专利名称：评价细胞状态的方法
技术领域：
本发明涉及评价细胞状态的方法，例如对进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平进行评价的方法，特别是对诱导分化成了心肌细胞或神经细胞的干细胞或前体细胞的分化水平进行评价的方法。
背景技术：
随着细胞工程学、再生医疗的发展，需要定量性地且迅速地对细胞的状态进行评价的方法。以往广泛利用由特定的基因、蛋白质的表达水平来评价细胞状态的方法。以下举出一例。从二十世纪七十年代起，对干细胞(例如作为iPS细胞、ES细胞等已知)、前体细胞的分化诱导进行了研究。直至二十世纪九十年代，主要通过使用特异性抗体的组织染色、流式细胞术来检测表达蛋白质，由此对该细胞的分化水平进行研究。因此， 仅得到半定量性的信息。但是，2000年以后，通常使用定量性的RT-PCR法，可以绝对定量性地检测分化时特异性的基因转录(非专利文献1)。但是，进行细胞分化时，存在虽然进行转录未翻译的基因，暗示基因的转录水平并非直接反映分化水平(非专利文献2)。还存在通过对分化诱导后释放到培养基中的特异性蛋白质进行检测来进行分化水平的绝对定量的方法(专利文献1)。但是，检测特异性的蛋白质时，检测灵敏度有可能变差。而且，不存在适当的分泌蛋白质时，有必要导入报道基因(专利文献2)。[专利文献 1]日本特开 2OO7-M8873(P2OO7-M8873A) [专利文献 2]日本特开 2007_374；34 (P2007-37434A) W02004/058687 Bustin, S. A. J Mol Endocrinol. 25: 69-193 (2000) [非专利文献 2] Wen, J. et al. , J Cellular Biochem 102: 149-160 (2007) [非专利文献3]现代化学、东京化学同人、435、55-61 (2007) M. Yamaguchi et al.，ABSTRACTS 24th International Carbohydrate Symposium. Oslo, Norway 27. July-1. August, 2008. C-P040
上述专利文献1、2和3以及非专利文献1 4的全部记载内容特别作为公开在本文中引用。

发明内容
如上所述，细胞的状态，例如伴随着细胞分化的基因转录变化的跟踪通常定量性优异，但是未必反映细胞的状态(非专利文献2)。另一方面，作为翻译产物的蛋白质的检测，在检测分化等细胞的状态的方面，可以成为准确的评价基准。但是没有适当的特异抗体或其检测灵敏度不优异时，难以进行定量性的分析，结果广泛使用性降低。因此，本发明欲解决的课题在于，发现替代基因、蛋白质的细胞状态、例如分化水平的新指标，进而发现可以尽可能定量性地掌握该新指标的方法，且提供使用该新指标，掌握分化成了特定细胞的细胞的分化水平的方法。本发明中，着眼于根据细胞状态的变化，例如分化状态的变化，而其糖链表达谱 (Π 7 r ^ ^ )可以定量性地变化(非专利文献4)。以往的糖链结构的分类方法是基于其生物合成路径而分为高甘露糖型、杂合型、 复合型三种。但是本发明人发现，如图5所示，若划分杂合型和复合型，则不能判定细胞的分化。比率表示百分率(%)、全部(total)表示表达量(pmol)。通过质量分析来确定糖链结构的方法中，是杂合型还是复合型，存在仅通过一次分析不能确定的结构。对于这种结构， 在图5的图中表示为N/I。因此，本发明中，基于由西村等人开发的高速全面的(網羅的)糖链富集技术 (glyC0bl0tting(糖印迹)法)(专利文献3、非专利文献3)，由细胞的状态变化，例如由分化前后的细胞全面地捕捉糖链，通过MALDI-T0F/MS等质量分析技术弄清存在于各细胞中的糖链的定量性的表达谱。基于此，联系细胞的分化水平(细胞的分化阶段或类型)，发现变动的糖链。即，鉴定成为分化标志的糖链或变动的糖链，确立灵敏度、特异性都高，定量性地判定分化水平的方法。进而发现，基于其中得到的信息，导入糖链类型的概念，由此可以将细胞亚类化，基于此，完成可以定量性地判定细胞分化的程度的本发明(图6)。具体地说，作为糖链的分类方法，分为高甘露糖型和除此之外(非高甘露糖)的类型两种，进而将非高甘露糖型分为(1)平分的有无、( 岩藻糖的个数(0、1或2以上)、(3) 唾液酸的有无以及修饰的种类、⑷支链度0或3以上)的类别，由此可以定量性地判定细胞的分化。根据本发明，通过在灵敏度以及特异性方面超过现有方法或具有互补优越性的方法，可以对细胞的状态，例如前体细胞、干细胞等的分化水平，即品质定量性地进行判定、管理。进一步地，可以对干细胞等的分化水平进行高灵敏度且定量性的测定，由此品质和安全性管理的系统提高，可以期待对再生医疗的贡献。


[图1-1]表示实施例1中得到的各糖链的表达量的表达谱。[图1-2]对由实施例1中得到的表达谱，根据糖链类型(单-Fuc、双-Fuc、 非-Fuc、高甘露糖)，亚类化而表现出来的结果进行说明。括弧内的数值表示所检测的糖链种类。[图1-3]表示实施例1中得到的进行分化诱导后的细胞和未进行分化诱导而培养的细胞的免疫细胞染色结果。[图2-1]表示实施例2中得到的各糖链的表达量的表达谱。[图2-2]对由实施例2中得到的表达谱，根据糖链类型(平分、平分以外、高甘露糖)，亚类化而表现出来的结果进行说明。括弧内的数值表示所检测的糖链种类。[图2-3]表示对于实施例2中得到的进行分化诱导后的细胞和分化前的细胞的免疫细胞染色结果。[图3-1]表示实施例3中得到的各糖链的表达量的表达谱。PeakNo. 68为内标的峰。[图3-2]表示实施例3中得到的各糖链的表达量的表达谱(图3-1的纵轴放大)。[图3-3]对由实施例3中得到的表达谱，根据分化前后的糖链类型(平分、平分以外、高甘露糖)，亚类化而表现出来的结果进行说明。[图4-1]表示实施例4中得到的各糖链的表达量的表达谱。PeakNo. M为内标的峰。[图4-2]表示实施例4中得到的各糖链的表达量的表达谱(图4-1的纵轴放大)。[图4-3]对由实施例4中得到的表达谱，根据分化前后的糖链类型(单-Fuc、 双-Fuc、非-Fuc、高甘露糖)，亚类化而表现出来的结果进行说明。[图4-4]对由实施例4中得到的表达谱，根据分化前后的糖链类型(单-SA、 双-SA、非-SA、单-GC、双-GC、高甘露糖)，亚类化而表现出来的结果进行说明。[图5]以往的根据高甘露糖型、杂合型、复合型的糖链结构的分类方法的例子。 比率表示百分率(%)、全部表示表达量(pmol)。[图6]实施例1和2中得到的本发明的方法中表示细胞分化的程度的结果。比率表示百分率(%)、全部表示表达量(pmol)。
具体实施例方式[用于评价细胞状态的糖链的类别确定方法]
本发明的第一实施方式是用于评价细胞状态的糖链的类别确定方法。该方法包括以下步骤
(1-1)获取状态变化前的细胞中含有的N-键合型糖链的获取定量性的表达谱， (1-2)获取状态变化后的细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱， (1-3)抽出在上述两种定量性的表达谱中存在量之间存在变动的糖链组中的至少一部分，
(1-4)将抽出的糖链组中含有的各糖链，基于糖链类型，分为高甘露糖型和非高甘露糖型的类别，且将非高甘露糖型进一步分为(1)平分的有无、( 岩藻糖的个数(0、1或2以上)、⑶唾液酸的有无以及⑷支链度O或3以上)的类别，
(1-5)由上述五种类别中，确定至少一种适合于评价细胞状态的糖链的类别。本发明的上述糖链类别确定方法中的细胞变化，除了干细胞或前体细胞的分化之外，还可以举出细胞分裂、形态变化、细胞死亡、癌化等，但是本发明不限于它们。此外，细胞的状态包状细胞的静态和动态(经时性的状态变化)。对于上述(1-1) (1-5)的各步骤，在后述的用于评价分化水平的糖链的类别确定方法中，以用于评价分化水平的糖链的类别确定为例进行说明。[评价细胞状态的方法]
本发明的第二实施方式是评价细胞状态的方法。该方法是使用在上述作为本发明的第一实施方式的糖链类别确定方法中确定的糖链类别的至少一种，评价细胞状态的方法。作为本发明的第二实施方式的评价细胞状态的方法包括(2-1)获取状态变化前后的细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱， (2-2)由上述定量性的表达谱中，对于通过权利要求1中记载的方法确定的糖链类别的至少一种，求出该类别中含有的糖链(组)的存在量或存在比率的状态变化的前后变化。对于作为本发明的第二实施方式的细胞状态评价方法，在后述的评价进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平的方法中，以评价分化水平的方法为例进行说明。[用于评价干细胞或前体细胞的分化水平的糖链的类别的确定方法]
本发明的第三实施方式是用于评价进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平的糖链类别的确定方法。该方法包括以下步骤
(3-1)获取在不存在分化诱导剂的条件下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，
(3-2)获取在分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，
(3-3)抽出上述两种定量性的表达谱中存在量有变动的糖链组中的至少一部分， (3-4)将抽出的糖链组中含有的各糖链，基于糖链类型，分为高甘露糖型和非高甘露糖型的类别，且将非高甘露糖型进一步分为(1)平分的有无、( 岩藻糖的个数(0、1或2以上)、⑶唾液酸的有无以及⑷支链度O或3以上)的类别，
(3-5)由上述五种类别中，确定至少一种适合于评价干细胞或前体细胞的分化水平的糖链的类别。步骤(3-1)和(3-2)
步骤(3-1)中，获取在不存在分化诱导剂的条件下培养的干细胞或前体细胞中含有的 N-键合型糖链的定量性的表达谱。步骤(3-2)中，获取在分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱。步骤(3-1)和(3- 可以依次进行或同时并行进行。依次进行时，可以先实施任意一个步骤。本发明还包括以下的其它实施方式，“干细胞”指的是具有多能性或多分化能力的细胞。作为“干细胞”的例子，可以举出例如胚胎干细胞、组织干细胞、生物体干细胞(生体幹細胞)或人工多能性干细胞(iPS细胞)。但是，只要是具有多能性或多分化能力的细胞， 则不限于上述例子。本发明还包括以下的其它实施方式。“前体细胞”是将上述干细胞进行分化诱导而成的细胞，且为具有多能性的细胞。若将干细胞进行分化诱导则根据分化的程度，有未分化的程度低于干细胞，但是依然具有多能性的细胞。本发明中，将这些细胞统称为“前体细胞”。“前体细胞”只要是具有多能性的细胞，则不特别限定。实施例1和实施例2中使用的 P19CL6、P19C6细胞株都为前体细胞。上述“干细胞”和“前体细胞”可以来自动物，例如可以为哺乳类、鱼类等。作为哺乳类的例子，可以举出人、小鼠、大鼠、绵羊、猪、猴等，作为鱼类的例子，可以举出鏘、斑马鱼等，但是不限于这些例子。本发明的第三实施方式中，在不存在或存在分化诱导剂的条件下进行的干细胞或前体细胞的培养中，作为干细胞或前体细胞的培养方法，可以用公知的方法进行。对分化诱导剂不特别限定，可以根据干细胞或前体细胞的种类适当选择。其中，本发明的第一实施方式由于是用于评价干细胞或前体细胞的分化水平的糖链的类别确定方法，因此，从糖链类别的确定容易方面考虑，优选使用分化诱导的效果高、能可靠地产生分化诱导的分化诱导剂。但是，根据分化诱导剂的种类，分化水平(细胞的分化阶段或类型)有可能不同，因此并非总是优选使用能可靠地产生分化诱导的分化诱导剂，可以根据目的分化水平而灵活运用是不言而喻的。此外，培养中的分化诱导剂的种类可以为一种或组合多种，此外，培养(培养基)中的分化诱导剂的浓度也可以适当选择。对于经培养的干细胞或前体细胞，对细胞中含有的N-键合型糖链实施分离、纯化处理，获取分离、纯化后的N-键合型糖链的定量性的表达谱是适当的。N-键合型糖链的分离和纯化，从不会遗漏N-键合型糖链且可以迅速地分离、纯化的观点考虑，优选例如通过专利文献3和非专利文献3中记载的糖印迹法进行。定量性的表达谱，以与分化诱导剂一起培养的干细胞或前体细胞的分化达到某种程度以上，即分化的进展达到明显的程度进行是适当的。其中，分化进展达到明显的程度，根据细胞的种类、分化诱导剂的种类、培养的条件等不同而变动，因此在考虑这些条件的基础上来适当确定是合适的。定量性的表达谱，优选通过使用分离、纯化过的N-键合型糖链，利用 MALDI-TOF/MS (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/ mass spectrometry)或 LC-ESI/SSI-TOF/MS (liquid chromatography-electrospray ionization/sonic spray ionization-time of flight/ mass spectrometry)来得至Ij0通过使用MALDI-TOF/MS或LC-ESI/SSI-TOF/MS，迅速且高精度地对N-键合型糖链进行定量， 从而可以获取定量性的表达谱。步骤(3-3)和(3-4)
步骤(3-3)中，抽出在上述步骤(3-1)和(3-2)中分别得到的两种定量性的表达谱中存在量之间有变动的糖链组中的至少一部分，进而在步骤(3-4)中，将步骤(3- 中抽出的糖链组中含有的各糖链，基于糖链类型，分为高甘露糖型和非高甘露糖型的类别，且将非高甘露糖型进一步分为(1)平分的有无、(2)岩藻糖的个数(0、1或2以上)、(3)唾液酸的有无以及⑷支链度O或3以上)的类别。本发明人通过实验的结果发现，作为用于评价干细胞或前体细胞的分化水平的糖链的类别，可以举出上述五种类别。定量性的表达谱中的糖链组，有时根据细胞的种类以及分化的方向和程度不同而不同，但是通常为几十 一百几十(百数十)程度。从其中抽出存在量根据分化水平变动的糖链组中的至少一部分，且将抽出的糖链组，基于上述糖链类型分为五种类别。步骤(3-5)
步骤(3-5)中，由上述五种类别中，确定至少一种适合于评价细胞状态的糖链的类别。 适合于评价细胞状态的糖链的类别，例如可以是将在不存在分化诱导剂的条件下培养的干细胞或前体细胞中，存在量或存在比率的经时性变动不显著，而在分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中，存在量或存在比率的经时性变动显著的糖链分类的类别。其中选择、确定的糖链的类别，在后述的评价进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平的方法中，可以用作分化水平的评价指标。[评价进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平的方法]
本发明的第四实施方式是评价进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平的方法。该方法包括以下步骤(4-1)经时性地获取在分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，
(4-2)由上述定量性的表达谱中，对于由本发明的第三实施方式的方法确定的糖链类别的至少一种，求出该类别中含有的糖链(组)的存在量或存在比率的经时性变化。步骤1)
步骤中，在分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱的获取，可以与上述步骤(3-2)同样地实施。但是，步骤中，定量性的表达谱是经时性地获取的。具体地说，随着培养时间的推移，对培养物进行取样，由取样的培养物分离、纯化N-键合型糖链，获取该N-键合型糖链的定量性的表达谱。定量性的表达谱的经时性获取在培养开始后进行至少一次，优选进行两次以上，例如可以为2次、 3次或4次，但是也可以进行超过4次。步骤0-2)
步骤G-2)中，对于由本发明的第三实施方式的方法确定的糖链的类别的至少一种， 求出定量性的表达谱中上述类别中含有的糖链(组)的存在量或存在比率的经时性变化。通过本发明的第三实施方式的糖链类别确定方法，发现可以用作以下说明的心肌分化水平评价方法和神经细胞分化水平评价方法中使用的分化标志的糖链类型(糖链类别)。具体说明如实施例中所述，作为可以用于心肌分化水平评价方法的分化标志，发现可以使用选自具有1个岩藻糖的类型的糖链组、具有2个岩藻糖的类型的糖链组中的至少一种。此外，作为可以用于神经细胞分化水平评价方法的分化标志，发现可以使用选自具有平分结构的类型的糖链组、不具有平分结构的类型的糖链组中的至少一种。以下对使用上述发现的分化标志的分化水平评价方法进行说明。[心肌分化水平评价方法]
本发明的第五实施方式是评价干细胞或前体细胞的心肌分化水平的方法。该方法包括
(5-1)经时性地获取在心肌分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的 N-键合型糖链的定量性的表达谱，
(5-2)求出选自上述定量性的表达谱中具有1个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率、具有2个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种。步骤(5-1)
作为心肌分化诱导剂，可以举出例如二甲基亚砜(DMS0)、催产素等。N-键合型糖链的定量性的表达谱的经时性获取可以与上述第三实施方式的步骤(3-2)同样地进行，但是所使用的分化诱导剂为心肌分化诱导剂。本发明的方法中使用的干细胞或前体细胞如上述第一实施方式所述，但是特别优选为P19CL6细胞、ES细胞、iPS细胞等。步骤(5-2)
求出选自定量性的表达谱中具有1个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率、具有2个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种。本发明中，基于这些中任意一种糖链组的存在量或存在比率，可以评价心肌分化水平，但是优选基于这三种糖链组的存在量或存在比率综合性地进行评价。具有一个岩藻糖的类型的糖链组例如为表1中的化3、化19、化31。具有两个岩藻糖的类型的糖链组例如为表1中的化20、化28、化34。高甘露糖型的糖链组例如为表1中的化5、化8、化14。如实施例1所示，在小鼠的前体细胞中，上述定量性的表达谱中具有一个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率因培养而增大的细胞，心肌分化水平提高。同样地，具有两个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率因上述培养而减少的细胞，心肌分化水
平提尚。[分化成神经细胞的分化水平评价方法(1)]
本发明的第六实施方式是对来自小鼠的干细胞或前体细胞的分化成神经细胞的分化水平进行评价的方法。该方法包括
(6-1)对于在诱导分化成神经细胞的分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链，经时性地获取定量性的表达谱，
(6-2)求出选自上述定量性的表达谱中具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率、不具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种。步骤(6-1)
作为诱导分化成神经细胞的分化诱导剂，可以举出例如视黄酸、DMSO等。N-键合型糖链的定量性的表达谱的经时性获得可以与上述第一实施方式的步骤(3-2)同样地进行，但是所使用的分化诱导剂为诱导分化成神经细胞的分化诱导剂。本发明的方法中使用的干细胞或前体细胞如上述第一实施方式所述，但是特别优选为P19细胞、P19C6细胞、ES细胞、iPS细胞等。步骤(6-2)
求出选自定量性的表达谱中具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率、不具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种。本发明中，基于这些中的任意一种糖链组的存在量或存在比率，可以评价分化成神经细胞的分化水平，但是优选基于这三种糖链组的存在量或存在比率综合性地进行评价。平分结构指的是具有平分GIcNAC的糖链的结构。已知若在骨架的糖链结构中附加平分GlcNAc，则分支不会进一步伸长或糖链不会被切断。此外，对糖链结构附加平分GlcNAc的反应通过被称为GnT-III的酶来催化。Qkeck, Y.，et al.，Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13: 167-176)(该文献的全部记载特别作为公开在本文中引用。)
具有平分结构的类型的糖链组例如为表2中的化15、化45、化64。不具有平分结构的类型的糖链组例如为表2中的化17、化21、化68。高甘露糖型的糖链组与上述第五实施方式中说明的相同。如实施例2所示，在小鼠的前体细胞中，上述具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率因培养而增大的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。进一步地，上述不具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率因培养而减少的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。此外，上述高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率因上述培养而减少的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。如实施例3所示，在小鼠的ES细胞中，上述具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率因培养而增大的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。进一步地，上述不具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率因培养而减少的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。此外，高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率因上述培养而减少的细胞， 分化成神经细胞的分化水平提高。[分化成神经细胞的分化水平评价方法(2)]
本发明的第七实施方式是对来自人的干细胞或前体细胞的分化成神经细胞的分化水平进行评价的方法。该方法包括
(7-1)经时性地获取在诱导分化成神经细胞的分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，
(7-2)求出选自上述定量性的表达谱中具有一个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率、不具有唾液酸的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种的经时性变化。步骤(7-1)
作为诱导分化成神经细胞的分化诱导剂，与步骤(6-1)同样地，可以举出例如视黄酸、 DMSO等。N-键合型糖链的定量性的表达谱的经时性获取可以与上述第一实施方式的步骤 (3-2)同样地进行，但是所使用的分化诱导剂是诱导分化成神经细胞的分化诱导剂。本发明的方法中使用的来自人的干细胞或前体细胞如上述第一实施方式所述，但是特别优选为ES细胞、iPS细胞等。步骤(7-2)
求出选自定量性的表达谱中具有一个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率、不具有唾液酸的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种的经时性变化。本发明中，基于这些中的任意一种糖链组的存在量或存在比率，可以评价分化成神经细胞的分化水平，但是优选基于这三种糖链组的存在量或存在比率，综合性地进行评价。具有一个岩藻糖的类型的糖链、不具有唾液酸的类型的糖链和高甘露糖型的糖链例如可以为实施例4的表4所示的糖链。如实施例4所示，在人的ES细胞中，具有一个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率因培养而增大的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。进一步地，不具有唾液酸的类型的糖链组(Non-SA)的存在量或存在比率因培养而增大的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。此外，高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率因上述培养而减少的细胞， 分化成神经细胞的分化水平提高。第五实施方式 第七实施方式中，在实施例中，各糖链组的存在量或存在比率的经时性变化的趋势得到关注，通过得到以及积累与各糖链组的存在量或存在比率的经时性变化和分化的阶段或类型的关系相关的信息，由各糖链组的存在量或存在比率，还可以定量性地掌握分化的阶段或类型。例如，在再生医疗中使用分化细胞时，在安全性方面优选不含有未分化状态的细胞。因此，准确地掌握通过培养得到的细胞的分化阶段是重要的。此外，确认分化为目的细胞也是重要的，因此要求准确地掌握分化的类型。通过本发明的方法还可以由各糖链组的存在量或存在比率来定量性地掌握分化的阶段或类型。
实施例以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。细胞糖组学试验方案(夕’，4 -笑夕7 口卜- —卟)_ 实施例中使用的细胞糖组学(glycomics)按照以下的试验方案实施。<细胞裂解液的制备和N-聚糖(N-Glycan)的游离>
在IOmM EDTA/PBS中，使用细胞刮棒从皿中回收细胞，用PBS进行洗涤。·加入1%(终浓度)TritonX-100，在冰上温育1小时，使细胞增溶溶解。·.加入80%(终浓度)丙酮，在一 20°C下温育一晚，使蛋白质级分沉淀。·离心后，用乙腈洗涤沉淀，完全除去丙酮。·将沉淀风干后，加入含有0.2%PHM(1-丙磺酸，2_羟基_3_肉豆蔻酰胺 (myristamido))的80mM的碳酸氢铵50 μ L，60°C下培养10分钟，使其增溶溶解。·向增溶溶解后的蛋白质级分中加入终浓度为IOmM的DTT，60°C下进行还原反应 30分钟。·加入20mM的碘乙酰胺，在室温、遮光条件下温育30分钟，由此将通过6.还原的
氨基酸残基烷基化。·加入800U胰蛋白酶，37°C下温育一晚。· 90°C下使胰蛋白酶失活10分钟，加入2U的肽-N-聚糖酶F，使N-键合型糖链游离。·对于游离的糖链，加入15pmol的A2 amide Glycan作为内标后，用真空离心蒸发浓缩器(SpeedVac)浓缩，使终容量为20 μ L。〈糖印迹〉
通过使用BlotGlyco H(住友^一夕7 ^卜株式会社)的糖印迹法富集上述10.中得到的N-键合型糖链。该方法根据下述文献中记载的方法实施。具体的方法如以下的文献所示。以下的四篇文献的全部记载特别作为公开在本文中引用。 · Furukawa J--i.，et al.， Anal.Chem.4·1094-1101 (2008) Baudino L.，etal.， J. Immunol.，181:4107--4112(2008) Baudino L.，etal.， J. Immunol.，181:6664--6669(2008) Uematsu R.，etal.，Mol. Cell. Proteom.，inpress(2008)
<使用BlotGlyco H珠的糖印迹>
通过肽-N-聚糖酶F进行游离，加入15pmol的A2 amide Glycan作为内标后，用真空离心蒸发浓缩器(SpeedVac)浓缩，使N-键合型糖链的终容量为20 μ L，将该N-键合型糖链加入到BlotGlyco H珠5mg中。·向1.中加入含有乙酸的乙腈180 μ L。· 80°C下静置45分钟。·用含有2M盐酸胍的16. 6mM碳酸氢铵溶液、纯水、含有1%三乙胺的甲醇溶液各200 μ L洗涤珠各2次。·加入含有10%乙酸酐的甲醇溶液100 μ L，室温下静置30分钟。·除去溶液后，用IOmM盐酸、甲醇、二嚅烷各200 μ L洗涤珠各2次。·加入含有IOOmM的3-甲基1-对甲苯基三氮烯的二嚿烷溶液100 μ L，60°C下静置1小时 1. 5小时。·依次用二嚅烷、纯水、甲醇、纯水各200 μ L进行洗涤。·加入含有20 μ L的20mM氨基氧基-WR和2%乙酸的乙腈180 μ L。· 80°C下静置45分钟。·用100 μ L的纯水溶出。实施例1
将来自小鼠胎儿性癌细胞的细胞P19CL6诱导分化成心肌细胞，进行未分化和分化后的细胞的糖组学。将3. 7X105cells/6cm皿(dish)的来自小鼠胎儿性癌细胞的细胞P19CL6接种到含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，对于分化诱导组，添加1% 二甲基亚砜(DMSO)后进行培养，对于对照组，不添加任何物质直接进行培养。培养开始后第16天，确认分化诱导组全部搏(拍動)后，将两组细胞回收，通过上述糖印迹(Glycoblotting)法进行细胞中的全部N-键合型糖链的捕捉、纯化。对于相当于200 μ g的全部细胞蛋白质进行分析，通过 MALDI-T0F/MS获取定量性的表达谱。图1_1所示的各糖链的表达量，使用通过与作为内标加入的已知量的低聚糖的谱图上的面积比来算出的糖链的绝对定量值。由该结果可以确认发现有显著变动的42种糖链。伴随着分化，具有一个Fuc的类型的糖链中，对于11种结构，发现增加趋势，而对于具有2个Fuc的糖链类型的6种结构，在分化诱导组中发现显著减少。如此根据糖链类型进行亚类化，由此可以定量性地判定细胞分化的水平(图1-2)。另外，对于进行分化诱导后的细胞和未进行分化诱导而培养的细胞，在以下的条件下进行免疫细胞染色。结果如图1-3所示，仅在进行分化诱导后的细胞中，确认心肌细胞中作为特异性蛋白质的心肌肌球蛋白的表达，在未进行分化诱导而培养的细胞中，未发现该蛋白的表达。由此可知，仅进行分化诱导后的细胞分化为心肌细胞。1次抗体MF20小鼠单克隆抗心肌肌球蛋白(mouse monoclonal anti-sarcomere myosin)
2 次抗体HRP-聚合物结合抗 IgG(HRP-polymer conjugated anti-IgG) 显色基质二氨基联苯胺(Diaminobenzidine (DAB))
进一步地，对于进行分化诱导后的细胞和未进行分化诱导而培养的细胞，进行搏动的确认(目视评价)。结果在未进行分化诱导的组中，未观察到搏动，而在存在分化诱导的组中，约80%的细胞中观察到搏动。另外，发现有显著变动的42种糖链、具有一个Fuc的类型的11种糖链、具有2个 Fuc的类型的6种糖链、高甘露糖型的糖链分别如下所述。具有一个Fuc的类型的糖链组为表1中化2、化3、化6、化10、化12、化15、化16、 化19、化M、化25、化27、化30、化31、化33、化36、化37、化39、化40、化41、化42。具有2个Fuc的类型的糖链组为表1中化20、化22、化观、化四、化34、化35、化38。
高甘露糖型的糖链为化5、化8、化14、化17。[表1]
权利要求
1.糖链类别的确定方法，该方法是用于评价细胞状态的糖链的类别确定方法，其特征在于，获取状态变化前的细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱， 获取状态变化后的细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱， 抽出在所述两种定量性的表达谱中存在量之间有变动的糖链组中的至少一部分， 将抽出的糖链组中含有的各糖链，基于糖链类型，分为高甘露糖型和非高甘露糖型的类别，且将非高甘露糖型进一步分为(1)平分的有无、( 岩藻糖的个数(0、1或2以上)、 ⑶唾液酸的有无以及⑷支链度O或3以上)的类别，由所述五种类别中，确定至少一种适合于评价细胞状态的糖链的类别。
2.细胞状态评价方法，该方法是评价细胞的状态的方法，其特征在于， 获取状态变化前后的细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，由所述定量性的表达谱中，对于通过权利要求1所述的方法确定的糖链类别的至少一种，求出该类别中含有的糖链(组)的存在量或存在比率的状态变化的前后变化。
3.糖链类别的确定方法，该方法是用于评价进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平的糖链的类别确定方法，其特征在于，获取在不存在分化诱导剂的条件下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，获取在分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，抽出所述两种定量性的表达谱中的存在量有变动的糖链组中的至少一部分， 将抽出的糖链组中含有的各糖链，基于糖链类型，分为高甘露糖型和非高甘露糖型的类别，且将非高甘露糖型进一步分为(1)平分的有无、( 岩藻糖的个数(0、1或2以上)、 ⑶唾液酸的有无以及⑷支链度0或3以上)的类别，由所述五种类别中，确定至少一种适合于评价干细胞或前体细胞的分化水平的糖链类别。
4.分化水平评价方法，该方法是评价进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平的方法，其特征在于，经时性地获取在分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，由所述定量性的表达谱中，对于由权利要求3所述的方法确定的糖链类别的至少一种，求出该类别中含有的糖链(组)的存在量或存在比率的经时性变化。
5.评价心肌分化水平的方法，该方法是评价干细胞或前体细胞的心肌分化水平的方法，包括经时性地获取在心肌分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，求出选自所述定量性的表达谱中具有1个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率、具有2个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种的经时性变化。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述具有1个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而增大的细胞，心肌分化水平提高。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述具有2个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而减少的细胞，心肌分化水平提高。
8.如权利要求5所述的方法，其中，所述高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而减少的细胞，心肌分化水平提高。
9.评价分化成神经细胞的分化水平的方法，该方法是对来自小鼠的干细胞或前体细胞分化成神经细胞的分化水平进行评价的方法，包括经时性地获取在诱导分化成神经细胞的分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，求出选自所述定量性的表达谱中具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率、 不具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种的经时性变化。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而增大的细胞，分经成神经细胞的分化水平提高。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述不具有平分结构的类型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而减少的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。
12.如权利要求9所述的方法，其中，所述高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而减少的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。
13.评价分化成神经细胞的分化水平的方法，该方法是对来自人的干细胞或前体细胞分化成神经细胞的分化水平进行评价的方法，包括经时性地获取在诱导分化成神经细胞的分化诱导剂的存在下培养的干细胞或前体细胞中含有的N-键合型糖链的定量性的表达谱，求出选自所述定量性的表达谱中具有一个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率、不具有唾液酸的类型的糖链组的存在量或存在比率和高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率中的至少一种的经时性变化。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述具有一个岩藻糖的类型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而增大的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述不具有唾液酸的类型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而增加的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。
16.如权利要求13所述的方法，其中，所述高甘露糖型的糖链组的存在量或存在比率因所述培养而减少的细胞，分化成神经细胞的分化水平提高。
17.如权利要求1 16中任意一项所述的方法，其中，所述N-键合型糖链通过糖印迹法进行了分离和纯化。
18.如权利要求1 17中任意一项所述的方法，其中，所述定量性的表达谱通过 MALDI-T0F/MS 或 LC-ESI/SSI-TOF/MS 得到。
19.如权利要求3 18中任意一项所述的方法，其中，干细胞为胚胎干细胞、组织干细胞、生物体干细胞或人工多能性干细胞(iPS细胞)。
20.如权利要求3 18中任意一项所述的方法，其中，前体细胞为将干细胞分化诱导而成的细胞，且为具有多能性的细胞。
全文摘要
本发明提供替代基因、蛋白质的细胞状态、分化水平的新指标，定量性地掌握该指标的方法，使用该指标掌握特定的细胞状态、分化水平的方法。用于评价细胞状态的糖链类别的确定方法。获取状态变化前的细胞的N-键合型糖链的定量性的表达谱，获取状态变化后的细胞中含有的N-键合型糖链定量性的表达谱，抽出在上述两种定量性的表达谱中存在量之间存在变动的糖链组，将抽出的糖链组中含有的各糖链，基于糖链类型，分为高甘露糖型和非高甘露糖型，(1)平分的有无、(2)岩藻糖的个数(0、1或2以上)、(3)唾液酸的有无以及(4)支链度(2或3以上)的类别，由上述五种类别中，确定至少一种适合于评价细胞状态的糖链类别。使用所确定的糖链类别的细胞状态、细胞分化的评价方法。
文档编号G01N27/62GK102224417SQ200980146398
公开日2011年10月19日 申请日期2009年11月20日 优先权日2008年11月21日
发明者天野麻穗, 武川泰启, 西村绅一郎 申请人:国立大学法人北海道大学