专利名称：富集肺癌细胞复合纳米微球的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于高分子化学和细胞生物医学领域，特别涉及一种结合肺癌细胞的复合 Fe3O4磁性纳米颗粒及其制备方法，以及一种富集和检测痰液中肺癌细胞的方法。
背景技术：
肺癌居十大恶性肿瘤之首，具有“三高”现象发病率高、死亡率高、上升幅度高； 是影响人类健康的主要疾病，与爱滋病并列成为21世纪主要医学问题之一。凭借目前诊断肺癌的手段，一旦发现和确诊是肺癌，基本上处于中晚期，尚难以获得有效的控制。因此，实现肺癌的早期诊断是实现早期治疗的长期未能破解的国际医学难题。痰液细胞病理学检查是目前极有希望开发推广为早期诊断肺癌的最有效的方法。 目前存在的最主要问题是1、痰液送检费时费力；2、假阴性率高QO 40% )，原因在于 痰液制片手工操作而导致细胞丢失(标本不能全部取用)、涂片的质量太差(不均勻、过厚， 过多的黏液、血液或炎细胞遮盖了不正常的细胞、细胞形态保存不佳)，细胞成分复杂(大量脱落上皮细胞、炎症细胞)，脱落肺癌细胞散在，分布不均。所以，必须去除无关细胞，才能做到低成本地连续检测，大幅度提高阳性率。因此， 肺癌细胞分离富集是实现肺癌早期诊断这个国际性难题首先要解决的问题。如果能够寻找到一种比较简便实用的方法将肺癌细胞从痰液中分离出来富集，早期治疗肺癌就有希望。

发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对痰液中细胞成分复杂，检测痰液中肺癌脱落细胞假阴性率高的缺陷，提供一种结合肺癌细胞的复合狗304磁性纳米颗粒及其制备方法，和一种检测痰液中肺癌细胞的方法。该方法检测痰液中肺癌细胞具有较高的阳性率。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种结合肺癌细胞的复合 !^e3O4磁性纳米颗粒，其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的狗304磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA(葡萄球菌A蛋白)和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。所述的抗⑶44抗体优选兔抗人⑶44，抗CK7抗体优选兔抗人CK7。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种如上所述的结合肺癌细胞的复合狗304磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤1)制备!^e3O4磁性纳米颗粒；2)在步骤1)所得的!^e3O4磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺；3)在步骤2、所得的聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4磁性纳米颗粒表面标记对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白，该复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。本发明中，步骤1)制备!^e3O4磁性纳米颗粒的方法可以本领域常规方法，较佳的采用共沉淀法。更佳的步骤1)具体包括将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩尔质量10倍于铁离子的环氧氯丙烷形成溶胶，静置后形成凝胶；制得的凝胶经陈化后用去离子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝胶进行400°C下退火处理即制得!^e3O4 沉淀；将制得的!^e3O4沉淀依次用去离子水和乙醇交替清洗，至pH值为中性，真空干燥，即得!^e3O4磁性纳米颗粒。步骤1)所述的!^e3O4磁性纳米颗粒的平均粒径范围较佳的是15 50nm，更佳的是20nm。本发明中，步骤幻在!^e3O4磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺的方法可以采用现有技术，较佳的，步骤2、具体包括将!^e3O4磁性纳米颗粒置于PBS缓冲溶液中，超声分散， 缓慢加入聚乙酰亚胺(PEI)，慢速充分搅拌均勻后，移至恒温水浴上继续慢速搅拌M小时， 水浴温度保持30°C ；用磁分离法将固体从溶液中分离，将固体依次用蒸馏水和甲醇交替清洗至PH值为中性，真空干燥，即得PEI修饰的!^e3O4纳米粒子。本发明中，较佳的，步骤幻具体包括将聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4纳米粒子悬浮于 0. OlM pH7. 2TBS之中，得纳米粒子溶液，其中聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4纳米粒子的浓度约为 3 X IO13个/ml ；用0. OlM pH7. 2TBS分别溶解蛋白A和蛋白B,混勻，4°C反应30分钟，即得复合蛋白溶液，其中，蛋白A浓度为10mg/ml，蛋白B浓度为lmg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白 B是抗CD44抗体和/或抗CK7抗体，优选兔抗人CD44和/或兔抗人CK7 ；将上述复合蛋白溶液与上述纳米粒子溶液均勻混合，室温60分钟，即得复合纳米磁性颗粒溶液。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是一种富集痰液中肺癌细胞的方法，包括以下步骤a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步骤a)所得的液化痰液中加入所述的复合纳米磁性颗粒溶液进行反应；c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是一种检测痰液中肺癌细胞的方法，包括以下步骤a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步骤a)所得的液化痰液中加入所述的复合纳米磁性颗粒溶液进行反应；c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞，将所得细胞重新悬浮，然后采用液基薄层细胞学检测系统将该悬浮液制片、染色、封片、镜检。本发明中，步骤a)中采集和液化痰液的方法是本领域常规方法。较佳的，痰液中加入碱性裂解液以充分液化痰液，所述的碱性裂解液优选丨^蛋白酶！^，川^ NaOH的水溶液。本发明中，步骤b)所述的反应优选室温静置15分钟。本发明中，步骤c)离心富集细胞的方法是常规方法，所述的离心优选500rpm，5分钟；离心所得的细胞优选悬浮在保存液中，保存液优选10%甲醇水溶液。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明中所述的“室温”是指试验操作间的温度，一般为25V。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明采用聚乙酰亚胺(PEI)对高磁性能狗304纳米颗粒表面进行氨基化处理，使聚乙酰亚胺上的亚甲基与铁配位，并通过调节 PH值和温度，使聚乙酰亚胺牢固与!^e3O4纳米颗粒相连接。该材料可以很好的分散于水溶液中，并且具有良好的生物相容性和顺磁性。为了提高结合肺癌细胞的能力，又标记了能结合肺癌细胞的复合蛋白，不仅有效地降低了成本，而且明显地提高了富集肺癌细胞的效率。 该复合I^e3O4纳米颗粒具有富集、分离痰液体系中肺癌细胞的功能，集成液基细胞病理学方法，提高了痰液中肺癌细胞检测的可靠性和准确性。检测痰液中肺癌细胞的阳性率比常规方法提高了 30%以上。并且增加了检测样本量，减少了被测者的往返，检测效率明显提高， 而且费用有所降低，适合于体检、普查。


以下结合

本发明的特征和有益效果。图1是聚乙烯亚胺包覆的纳米四氧化三铁纳米粒子。图2是复合纳米颗粒附着于肺癌脱落细胞表面。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 Fii3O4纳米颗粒的制备1)将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩尔质量10倍于铁离子的环氧氯丙烷形成溶胶，静置后形成凝胶；制得的凝胶经陈化后用乙醇清洗并干燥； 随后进行400°C下退火处理即制得狗304。2)反应结束后，将制得的!^e3O4依次用去离子水和乙醇交替清洗，至pH值为7。最后在真空条件下进行干燥，即得!^e3O4磁性纳米颗粒。3)取5g上述制备的!^e3O4磁性纳米颗粒，置于20ml去离子水中，超声(IOOOkHz) 分散30min后离心(或磁性)分离，得纳米!^e3O4沉淀A。4)将沉淀A 5g重置于IOml PBS缓冲溶液中，超声分散，缓慢加入70mg聚乙酰亚胺(PEI)，慢速200r/min充分搅拌均勻后，移至恒温水浴上继续慢速搅拌Mhr，水浴温度保持 30 0C ο5)用磁分离法将固体从溶液中分离，得沉淀B和上清液。6)将沉淀B依次用蒸馏水和甲醇交替清洗至pH值为7，然后真空干燥，即得PEI 修饰的!^e3O4纳米粒子，存放于干燥皿中备用。透射电镜和粒度分析结果表明，该PEI修饰的!^e3O4磁性纳米颗粒基本呈单分散、 球状、粒度分布比较窄、平均粒径约为20nm。其中电镜图见图1。实施例2复合纳米磁性颗粒的制备1、取PEI修饰的!^e3O4纳米粒子lOOmg，悬浮于IOml 0. OlM pH7. 2TBS之中，得纳米粒子溶液，其中PEI修饰的!^e3O4纳米粒子的浓度约为3X IO13个/ml。2、制备复合蛋白用:3ml 0. OlM pH7. 2TBS分别溶解蛋白A(SPA)和蛋白B (兔抗人⑶44和CK7)(均购自钰森生物科技有限公司)，混勻，置4°C反应30分钟，蛋白A浓度为 10mg/ml，蛋白 B 浓度为 lmg/ml。3、取上述AB复合蛋白溶液0. 5ml与上述纳米粒子溶液IOml均勻混合，室温60分钟，即得复合纳米磁性颗粒溶液。实施例3痰液中肺癌细胞的病理学检测将850例肺癌患者痰液标本随机分为2组。患者需连续3天留晨痰，2小时内送到医院，否则，痰液变质，细胞自溶，无法诊断。采集患者痰液5ml于痰盒内，加入0.5ml碱性裂解液(含1 %蛋白酶K，10% NaOH的水溶液)混勻，室温保持lOmin，充分液化痰液。实验组进行肺癌细胞富集和液基细胞病理学检测。在上述液化痰液中加入1/10 体积实施例2制得的复合纳米磁性颗粒溶液，混勻，静置15分钟。500rpm离心5分钟， 取沉淀在保存液(10%甲醇水溶液)中悬浮。然后采用新柏氏液基薄层细胞学检测系统 (Thinprep cytology test, TCT)将上述悬浮液制片、染色、封片、镜检(图2)。对照组进行常规细胞学方法检测痰液中的肺癌脱落细胞。用竹签挑取上述液化痰液，涂片，然后进行染色、封片、镜检。结果常规细胞学方法检测阳性率为6. 4% (54/850)，复合纳米微球处理后再行液基细胞学方法检测阳性率为38. 9% (331/850)。
权利要求
1.一种结合肺癌细胞的复合I^e3O4磁性纳米颗粒，其特征在于，其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的I^e3O4磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。
2.一种如权利要求1所述的结合肺癌细胞的复合!^e3O4磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)制备Fe^3O4磁性纳米颗粒；2)在步骤1)所得的!^e3O4磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺；3)在步骤幻所得的聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4磁性纳米颗粒表面标记对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白，该复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的!^e3O4磁性纳米颗粒的平均粒径范围是15 50nm。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)包括将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0.5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩尔质量10倍于铁离子的环氧氯丙烷形成溶胶，静置后形成凝胶；制得的凝胶经陈化后用去离子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝胶进行 400°C下退火处理即制得!^e3O4沉淀；将制得的!^e3O4沉淀依次用去离子水和乙醇交替清洗， 至PH值为中性，真空干燥，即得!^e3O4磁性纳米颗粒；步骤2、包括将!^e3O4磁性纳米颗粒置于PBS缓冲溶液中，超声分散，缓慢加入聚乙酰亚胺(PEI)，慢速充分搅拌均勻后，移至恒温水浴上继续慢速搅拌M小时，水浴温度保持30°C ；用磁分离法将固体从溶液中分离，将固体依次用蒸馏水和甲醇交替清洗至PH值为中性，真空干燥，即得PEI修饰的!^e3O4纳米粒子；步骤幻包括将聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4纳米粒子悬浮于0. OlM pH7. 2TBS之中，得纳米粒子溶液，其中聚乙酰亚胺修饰的!^e3O4纳米粒子的浓度约为3X IO13个/ml ；用0. OlM pH7. 2TBS分别溶解蛋白A和蛋白B，混勻，4°C反应30分钟，即得复合蛋白溶液，其中，蛋白A浓度为10mg/ml，蛋白B浓度为lmg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白B是抗⑶44 抗体和/或抗CK7抗体；将上述复合蛋白溶液与上述纳米粒子溶液均勻混合，室温60分钟，即得复合纳米磁性颗粒溶液。
5.一种富集痰液中肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步骤a)所得的液化痰液中加入如权利要求1所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞。
6.一种检测痰液中肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步骤a)所得的液化痰液中加入如权利要求1所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞，将所得细胞重新悬浮，然后采用液基薄层细胞学检测系统将该悬浮液制片、染色、封片、镜检。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤a)所述的痰液中加入碱性裂解液以充分液化痰液，所述的碱性裂解液蛋白酶K，10% NaOH的水溶液。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤b)所述的反应是室温静置15分钟。
9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤c)所述的离心是500rpm，5分钟； 离心所得的细胞悬浮在保存液中，保存液是10%甲醇水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种结合肺癌细胞的复合Fe3O4磁性纳米颗粒及其制备方法。其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的Fe3O4磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。本发明还公开了一种富集和检测痰液中肺癌细胞的方法，包括a)采集痰液，充分液化痰液；b)加入所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；c)将反应液离心富集其中的细胞。将所得细胞重新悬浮，采用液基薄层细胞学检测系统(TCT)将该悬浮液制片、染色、封片、镜检。该方法检测痰液中肺癌细胞的阳性率比常规方法提高30％以上，检测效率明显提高，检测成本有所下降。
文档编号G01N1/34GK102344117SQ20101024631
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者严彪, 李成魁, 李辉, 陈岗 申请人:同济大学附属上海市肺科医院