专利名称：一步法快速联检IrrE和BT蛋白的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一步法快速联检IrrE和BT蛋白的试剂盒。
技术背景在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要 对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。1. IrrE蛋白编码基因(irrE)是具有极端辐射抗性的耐辐射球菌 Deinococcusradiodurans中的全局调控因子，irrE基因的表达能显著增强大肠杆菌的辐 射抗性、氧化抗性和耐盐能力。该基因导入植物后，明显提高了植物的耐盐和抗旱能力。目 前，IrrE蛋白编码基因已转入玉米、棉花、烟草、油菜等作物。2.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是世界上应用范围最广的杀 虫微生物，杀虫BT晶体蛋白的作用方式主要通过Cryl类蛋白作用于鳞翅目害虫。目前，IrrE蛋白编码基因以及Cryl类蛋白编码基因已转入玉米、棉花、烟草、油菜 等作物。在转基因产品进行筛选和安全性评价过程中，需要对植物样本进行简便有效的检 测。但是，现有的检测技术如酶免、放免等方法，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)、 场地等因素的限制，而且检测时间长(酶免检测时间需20hr、放免需30min lhr)，检测成 本较高，很难推广应用。以往试纸条检测的方法虽可部分克服以上不足(如美国 EnviroLogixIncorporated, Strategic Diagnostics, Inc.禾口重庆金标生物技术有限公司 生产的试纸条)，但每种试纸条只能检测转基因作物中单一的外源基因，实际操作中容易产 生错误结果。例如如果检测者仅有IrrE检测试纸条，而检测对象中并未转入irrE基因， 而是转入BT crylAc基因，那么很可能会得出检测对象不存在外源基因的错误结果，造成不 必要的损失。因此，实践中急需有一种可同时检测转基因植物中IrrE蛋白和Bt晶体蛋白，且操 作简便、结果准确可靠、快速的装置
实用新型内容
本实用新型的目的是建立一种操作简便、结果准确可靠、快速，并能同时检测两种 不同转基因成分(IrrE和BT蛋白)的免疫检测试剂盒。本实用新型的技术方案是这样的它包括底板和上盖，底板盖入上盖后组成试剂 盒，其特征在于底板上放置有两条测试带；上盖有两个观测窗和两个加样孔。底板的上表面可以设置两条凹槽，每条凹槽内嵌入一条测试带，底板的厚度不限。所述底板或上盖可具有卡槽，以保证底板与上盖扣紧。所述观测窗优选是长方形。试剂盒的形似扁平的菱形盒。
0014]所述底板内的两条测试带，一条用于检测IrrE，另一条用于检测BT_CrylAc蛋白。所述测试带是一种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料 等多层材料制成。两种蛋白的测试带均可分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG 或兔抗鼠IgG多克隆抗体；IrrE蛋白测试带的样品检测区包被特异功能性IrrE，BT-CrylAC 蛋白测试带的样品检测区包被BT-CrylAc的单克隆抗体或多克隆抗体。当外源基因转入植物，并在植物中表达，将产生目的蛋白(IrrE和BT)，因此通过 检测样品中是否含有上述两种蛋白来确定该基因是否存在。如果外源基因转入植物，发生 基因沉默，无目的蛋白产生，将不能达到预期目的(耐盐或杀虫)。本实用新型的目的是这样实现的当底板盖入上盖后，每个观测窗和加样孔各分 别对应一条测试带，通过盒盖上的加样孔和观测窗可进行加样和观察检测结果，每个观测 窗可分别检查一种基因。每个观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖上用字母C、T标示出；检测时，将送检物品的同一种提取液分别滴加在试剂盒的两个加样孔中，3-5分钟 后，通过肉眼就可以通过上盖的观测窗直接观察到准确的检测结果。对于每个观测窗来说，用以下方式判断检测结果1、阴性(-)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带。检测结果待检样品中不含待检基因或其含量在其阈值以下。2、阳性(+)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带，在测试区(T)内同时出现紫红 色条带。检测结果待检基因含量在阈值以上。3、无效反应状况质控区(C)未出现紫红色条带，检测结果表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。本实用新型所述试剂盒的优点在于经济高效一个检测盒可同时检测2种不同的转基因成份，大大降低了使用成本；简便快速2种不同的转基因成份一步法操作，同时检测，不需其它任何附加仪器 设备。直接将待测样品液滴加在加样孔中，3-5分钟可出结果；检测结果直观不借助任何仪器，用肉眼可观察到结果；应用广泛可检测玉米、棉花、烟草、油菜等多种农作物的叶片、种子及加工产品。由于本实用新型提供的联检试剂盒同时可对植物样品进行IrrE和BT-CrylAc分 析，检测快速、特异、敏感、方便，特别适用于转基因产品的研制开发和转基因产品的快速筛 选，可用于边防、海关植物检测、食品安全检测及种子经营销售部门现场、快速筛查待测样品。

图1和图2是本实用新型一种试剂盒的结构示意图，其中图1是底板的俯视图，图 2是试剂盒上盖的俯视图；图1中有两条测试带，图2中1是加样孔，2是观测窗，T是测试区，C是质控区。
具体实施方式
本实用新型试剂盒中的测试带的制备以制备检测IrrE的测试带来举例说明实施例1制备测试带1. IrrE单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL。1周后，将IrrE单抗杂交瘤细胞注射于以上预先 处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1 3X 106。10天后收获腹水，以上 过程皆在无菌条件下完成。2. IrrE单克隆抗体的纯化1)以DEAE离子交换层析及S印hacryl S 300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE 平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3，000 X g离心15分钟一上清液加50 %硫酸铵沉 淀，过夜一3，000 X g离心20分钟一沉淀溶于0. 01M磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) — S-300凝胶 柱一DEAE Blue层析柱一0-800mMNaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95%以 上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的0. D.值，按以下公式计算蛋白 含量0D279/1.4 = mg/mL (纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；5)单抗活性测定选用IrrE抗原包被ELISA板(1 P g/孔)，及羊抗鼠IgG_HRP复 合物，测定各单抗效价(大于1 5000)。3.羊抗D0At高效价免疫抗血清的制备和纯化1)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫二次，每次间隔一月一第 二次加强后10天左右取血一离心取血清一硫酸铵沉淀一DEAE离子交换层析纯化；2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定0D279，计算蛋白浓度。4.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0. 01 % HauCl4 加热至沸，加入一定量的柠檬酸三钠(Na3C6H507 *2H20)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金 溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入 0. 02% NaN3。2)将胶体金液500mL用0. 1M NaOH调pH8. 4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL，搅拌 20分钟。5，500Xg离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗 体沉淀，沉淀溶于10mL保存液中，用0. 45 y m微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4°C保存。5.膜反应体系Ml的制备1)将IrrE抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0. 1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约 0. 2-2mg/mL。2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0. 1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2. Omg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小10cmX 27cm，每张膜可 长25cm的检测及控制带各4条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；[0058]5)设置喷速为2 u L/cm, NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗IrrEAD2 (2mg/mL)在 NC膜上包被反应检测线，以1. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线的距离 为 4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液 抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素膜1. 8cmX27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置
室温保存备用。6.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，
室温保存。l)M2a制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 2cm/条；2)M2b制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 8cm/条；3)M3制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 2cm/条。7.膜反应体系M4的制备1)取胶体金_单抗复合物加稀释液，混勻配成工作浓度；2)将溶液加入喷涂机Biodot的Air jet喷头储存瓶中；3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s ；4)喷制规格为0.5-1. 5cmX 25cm/条，每条喷2遍；5)于37°C烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。8.反应体组装1)在M6塑料基板上贴双面胶带M7 二条；2)在M7中间贴反应膜Ml (18mm)，离M6上缘约22mm ；3)在M7上贴M5 (22mm)，与M6上缘对齐并与Ml上缘交；4)在M7上贴M2a (12mm)，与Ml下缘相接；5)在M2上贴M4 (10謹)，压住Ml下缘0. 5謹；6)在 M7 上贴 M3 (12mm),上缘压住 M4 约 2/3 ；7)在M7上贴M2b (18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住Ml约1. 5mm ；9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与Ml上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴于M6被10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3. 5mm规格。实施例2试剂盒装配将制备好的检测IrrE和检测BT蛋白的两种测试带分别嵌入底板的两个凹槽中， 然后将上盖与底板扣紧，即成试剂盒。将试剂盒、滴管和使用说明书装塑料袋封装后，即可。实施例3试剂盒使用过程1.检测样本处理及准备植物种子、叶子、籽苗等样本在检测前需经研 ，并以蒸馏水抽提和稀释。为获得最佳检测效果，各不同样品应根据下表中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样本混勻，
静置，取上清液作为检测样品。
2.检测及结果将检测盒平放，用所配塑料吸管吸取样品液，滴加4-5滴于检测盒的加样孔1中， 吸水材料使待检样品缓慢移动，膜反应体系被启动。无论待测基因是否存在于植物样品中， 一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否 有足够的植物样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。3.结果判定每一个观测窗⑵检测一种待检基因是否存在。以下以检测IrrE为例说明1)如样本中不含特定IrrE蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶体金抗体在层析过 程中不会被固定在膜上检测带内的单抗免疫，因而测试区内(T)不会出现一条紫红色检测 带，显示阴性(_)结果，即仅在质控区(C)内出现一条紫红色条带。2)如果待植物样品中IrrE蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检测带上 的另一单抗结合，在测试区内(T)将还出现另一紫红色检测带，显示阳性(+)结果，即在质 控区(C)和检测区内各出现一条紫红色条带。注意测试区(T)内的紫红色条带可显现出 颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，都应判定为阳性结果。3)如质控区(C)未出现紫红色条带，则检测结果无效，表明不正确的操作过程或 试剂盒已变质损坏。
权利要求一步法快速联检IrrE和BT蛋白的试剂盒，它包括底板和上盖，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于底板上放置有两条测试带；上盖有两个观测窗和两个加样孔。
2.根据权利要求1所述的一步法快速联检IrrE和BT蛋白的试剂盒，其特征在于所述 底板的上表面设置有两条可嵌入测试带的凹槽。
3.根据权利要求1或2所述的一步法快速联检IrrE和BT蛋白的试剂盒，其特征在于 所述底板或上盖具有卡槽。
4.根据权利要求1或2所述的一步法快速联检IrrE和BT蛋白的试剂盒，其特征在于 所述观测窗是长方形。
专利摘要本实用新型涉及一步法快速联检IrrE和BT蛋白的试剂盒。本试剂盒由底板、上盖组成；底板内有两条测试带；上盖有两个观测窗和两个加样孔。本试剂盒可一步同时检测2种不同的转基因成份，不需其它任何附加仪器设备。本试剂盒操作简便、检测结果形象、准确、快速只要将送检物品的提取液分别滴加在试剂盒的两个加样孔中，3-5分钟后，通过肉眼就可以通过观测窗直接观察到准确的检测结果。
文档编号G01N21/33GK201600373SQ20102011418
公开日2010年10月6日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者刘奇, 周正富, 张维, 林敏 , 郑建, 陈明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所