的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒由试剂I (Rl)和试剂2 (R2)组成，其具体配方(配方3)如下(重量百分比 )
Rl
磷酸盐缓冲液(PH6. O) 2%
NaCl :3. 5%
PEG6000 5%
吐温-20 2%
干扰消除蛋白IEPS :0. 05%
防腐剂 ProClin300 :0. 03%
纯化水87. 45%
R2
磷酸盐缓冲液(PH6. 0-8. O) 2%
PEG6000 3%稳定剂:10%
防腐剂 ProClin300 :0. 03%
抗人血清白蛋白非糖基化Lys525区域单克隆抗体(O. lmg/ml) :0. 1%
抗人血清白蛋白单克隆抗体(Lys525对位Thr 420区域)(O. lmg/ml) :0. 1%
纯化水84. 8%。
实施例1-3的配方采用免疫比浊法即可以测定糖基化区域非糖基化的白蛋白浓度(B)，同时也使用通用生化白蛋白测定试剂测定总白蛋白浓度(A)，由仪器自动计算出GA浓度=A-B,即可计算出糖化血清白蛋白比例,糖化白蛋白百分率=(A-B)/A。以日立7060全自动生化分析仪为例，参数设置为试剂比例R1/R2 :250/50，样本量3ul，波长340/700nm，方法学为终点法，读点方式16-31点。对于本领域的技术人员而言，只要确定了识别位点及识别位点的生物分子结构，制备出特异性识别该区域的特异性单克隆抗体(单抗)是利用常规的设计就可以实现的。在以上的实施例1-3中，两株单抗均由商业化抗体公司定做,配对筛选也由商业化抗体公司完成，如京天成生物技术(北京)有限公司。本发明首先选择的是利用没有发生糖化反应的区域作为识别位点。目前已知的血清白蛋白可发生糖化位点有很多，如LYS 51 ；LYS 137 ；LYS 162 ；LYS 225 ； LYS 234 ； LYS 276 ； LYS 313 ； LYS 323 ； LYS 351 ； LYS 278 ；LYS
413 ； LYS 424 ； LYS 494 ；LYS 534 ；LYS 536 ；LYS 525 ； LYS 545 ；LYS 573......等，白蛋白
可发生糖基化的区域至少有20个位点，原则上，选择以上这些任一个位点的非糖基化的糖基化区域作为识别位点，都可以实现本发明的测定方法；或者，也可以选用以上的2个或者更多个位点联合测定，以增加其准确性，但是这样成本会增加。为了不增加成本，而又能增加测定结果的准确性，经研究发现，选用SEQ ID NO :1中的Lys 525区域，即SEQ ID NO 1的第525位的Lys，该位置点的Lys作为识别位点，其准确性得到显著性的提高。表I列举的识别Lys424, Lys536, Lys573区域非糖基化单抗测试数据,按照实施例1-3所用的试剂配方和测定方法测定，参见图I至图6的测定结果，结果显示Lys424，Lys536, Lys573区域非糖基化单抗测试数据与酶法结果明显相关性(R2〈〈0. 9)较小，但使用识别Lys525非糖基化区域单抗的间接法测定糖化血清白蛋白的结果与酶法测定结果明显相关(R2>0. 9)，说明针对非糖化的Lys525区域设计的单抗对于测定糖化血清白蛋白较为理想。表I
权利要求
1.间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括针对血清白蛋白的糖基化区域制备的特异性单克隆抗体，该特异性单克隆抗体高度特异性地识别非糖基化的糖基化区域；还包括特异性识别糖基化区域的对位区域的单克隆抗体；由所述的特异性单克隆抗体和单克隆抗体制备成为免疫比浊试剂。
2.根据权利要求I所述的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述糖基化区域为SEQ ID NO :1中的Lys 525区域。
3.根据权利要求2所述的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述糖基化区域的对位区域为SEQ ID NO :I中第120 420之间的氨基酸序列区域。
4.根据权利要求I至3任一项所述的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒由试剂I和试剂2构成，其中， 试剂I的组分及其质量百分比为 pH6. 0-8. O的磷酸盐缓冲液2%，200-600Mm/L 的 NaCl :1· 2 3. 5%,PEG6000 3 5%, 吐温-20 :2%， 干扰消除蛋白IEPS :0. 05%,防腐剂 ProClin300 :0. 03%, 纯化水87. 45% 91. 75% ； 试剂2的组分及其质量百分比为 pH6. 0-8. O磷酸盐缓冲液2%，PEG6000 1 3%, 稳定剂5 10%，防腐剂 ProClin300 :0. 03%, O. 1-1. Omg/ml的抗人血清白蛋白非糖基化的糖基化区域单克隆抗体0. I 1%, O.1-lmg/ml的抗人血清白蛋白糖基化区域的对位区域的单克隆抗体0. I 1%, 纯化水84. 8% 90%ο
5.一种糖化血清白蛋白测定方法，其特征在于，包括下述步骤在全自动生化分析仪上测定样品中总白蛋白浓度，同时采用权利要求I至4任一项所述的间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒测定血清白蛋白在糖基化区域非糖基化的白蛋白浓度，根据测定的总白蛋白浓度和血清白蛋白在糖基化区域非糖基化的白蛋白浓度，人工计算或由医院Lis系统自动计算得到糖化血清白蛋白浓度和糖化血清白蛋白百分比浓度。
全文摘要
本发明涉及一种间接免疫法糖化血清白蛋白检测试剂盒。该试剂盒包括针对血清白蛋白的特定糖基化区域制备的特异性单克隆抗体，该特异性单克隆抗体高度特异性地识别非糖基化的特定糖基化区域；还包括特异性识别该特定糖基化区域的对位区域的单克隆抗体；由所述的特异性单克隆抗体和单克隆抗体制备成为免疫比浊试剂。本发明采用识别非糖基化的特定糖基化区域特异性单克隆抗体，测定出该特定区域没有进行糖化反应的白蛋白的浓度，再通过现有技术测定总白蛋白浓度，用总白蛋白浓度减去没有进行糖化反应的白蛋白的浓度即得到糖化白蛋白浓度；该方案所用的单抗易于制备，并且成本较低，并不受国外专利限制，便于广泛应用和推广。
文档编号G01N33/68GK102914656SQ20121025529
公开日2013年2月6日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者王钊, 赵艾钧, 谭韬 申请人:四川省新成生物科技有限责任公司