专利名称：用于肝癌诊断的蛋白质指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学诊断技术领域，是一种可用于诊断肝癌的蛋白质指纹图谱。
背景技术：
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。全球每年约有26万新发病例，在中国平均每年有11万例肝癌发生，占全世界肝癌病例的45％，而且近年来发病率还在上升。晚期肝癌的年死亡率仍高达40例/10万。
目前，肝癌的诊断包括定位诊断和定性诊断两个方面。定位诊断主要依靠B超、CT、MRI、DSA等影像学检查。除B超外，其他检查费用较高，不适于普查。定性诊断中甲胎蛋白(AFP)仍是原发性肝癌最好的肿瘤标记物，AFP诊断肝癌的特异度为95％，但灵敏度仅为70％，有一部分肝癌患者AFP检查为阴性。肝癌早期症状不明显，许多患者发现时进行治疗常为时已晚。事实证明，血清、尿液等体液中含有许多可用于疾病早期诊断的标志物，而且血液中可能含有大量从未发现可用作疾病标志物的多肽，这是因为疾病早期就可在蛋白质水平出现未知的细微但重要的组合改变。肝脏是人体最为重要的脏器之一，承担着最为重要的生理生化功能，其本身能合成大量蛋白质。目前肝脏的发育过程、肝脏疾病的发生和发展的机制尚不明了，因而肝脏在生理和病理情况下蛋白质表达的差异成为生物学家、临床医生和药物学家的共同研究热点。
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(two dimensional polyacrylamide gelelectrophoresis，2D-PAGE)一直被认为是进行蛋白质组学研究的黄金工具。但是，它所能检测到的蛋白质也只是全部蛋白质组的一小部分，许多种蛋白质尤其是低分子量蛋白(MW＜20kD)不能用此方法分析出，需要用先进的技术手段进行蛋白质组学研究。Hutchens等提出的的表面加强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption-ionizationtime-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术，能够将蛋白质保留在特殊的固相层析表面，经离子化后用飞行时间质谱对其进行检测。其原理是利用经过特殊处理的固相支持物制成蛋白质芯片，根据不同蛋白质的物理、化学性质的不同，选择性地从待测生物样品中捕获靶蛋白质，利用激光脉冲辐射使芯片表面的分析物解析成带电离子，质荷比(质/荷mass-to-charge，m/z)不同的离子在电场中飞行时间不同，据此绘制出质谱图。经过软件处理后可直接显示样品中各种蛋白质的分子量、含量等信息。这是一种新的蛋白质检测技术。与2D-PAGE相比，这项技术操作简单，灵敏度高，检测需要的样品量少。目前应用较为普遍的是Ciphergen公司推出的蛋白质芯片飞行时间质谱仪(Proteinchiparray system)。该仪器可对生物粗样品(血清、尿液、体液等)直接进行蛋白质-蛋白质相互作用的检测，事先不需对样品进行处理，可以有效的检测低分子量的蛋白质(＜20kDa)，弥补了2D-PAGE的不足，而且与2D-PAGE相比，这项技术更敏感，检测需要的样品量少，25～50个细胞即可检测蛋白质谱。在寻找Alzheimer’病、前列腺、膀胱、乳腺及卵巢肿瘤等疾病的诊断标记物方面已经取得了较大进展。

发明内容
本发明利用Ciphergen公司的蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统，检测肝癌和肝硬化、慢性肝炎患者以及健康人血清的蛋白质表达谱，利用软件分析肝癌与肝硬化、肝炎及正常人血清对照蛋白质组的不同之处，发现新的肝癌相关性蛋白质，制作成指纹图谱，用于诊断肝癌。
本发明将肝癌、肝硬化、肝炎患者及正常人空腹血血清分别通过蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统(美国Ciphergen公司生产)检测，得到数据后使用Ciphergen公司Biosystems软件的Biomarker wizard功能，分别对肝癌组与疾病对照组(慢性肝炎、肝炎肝硬化)及正常对照组血清样品的蛋白质波谱进行比较，得出各自特异的蛋白质图谱，再根据统计分析发现肝癌与肝硬化、慢性肝炎及正常对照组两两间有统计学显著差异(P＜10-5)的蛋白质峰，使用Ciphergen公司的Bimarker patterns system 4.0软件对肝癌组与各对照组差异显著的特异蛋白质峰进行分析，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A，建立了肝癌分别与肝硬化、慢性肝炎及正常人两两鉴别的蛋白质指纹图谱，利用该指纹图谱，只要将受检人血清中相应蛋白质的质荷比及其波峰强度系数与本发明指纹图谱逐一进行对比分析，就可用于肝癌诊断。指纹图谱的检测方法如下1.处理血清抽取受检者空腹静脉血，分离出血清，深低温冰箱(-80℃)或液氮保存，备用。检测时，融解冰冻血清，离心；取血清样品加缓冲液，振摇。
2.准备芯片芯片孔中加入缓冲液；室温摇晃后除去缓冲液。重复以上操作一次。
3.芯片与蛋白质结合反应上述血清样品加缓冲液，稀释后上样，室温孵育后除去多余样品。
4.芯片冲洗芯孔中加醋酸钠溶液，摇床上孵育后除去溶液；重复2次；淋洗两次；去除溶液，将芯片移出操作平台；晾干芯片。
5、芯片能量吸收分子(EAM)准备每孔分两次加入EAM，两次之间允许各孔风干。
6、检测与分析质谱分析在SELDI-TOF阅读器中进行。
将芯片放入SELDI-TOF阅读器，将不同质荷比的蛋白质检测出来。
波峰结果分析使用Ciphergen Biosystems软件3.1.1版本，将分析得到受检者蛋白质指纹图谱中特异蛋白的波峰强度系数对照本发明相关指纹图谱依次逐一加以分析对比，以判断受检者是否患有肝癌。经临床试用，其鉴别肝癌与肝硬化的灵敏度为79.7％，特异度为88.9％；肝癌与慢性肝炎的灵敏度72.9％，特异度85.7％；肝癌患者与正常人的灵敏度88.1％，特异度84.6％；肝癌与非肝癌的灵敏度78.1％，特异度86.8％。


图1肝癌与肝硬化鉴别的蛋白质指纹图谱图2肝癌与慢性肝炎鉴别的蛋白质指纹图谱图3肝癌患者与正常人鉴别的蛋白质指纹图谱图4肝癌与非肝癌鉴别的蛋白质指纹图谱图中m/z表示特异蛋白的质荷比，A代表该蛋白质的波峰强度系数具体实施方式
1.材料1.1检测血清取受检者清晨空腹静脉血3mL，在4℃冰箱静置2h后离心(3000rpm，5min)。取血清，置深低温冰箱(-80℃)或液氮中保存，备用。
1.2所需主要试剂乙酸钠上海化学试剂公司氯化钠上海化学试剂公司氯化钾上海化学试剂公司三羟甲基氨基甲烷上海化学试剂公司磷酸氢二钠上海化学试剂公司磷酸二氢钾上海化学试剂公司N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)上海化学试剂公司1，4-二硫代苏糖醇(DTT)上海化学试剂公司三氟乙酸(TFA)上海化学试剂公司脲上海化学试剂公司Tritox-100上海化学试剂公司3-环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)上海化学试剂公司芥子酸(SPA)Ciphergen公司乙腈(ACN)SIGMA公司1.3所需主要仪器高速台式离心机(型号5415D)Eppendorf公司纯水系统MillApore公司制冰机Scotsman公司电子天平(BD202)METTLER TOLEDO公司微量加样器Eppendorf公司pH仪HANNA公司蛋白质芯片Ciphergen公司
BioprocessorCiphergen公司SELDI质谱议Ciphergen公司TY-B型多用摇床上海新波无线电厂4℃冰箱海尔公司-80℃冰箱Revco公司2.方法2.1试剂配制(1)U99M脲素 27.027g2％CHAPS 1.0g1％DTT 0.5g加入去离子水振荡、过滤，使最终容量为50mL，置-20℃保存。
(2)PBS溶液NaCl 8gKCl0.2gNaHPO41.44gKH2PO40.24g加入去离子水至1000mL，pH7.2。
(3)50mM NaAc称取NaAc 2.05g，去离子水加至500mL，调pH3.0(4)洗脱液Tritox-100稀释100倍与PBS等量混匀(5)U1 100mL U9加入900mL 50mM的HEPES溶液(pH7.0)2.2芯片选择弱阳离子(weak cation exchange，WCX2)芯片。
2.3芯片准备(1)每孔中加入150μL结合缓冲液50mM醋酸钠溶液(pH3.0)；(2)水平摇床上室温摇晃5分钟后除去缓冲液。重复以上操作一次。
2.4血清样品准备(1)血清，离心20000rpm；10分钟(2)每个样品取20μL血清，分别置于1.5mL离心管中；
(3)加30μL U9缓冲液于每一试管，振摇20分钟；(4)每管加入100μL U1缓冲液；(5)盖严并振荡30分钟。
2.5芯片与蛋白质结合反应(1)从上述150μL蛋白变性后的血清样品中取50μL样品，加200μL(1∶5稀释样品)结合缓冲液，使最后上样的样品总共稀释约40倍。取200μL上样。应仔细察看，确保每个点上无气泡。
(2)置于摇床上，室温孵育90分钟后除去样品。
2.6芯片冲洗(1)每孔中加入150μL50mM醋酸钠溶液(pH3.0)；(2)置于摇床上室温孵育5分钟，除去缓冲液；(3)重复1-2步骤2次(总共3次)；(4)用pH为3.0的1mM HEPES淋洗30秒；总共洗两次；(5)去除溶液，将芯片移出操作平台；(6)除去水分后晾干芯片。
2.7芯片EAM准备(1)制备EAMTFA 10μL加去离子水990μL，混匀后取60μL，与60μL ACN混匀后加入SPA中充分振荡5分钟。保持SPA过饱和，离心1分钟，溶液即为EAM；(2)每孔分两次加入0.5μL EAM，两次之间允许各孔风干。
2.8检测与分析质谱分析在SELDI-TOF阅读器中进行。
将芯片放入SELDI-TOF阅读器，激光器发射激光作用于芯片表面，使蛋白质在激光作用下从芯片表面解离下来并在电离场里飞行，质荷比大者飞的慢，检测器可根据这一原理将不同质荷比的蛋白质检测出来。
波峰结果分析使用Ciphergen Biosystems软件3.1.1版本，将分析得到受检者血清蛋白质波谱根据以下各指纹图谱(图1-图4)中特异蛋白的波峰强度系数按照指纹图的流程加以分析，以判断受检者是否患有肝癌。(见示例说明)。
本发明的肝癌蛋白质指纹图谱可由患者外周血清直接检测得到，准确率高，比现有的临床上诊断肝癌的指标特异度相当，灵敏度高，为临床上肝癌的诊断提供了一种新的方法。
结果分析使用Ciphergen Biosystems软件3.1.1版本对受检者血清蛋白质指纹图谱进行分析，得到肝癌特异性标志蛋白组成的指纹图谱，可用于肝癌的诊断。指纹图谱见图1-图4。
实施例1.鉴别肝癌与肝硬化取受检者空腹血血清，经检验得到其血清蛋白质波谱，按图1肝癌与肝硬化鉴别的蛋白质指纹图谱，观察蛋白质波峰，先看质荷比m/z为11492.9的蛋白质，其波峰强度系数A是否≤0.68，是则提示肝硬化，否则再看质荷比m/z为5401.3的蛋白质，波峰强度系数A是否≤11.79，是则提示肝癌，否则是肝硬化。
2.鉴别肝癌与肝炎取受检者空腹血血清，经检验得到其血清蛋白质波谱，按图2肝癌与慢性肝炎鉴别的蛋白质指纹图谱，观察蛋白质波峰，若受检者质荷比m/z为11520.8的蛋白质的波峰强度系数A≤0.77并且质荷比m/z为5319.5的蛋白质的波峰强度系数A≤2.35并且质荷比m/z为4654.7的蛋白质的波峰强度系数A＞4.05，则提示肝癌；若受检者质荷比m/z为11520.8的蛋白质的波峰强度系数A＞0.77并且质荷比m/z为11492.9的蛋白质的波峰强度系数A≥0.58，则提示肝癌；若受检者质荷比m/z为11520.8的蛋白质的波峰强度系数A＞0.77并且质荷比m/z为11492.9的蛋白质的波峰强度系数A＜0.58并且质荷比m/z为10881.2的蛋白质的波峰强度系数A≥3.52，则提示肝癌；其余情况均提示为肝炎。
3.鉴别肝癌患者与健康人取受检者空腹血血清，经检验得到其血清蛋白质波谱，按图3肝癌患者与正常人鉴别的蛋白质指纹图谱若受检者质荷比m/z为4071.3的蛋白质的波峰强度系数A≤5.20并且质荷比m/z为11492.9的蛋白质的波峰强度系数A＞0.58，提示肝癌；若受检者质荷比m/z为4071.3的蛋白质的波峰强度系数A≤5.20并且质荷比m/z为11492.9的蛋白质的波峰强度系数A≤0.58并且质荷比m/z为5086.6的蛋白质的波峰强度系数A＞3.69，提示肝癌；若受检者质荷比m/z为4071.3的蛋白质的波峰强度系数A＞5.20并且质荷比m/z为11492.9的蛋白质的波峰强度系数A＜0.58并且质荷比m/z为4654.7的蛋白质的波峰强度系数A≤6.42，提示肝癌；其余情况均提示为健康人。
4.鉴别肝癌与非肝癌取受检者空腹血血清，经检验得到其血清蛋白质波谱，按图4肝癌与非肝癌鉴别的蛋白质指纹图谱若受检者质荷比m/z为11520.8的蛋白质的波峰强度系数A≤0.08并且质荷比m/z为11703.4的蛋白质的波峰强度系数A＞0.45，提示肝癌；若受检者质荷比m/z为11520.8的蛋白质的波峰强度系数A≤0.08并且质荷比m/z为11703.4的蛋白质的波峰强度系数A≤0.45并且质荷比m/z为5086.6的蛋白质的波峰强度系数A＞0.54，提示肝癌；其余情况均提示为健康人。
利用本技术可以对肝癌与肝硬化、肝炎、健康人，尤其是AFP阴性的肝癌患者进行鉴别诊断，亦可用于肝癌高危人群的普查，对于肝癌的早期发现，早期诊断，早期干预以及肝癌的防治有着重要的意义。
权利要求
1.用于肝癌诊断的蛋白质指纹图谱，其特征在于由蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统检测的血清蛋白质波谱经过软件统计分析得到的肝癌患者多个特异蛋白质的质荷比m/z及其蛋白质波峰强度系数A绘制而成，所说的特异蛋白质质荷比m/z和波峰强度系数A分别为m/z＝4071.3，A≤5.20；m/z＝4654.7，A≤4.05或A≤6.42；m/z＝5086.6，A≤0.54或≤3.69；m/z＝5319.5，A≤2.35；m/z＝5401.3，A≤11.79；m/z＝10881.2，A≥3.52；m/z＝11492.9，A≤0.58或A≥0.58或A≤0.68；m/z＝11520.8，A＞0.08或A≤0.77；m/z＝11703.4，A≤0.45；其中肝癌与肝硬化鉴别的蛋白质指纹图谱I由m/z＝11492.9，A≤0.68；m/z＝5401.3，A≤11.79绘制而成，肝癌与慢性肝炎鉴别的蛋白质指纹图谱II由m/z＝11520.8，A≤0.77；m/z＝5319.5，A≤2.35；m/z＝11492.9，A≥0.58；m/z＝4654.7，A≤4.05；m/z＝10881.2，A≥3.52绘制而成，肝癌患者与正常人鉴别的蛋白质指纹图谱III由m/z＝4071.3，A≤5.20；m/z＝11492.9，A≤0.58或A≥0.58；m/z＝5086.6，A≤3.69；m/z＝4654.7，A≤6.42绘制而成，肝癌与非肝癌鉴别的蛋白质指纹图谱IV由m/z＝11520.8，A＞0.08；m/z＝11703.4，A≤0.45；m/z＝5086.6，A≤0.54绘制而成。
全文摘要
本发明涉及医学诊断技术领域，是一种可用于诊断肝癌的蛋白质指纹图谱。本发明用蛋白质芯片飞行时间质谱系统，检测正常人及肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者的外周血清样品，找出与肝癌患者差异显著的特异蛋白质峰，根据各蛋白质峰的质荷比m/z及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A，得到蛋白质指纹图谱，包括肝癌与肝硬化、肝癌与慢性肝炎、肝癌患者与正常人及肝癌与非肝癌鉴别的蛋白质指纹图谱。只要将被测人血清中相应蛋白质的m/z及其A值与本发明指纹图谱逐一对比分析，就可初步用于肝癌诊断，其鉴别肝癌与肝硬化灵敏度为79.7％，特异度为88.9％；肝癌与慢性肝炎灵敏度72.9％，特异度85.7％；肝癌患者与正常人灵敏度88.1％，特异度84.6％；肝癌与非肝癌灵敏度78.1％，特异度86.8％。
文档编号G01N30/00GK1588045SQ20041005332
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月2日 优先权日2004年8月2日
发明者朱樑, 谢渭芬, 张胜年, 郭军华, 吴诚 申请人:中国人民解放军第二军医大学