专利名称：一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法
技术领域：
本发明为一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，特别是指用紫外分光光度法来快速、定量测定的方法，涉及生物技术领域。
二.
背景技术：
有关灵芝[赤芝Ganoderma lucidum(Fr.)Karst]多糖类成分的分离纯化，成份结构、药理、免疫抗肿瘤活性的研究及临床应用已广泛见诸文献，对于三萜类化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活性也有一些报道，并且一直是国际上灵芝研究的一个重要方向，其生物活性包括抑制肿瘤细胞增殖、抗病毒、抑菌、镇痛、保肝护肝等。灵芝中三萜类化合物的提取工艺大致为灵芝子实体精粉经过乙醇提取，氯仿溶解，饱和NaHCO3萃取，HCl酸化，氯仿萃取，减压蒸馏干燥等步骤，即可得到淡黄色固体结晶。(参见王帮武等。灵芝酸性组份的提取分离及抑菌活性研究。北京理工大学学报，2002，22(1)125-128)目前国内市场上灵芝产品种类繁多，很多产品以三萜类作为功效组份。由于对此类活性组份还没有简单实用的检测方法，导致无法对其质量进行快速有效的检测和定量测定，因此市场上经常出现名不副实的宣传。本发明描述的是用紫外分光光度法来快速测定灵芝供试品中三萜类物质含量的一种方法，具有缩短测定时间，简化检测工艺，重复性好，成本较低，实施容易等优点。
三.

发明内容
本发明的目的在于建立一种用紫外分光光度法快速定量测定灵芝供试品中三萜类化合物含量的方法。
1.本发明所用仪器为紫外可见双光束分光光度计、高压液相色谱仪、色谱柱、紫外检测分析仪。
2.本发明所需材料为灵芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst)子实体；甲醇和醋酸为色谱纯试剂；三氯甲烷、碳酸氢钠等为分析纯试剂；0.45μm微孔滤膜。
3.本发明所指测量对象为灵芝(Ganoderma lucidum(Fr.) Karst)子实体中的三萜类化合物，具有以下一些特征
A.其外观为淡黄色固体结晶。
B.色谱特征薄层色谱条件GF-254硅胶板，展开剂V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5。在波长254nm检测下，Rf值0.35～0.90。高压液相色谱条件检测波长250～260nm，谱带宽度16，参比波长360nm，谱带宽度100，甲醇溶解样品，浓度1mg/mL，进样量10μL，流速0.8mL/min，柱温40℃；流动相5％醋酸—甲醇60∶40。惠普-1100型高压液相色谱仪分析显示8个主要特征峰，相对保留时间α分别为0.78、0.88、0.92、1.00、1.12、1.27、1.48、1.61，8个主峰面积百分数在70％以上。
C.光谱特征其甲醇、氯仿、饱和NaHCO3溶液的紫外可见光谱中，在250～260nm处均有一个最大吸收峰；其红外光谱中，在3400cm-1，1025cm-1有羟基吸收峰，1710cm-1出现六元环酮，2955cm-1出现CH3-C-基团，2922cm-1和2851cm-1出现-C-CH2-C-强的伸缩振动峰。
D.化学结构有5种不同的母核结构，见附

图1。图1显示了利用紫外分光光度法所检测到的灵芝中三萜类化合物的五种结构母核，属于高度氧化的羊毛甾烷类衍生物，按分子中所含碳原子数目可分为C30、C27和C24三大类。在这五种基本骨架结构中，环上的双键大多位于Δ8(9)位，大部分在C11位和C23有羰基，而且在C3、C7、C15位也多被羰基或羟基所取代。而在三萜醇、醛和过氧化物的的结构中，环上大多存在二个不饱和双键、其位置在Δ7(8)、Δ9(11)位，C11位和C23位也不存在羰基，而且环上的取代基明显减少。
4.标准品以及标准曲线的制备A.标准品的制备与检测结果。制备步骤大致为先按照文献方法从灵芝精粉中提取总三萜类化合物，再利用反复硅胶柱色谱方法分离，以氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，50∶50梯度洗脱，收集98∶2洗脱出的馏分进行检测。薄层色谱检测选择展开剂V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5，紫外检测分析仪(检测波长254nm)和硅胶板GF-254。选择检测结果呈现单一斑点的馏分进行高效液相色谱制备得到一种单峰物质。用分析型高效液相色谱进行检测，样品浓度1mg·mL-1，上样量10μL，流动相为5％醋酸-甲醇(60∶40)，流速1mL·min-1，检测波长250～260nm，参比波长360nm。
检测结果为薄层色谱结果显示为单一斑点，Rf值为0.43。进一步用高压液相色谱分析，结果显示标准品纯度达100％，其保留时间为22.26min。其红外光谱中，在3400cm-1，1025cm-1有羟基吸收峰，1710cm-1出现六元环酮，2955cm-1出现CH3-C-基团，2922cm-1和2851cm-1出现-C-CH2-C-强的伸缩振动峰。
B.标准曲线的制备方法与绘制精确称取三萜类化合物标准品，用饱和碳酸氢钠溶液配成起始浓度200μg·mL-1。充分溶解后，2倍稀释成系列浓度200、100、50、25、12.5μg·mL-1。以饱和碳酸氢钠溶液为空白进行基线调零，光谱扫描范围200～400nm，采样间隔0.5nm，光谱带宽2nm。确定最大吸收波长后，在此波长下进行标样的定量测定，计算线性回归方程并进行显著性检验。
标准曲线绘制标准品系列浓度在200～400nm扫描波长范围内都有1个最大吸收峰，其最大吸收波长范围为250～260nm，线性回归方程为y＝-0.00574+0.01048x，相关系数r在0.9990～0.9999之间，SD＝0.01355，P＜0.0001(n＝6)。
5.供试品制备方法根据附图2，精确称取0.2～2.0g灵芝供试品置于洁净的试管中，加入氯仿，振荡摇匀，浸泡0.5h～1h后于2000r·m-1离心，取样器准确吸取上清液得提取液I，余液放入分液漏斗中，用饱和NaHCO3萃取2～3次，收集氯仿层和NaHCO3层得提取液II和III。
本发明的重点灵芝供试品中三萜类化合物含量快速检测的标准程序为精确称取0.2～2g灵芝子实体置于洁净试管中，加入氯仿浸提0.5～1h，氯仿体积ml数与样品重量g数之比为10∶1～20∶1。离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取2～3次，收集提取液III，即碱提的NaHCO3层为供试溶液，准确测量其体积后，稀释，运用紫外分光光度法在最大吸收波长250～260nm下测定供试溶液的光吸收值，根据标准曲线即可计算出样品中三萜类化合物的含量。本发明利用紫外分光光度法在提取三萜类化合物工艺的中间阶段，即碱提的NaHCO3层进行检测，省去了后面的酸化、氯仿萃取、减压蒸馏干燥等步骤，使得测定时间大大缩短。
其中利用提取液III，即碱提的NaHCO3层来进行定量测定的原因为参照附图2的提取液制备流程，分别对供试品的3种提取液I、II、III中所含的三萜类化合物进行了紫外分光光度定量测定，多次实验结果表明提取液I和III的最大吸收波长是257nm，II则有两个峰值247nm和283nm。组份II虽然在257nm没有最大吸收，但吸收值也高达1.856，表明提取液I中非三萜类组份在257nm处也有较强的吸收，因此不能用来进行检测。含有三萜类组份的提取液III与标准品一样仅在257nm处有最大吸收，因此可以测定III中三萜类含量以代表样品中三萜类的含量。
本发明的主要优点如下1.简便快速和重复性好。在提取三萜类化合物工艺的中间阶段，即碱提的NaHCO3层进行检测，省去了后面的酸化、氯仿萃取、减压蒸馏干燥等步骤，具有缩短测定时间，简化检测工艺，易于重复等优点，可以应用于灵芝及其相关产品的质量评估。
2.成本低分析所需样品量较少，仅为0.2～2g；3.操作流程简单，所用药品与仪器均为常见易得，在普通实验室或药厂即可实施；四.说明书附1显示了利用紫外分光光度法所检测到的灵芝中三萜类化合物的五种结构母核。
图2显示了灵芝中三萜类化合物含量快速测定流程图。
五.
具体实施例方式
实施例11仪器与材料1.1仪器 TU-1901型双光束紫外可见分光光度计；高压液相色谱仪(惠普1100series)；ODS RP-C18色谱柱5μm填料，250mm×4.6mm。手提式紫外检测分析仪UV-III型(检测波长254nm)。
1.2材料 灵芝(Ganoderma lucid um(Fr.)Karst)子实体(产地山东泰安)。甲醇和醋酸为色谱纯试剂，三氯甲烷、碳酸氢钠等为分析纯试剂。0.45μm微孔滤膜(国产)。
2实验方法2.1标准品制备与检测先按照文献方法从灵芝精粉中提取总三萜类化合物，再利用反复硅胶柱色谱方法分离，以氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，50∶50梯度洗脱，收集98∶2洗脱出的馏分进行检测。薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)检测选择展开剂V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5，紫外检测分析仪(检测波长254nm)，硅胶板GF-254。选择检测结果呈现单一斑点的馏分进行高效液相色谱制备得到一种单峰物质。用分析型高效液相色谱进行检测，样品浓度1mg·mL-1，上样量10μL，流动相为5％醋酸-甲醇(60∶40)，流速1mL·min-1，检测波长257nm，参比波长360nm。
2.2标准曲线制备精确称取三萜类化合物标准品，用饱和碳酸氢钠溶液配成起始浓度200μg·mL-1。充分溶解后，2倍稀释成系列浓度200、100、50、25、12.5μg·mL-1。以饱和碳酸氢钠溶液为空白进行基线调零，光谱扫描范围200～400nm，采样间隔0.5nm，光谱带宽2nm。确定最大吸收波长后，在此波长下进行标样的定量测定，计算线性回归方程并进行显著性检验。
2.3供试品制备根据图2，精确称取1g灵芝供试品置于洁净的试管中，加入氯仿15mL，振荡摇匀，浸泡0.5h后于2000r·m-1离心10min，取样器准确吸取上清液得提取液I(体积V1为9.7mL)。取300μL提取液I稀释20倍后进行光谱扫描和定量测定，余液放入50mL分液漏斗中，用饱和NaHCO3萃取，每次10mL，共3次，收集氯仿层和NaHCO3层得提取液II和III(III体积V2为30.0mL)，II和III分别稀释3倍和4倍后进行光谱扫描和定量测定。
3结果3.1标准品检测结果TLC结果用254nm紫外灯检测，标准品显示单一斑点，Rf值为0.43。进一步用高压液相色谱分析，结果显示标准品纯度达100％，其保留时间为22.26min。其红外光谱中，在3400cm-1，1025cm-1有羟基吸收峰，1710cm-1出现六元环酮，2955cm-1出现CH3-C-基团，2922cm-1和2851cm-1出现-C-CH2-C-强的伸缩振动峰。
3.2标准曲线绘制标准品系列浓度在200～400nm扫描波长范围内都有1个最大吸收峰，其最大吸收波长为257nm，各峰最大吸收波长的重现性较好，仪器精度较高。
将0～200.0μg/mL三萜类化合物标准品溶解在饱和NaHCO3中，在最大吸收峰257nm处测光吸收值，经Origin 6.1软件处理分析，其线性回归方程为y＝-0.00574+0.01048x，相关系数R＝0.99988，SD＝0.01355，P＜0.0001(n＝6)。表明标准品溶液的浓度与吸光度呈显著性线性相关，该法在此浓度范围内测定结果比较准确。
3.3供试品制备条件的确定为了探讨提取液I是否能够直接用于测定灵芝供试品中的三萜类化合物的含量，在本实验中对3种提取液I、II、III进行了紫外分光光度测量。结果表明提取液I和III的最大吸收波长是257nm，II则有两个峰值247nm和283nm。组份II虽然在257nm没有最大吸收，但吸收值也高达1.856，表明提取液I中非三萜类组份在257nm处也有较强的吸收，因此不能用来进行检测。含有三萜类组份的提取液III与标准品一样仅在257nm处有最大吸收，因此可以测定III中三萜类含量以代表样品中三萜类的含量。三萜类化合物含量可以根据以下公式计算出来 结论 1g灵芝精粉用15mL氯仿浸泡0.5h后，离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取3次，257nm检测提取液III中三萜类的含量。经3次测定，三萜类平均含量为1.48％。
实施例2按所述相同步骤重复进行实施例1，但灵芝供试品与氯仿投料比1(g)∶20(ml)，氯仿浸泡0.5h后，离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取3次，收集提取液III，即NaHCO3层，257nm检测中三萜类的含量。经三次测定，三萜类平均含量为1.51％。
实施例3按所述相同步骤重复进行实施例1，但灵芝供试品与氯仿投料比1(g)∶10(ml)，氯仿浸泡0.5h后，离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取3次，收集NaHCO3层，257nm检测提取液III中三萜类的含量。经三次测定，三萜类平均含量为1.49％。
实施例4按所述相同步骤重复进行实施例1，但灵芝供试品与氯仿投料比1(g)∶15(ml)，氯仿浸泡1h后，离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取2次，收集NaHCO3层，257nm检测提取液III中三萜类的含量。经三次测定，三萜类平均含量为1.50％。
实施例5按所述相同步骤重复进行实施例1，但灵芝供试品与氯仿投料比1(g)∶20(ml)，氯仿浸泡1h后，离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取2次，收集NaHCO3层，257nm检测提取液III中三萜类的含量。经三次测定，三萜类平均含量为1.52％。
实施例6按所述相同步骤重复进行实施例1，但灵芝供试品与氯仿投料比1(g)∶10(ml)，氯仿浸泡1h后，离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取2次，收集NaHCO3层，257nm检测提取液III中三萜类的含量。经三次测定，三萜类平均含量为1.50％。
权利要求
1.一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，其特征在于用紫外分光光度法对灵芝三萜类化合物进行快速、定量的测定。
2.根据权利要求1所述的一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，其特征在于紫外定量检测的最大吸收波长范围在250nm～260nm。
3.根据权利要求1所述的一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，其特征在于利用紫外分光光度法在提取三萜类化合物工艺的中间阶段，即碱提的NaHCO3层进行检测，省去了后面的酸化、氯仿萃取、减压蒸馏干燥等步骤，使得测定时间大大缩短。
4.根据权利要求1所述的一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，其特征在于标准品采用饱和碳酸氢钠溶液溶解；并且标准品在0～400.0μg·mL-1浓度范围内，相关系数r在0.9990～0.9999之间。
5.根据权利要求4所述的一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法中的标准品，其制备方法的特征在于灵芝子实体精粉经过乙醇提取、氯仿溶解、饱和NaHCO3萃取和HCl酸化得到总三萜，再利用反复硅胶柱色谱方法分离，以氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，50∶50梯度洗脱，收集馏分进行薄层色谱检测，选择较纯馏分通过高压液相色谱制备得到单体物质。
6.根据权利要求1所述的一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，其特征在于灵芝供试品制备方法为，精确称取灵芝供试品置于洁净的试管中，加入氯仿浸提0.5～1h，氯仿体积ml数与样品重量g数之比为10∶1～20∶1，离心得上清液，用等量饱和NaHCO3萃取2～3次，收集NaHCO3层并准确测量其体积，即为供试溶液。
全文摘要
本发明为一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，特别是指用紫外分光光度法来定量测定的方法，涉及生物技术领域。其技术方案为将灵芝供试品置于洁净试管中，加入氯仿浸提0.5～1h，离心得上清液，用等量饱和NaHCO
文档编号G01N21/31GK1546992SQ20031011711
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者杨新林, 黄书铭, 朱鹤孙, 徐建兰 申请人:北京理工大学, 无锡市三联高科技开发有限公司