专利名称：一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法及打孔装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫扩散试验，具体地说是一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法及
打孔装置。
背景技术：
可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度
条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是
多糖、蛋白质、类脂等，与相应的抗体相比，抗原分子小(< 20pm)，单位体积内所含抗原量
多，具有较大的反应面积。为了使抗原抗体之间比例适合，不使抗原过剩，故一般均应稀释
抗原，并以抗原最高稀释度仍能与抗体出现沉淀反应为该抗体的沉淀反应效价(滴度)。 免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗
体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或
线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学
性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同
抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。 利用琼脂凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂凝胶，其内部为多孔网状。而
且孔径很大，可以允许大分子物质(分子量自十几万到几百万以上)自由通过。因为大多
数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼
脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此
是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。 现有的琼脂免疫扩散试验，操作过程复杂，而且需要在琼脂凝胶上一个一个地打 出梅花型孔，效率很低且容易使孔型不规则、边缘开裂。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状，而提供一种梅花型琼脂免 疫扩散试验方法及打孔装置。 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种梅花型琼脂免疫扩散试验方 法，包括以下步骤 (1)、以重量份数计，称取8至15份的琼脂粉，加入1000份重量浓度为1 %的生理 盐水或缓冲液，将混合液经水浴煮沸20分钟融化； (2)、将融化的琼脂溶液倒入平皿内，保持溶液厚度为2mm至3mm，自然冷却；
(3)、使用打孔装置在冷却后的琼脂凝胶上打孔，所述的打孔装置包括至少五个排 列成梅花型的打孔管和一个中心打孔管；打孔管和中心打孔管分别制有用于吸附琼脂的负 压腔，在负压腔内固定有螺旋针；负压腔的下端制有开口，打孔管的侧壁和中心打孔管的侧 壁在开口处制有斜边刀刃；各个打孔管通过中空的横管与中心打孔管固定连接，在中心打 孔管上端设置有橡胶负压囊，各个打孔管的负压腔与橡胶负压囊相连通；打孔时先挤压橡胶负压囊，将打孔装置垂直于琼脂平面，使打孔管和中心打孔管的斜边刀刃平整切入琼脂 凝胶，然后松开橡胶负压囊，使孔内的琼脂吸附在负压腔内；
(4)、取出打孔装置，挑出负压腔内的琼脂； (5)、将平皿在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，密封孔底，以免加样 后液体从孔底渗漏； (6)、以毛细滴管吸取样品加入琼脂孔内，加满且不溢出； (7)、盖上平皿盖，将平皿翻过来，置于湿盘中，在37°CT自由扩散24小时至48小时。 为优化上述技术方案，采取的措施还包括
上述步骤(1)中琼脂粉的重量份数优选为10份。 在上述的生理盐水或缓冲液中，可加入重量份数为0. 1份的硫柳汞或叠氮钠用以 防腐。 上述螺旋针的下端与打孔管下端或中心打孔管下端的斜边刀刃平齐。 上述的打孔管为六个，均匀分布在中心打孔管的周围，在上述步骤(3)中，打孔装
置在琼脂凝胶上打出相应的梅花型孔。 本发明的一种梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，包括至少五个排列成梅花型的 打孔管和一个中心打孔管；打孔管和中心打孔管分别制有用于吸附琼脂的负压腔，在负压 腔内固定有螺旋针；负压腔的下端制有开口，打孔管的侧壁和中心打孔管的侧壁在开口处 制有斜边刀刃；各个打孔管通过中空的横管与中心打孔管固定连接，在中心打孔管上端设 置有橡胶负压囊，各个打孔管的负压腔与橡胶负压囊相连通。
为优化上述技术方案，采取的措施还包括 上述的螺旋针上端与打孔管上端或中心打孔管上端固定连接，螺旋针的下端与打 孔管下端或中心打孔管下端的斜边刀刃平齐。 上述的打孔管为圆柱形管，上端封闭，下端沿制有上述的斜边刀刃；所述的横管与 打孔管的侧壁相连接，负压腔与横管相连通。 上述的中心打孔管为圆柱形管，上端边沿与橡胶负压囊的下端边沿密封连接，下 端沿制有上述的斜边刀刃，各个打孔管通过横管与中心打孔管的侧壁相连接，所述的横管 与橡胶负压囊相连通。 在上述的中心打孔管周围均匀排列有五至七个打孔管。 与现有技术相比，本发明的梅花型琼脂免疫扩散试验方法操作简单，效率高，而且 使用梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，可以一次性在琼脂凝胶上打出梅花型孔，并且梅 花型孔形状规则，不易产生边缘开裂。


图1是本发明实施例的俯视结构示意图；
图2是本发明实施例的仰视结构示意图；
图3是图1的A-A向剖视结构示意图；
图4是打孔装置进行打孔的结构示意图。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。
图1至图4所示为本发明的结构示意图。 其中的附图标记为打孔管1、螺旋针2、横管3、中心打孔管4、橡胶负压囊5、琼脂 凝胶6、平皿7、负压腔8、开口 9、斜边刀刃10。 本实施例的一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法，包括以下步骤
1、以重量份数计，称取8至15份的琼脂粉，加入1000份重量浓度为1 %的生理盐 水或缓冲液，将混合液经水浴煮沸20分钟融化；本步骤中琼脂粉的重量份数优选为10份， 在所述的生理盐水或缓冲液中，也可加入重量份数为0. 1份的硫柳汞或叠氮钠用以防腐。
2、将融化的琼脂溶液倒入平皿7内，保持溶液厚度为2mm至3mm，自然冷却凝固；
3、使用打孔装置在冷却后的琼脂凝胶6上打孔，所述的打孔装置包括六个排列成 梅花型的打孔管1和一个中心打孔管4 ;打孔管1和中心打孔管4分别制有用于吸附琼脂 的负压腔8，在负压腔8内固定有螺旋针2 ;负压腔8的下端制有开口 9，打孔管1的侧壁和 中心打孔管4的侧壁在开口 9处制有斜边刀刃10 ;各个打孔管1通过中空的横管3与中心 打孔管4固定连接，在中心打孔管4上端设置有橡胶负压囊5，各个打孔管1的负压腔8与 橡胶负压囊5相连通；打孔时先挤压橡胶负压囊5，将打孔装置垂直于琼脂平面，使打孔管 1和中心打孔管4的斜边刀刃10平整切入琼脂凝胶6，然后松开橡胶负压囊5，使孔内的琼 脂吸附在负压腔8内，在琼脂凝胶6上打上梅花型孔； 4、取出打孔装置及吸附在负压腔8内的琼脂，挑出负压腔8内的琼脂； 5、将平皿7在火焰上缓缓加热，使琼脂凝胶6上梅花型孔底边缘的琼脂少许熔化，
密封孔底，以免加样后液体从孔底渗漏； 6、以毛细滴管吸取样品加入琼脂孔内，注意不要产生气泡，加满且不溢出；加少 了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果； 7、盖上平皿7盖，将平皿7翻过来，置于湿盘中，在37"下自由扩散24小时至48 小时。 本实施例的梅花型琼脂免疫扩散试验方法用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗 血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻？L。若出现沉淀带完全融合，证明 为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说 明二者抗原完全不同。 中间孔含A， B， C三种抗血清，A、B和A、C为不同型的抗原呈双线或交叉，B、 C为 同一血清型的不同亚型部分融合，有交叉。 本实施例的梅花型琼脂免疫扩散试验方法用做血清流行病学调查时，将标准抗原 置琼脂凝胶6的中心孔，周围相间隔的三个孔加标准阳性血清，另外相间隔的三个孔分别 加待检血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所 出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀带，但两阳 性孔的沉淀带在接近待检孔时，两端均内向有所弯曲者判弱阳性。若仅一端有所弯曲，另一 端仍为直线者，判为可疑，需重检。重检时，可加大检样的量。 检样孔无沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在接近检样孔时变得模糊、消失，可能为 待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀带溶解，可将样品稀释后重检。
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用以检测的抗血清的效价时，将抗原置中心孔，抗血清倍比稀释后置周围孔，以出 现沉淀带的血清最高稀释倍数为该抗血清的琼扩效价。 在试验中不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、琼脂凝胶6上孔型不规则、边缘 开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂 导致细菌污染等所致。 抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移 和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。 本发明的一种梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，如图1至3所示，包括至少五个 排列成梅花型的打孔管1和一个中心打孔管4 ;打孔管1和中心打孔管4分别制有用于吸 附琼脂的负压腔8，在负压腔8内固定有螺旋针2 ;负压腔8的下端制有开口 9，打孔管1的 侧壁和中心打孔管4的侧壁在开口 9处制有斜边刀刃10 ;各个打孔管1通过中空的横管3 与中心打孔管4固定连接，在中心打孔管4上端设置有橡胶负压囊5，各个打孔管1的负压 腔8与橡胶负压囊5相连通。 在本实施例中，中心打孔管4周围均匀排列有六个打孔管l，成梅花型排列，使用 本实施例的打孔装置时，在琼脂凝胶6上打出相应的梅花型孔。 打孔管1为圆柱形管，上端封闭，下端沿制有所述的斜边刀刃10 ;所述的横管3与 打孔管1的侧壁相连接，负压腔8与横管3相连通。 中心打孔管4为圆柱形管，上端边沿与橡胶负压囊5的下端边沿密封连接，下端沿 制有所述的斜边刀刃10，各个打孔管1通过横管3与中心打孔管4的侧壁相连接，所述的横 管3与橡胶负压囊5相连通。 螺旋针2上端与打孔管1上端或中心打孔管4上端固定连接，螺旋针2的下端与
打孔管1下端或中心打孔管4下端的斜边刀刃10平齐。在打孔装置平整切入琼脂凝胶6
时，螺旋针2的下端穿入琼脂凝胶6，防止琼脂凝胶6从负压腔8中脱落。 本发明的最佳实施例已阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不
会脱离本发明的范围。
权利要求
一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法，其特征是包括以下步骤(1)、以重量份数计，称取8至15份的琼脂粉，加入1000份重量浓度为1％的生理盐水或缓冲液，将混合液经水浴煮沸20分钟融化；(2)、将融化的琼脂溶液倒入平皿(7)内，保持溶液厚度为2mm至3mm，自然冷却；(3)、使用打孔装置在冷却后的琼脂凝胶(6)上打孔，所述的打孔装置包括至少五个排列成梅花型的打孔管(1)和一个中心打孔管(4)；打孔管(1)和中心打孔管(4)分别制有用于吸附琼脂的负压腔(8)，在负压腔(8)内固定有螺旋针(2)；负压腔(8)的下端制有开口(9)，打孔管(1)的侧壁和中心打孔管(4)的侧壁在开口(9)处制有斜边刀刃(10)；各个打孔管(1)通过中空的横管(3)与中心打孔管(4)固定连接，在中心打孔管(4)上端设置有橡胶负压囊(5)，各个打孔管(1)的负压腔(8)与橡胶负压囊(5)相连通；打孔时先挤压橡胶负压囊(5)，将打孔装置垂直于琼脂平面，使打孔管(1)和中心打孔管(4)的斜边刀刃(10)平整切入琼脂凝胶(6)，然后松开橡胶负压囊(5)，使孔内的琼脂吸附在负压腔(8)内；(4)、取出打孔装置，挑出负压腔(8)内的琼脂；(5)、将平皿(7)在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，密封孔底，以免加样后液体从孔底渗漏；(6)、以毛细滴管吸取样品加入琼脂孔内，加满且不溢出；(7)、盖上平皿(7)盖，将平皿(7)翻过来，置于湿盘中，在37℃下自由扩散24小时至48小时。
2. 根据权利要求l所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法，其特征是所述步骤(1) 中琼脂粉的重量份数为10份。
3. 根据权利要求1所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法，其特征是在所述的生 理盐水或缓冲液中，加入重量份数为0. 1份的硫柳汞或叠氮钠。
4. 根据权利要求1所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法，其特征是所述螺旋针(2)的下端与打孔管(1)下端或中心打孔管(4)下端的斜边刀刃平齐。
5. 根据权利要求1所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法，其特征是所述的打孔管(1)为六个，均匀分布在中心打孔管(4)的周围，在所述的步骤(3)中，打孔装置在琼脂 凝胶(6)上打出相应的梅花型孔。
6. —种梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，其特征是包括至少五个排列成梅花型的 打孔管(1)和一个中心打孔管(4);打孔管(1)和中心打孔管(4)分别制有用于吸附琼脂的负压腔(8)，在负压腔(8)内固定有螺旋针(2);负压腔(8)的下端制有开口 (9)，打孔管 (1)的侧壁和中心打孔管(4)的侧壁在开口 (9)处制有斜边刀刃(10);各个打孔管(1)通 过中空的横管(3)与中心打孔管(4)固定连接，在中心打孔管(4)上端设置有橡胶负压囊 (5)，各个打孔管(1)的负压腔(8)与橡胶负压囊(5)相连通。
7. 根据权利要求1所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，其特征是所述的 螺旋针(2)上端与打孔管(1)上端或中心打孔管(4)上端固定连接，螺旋针(2)的下端与 打孔管(1)下端或中心打孔管(4)下端的斜边刀刃(10)平齐。
8. 根据权利要求1所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，其特征是所述的打孔管(1)为圆柱形管，上端封闭，下端沿制有所述的斜边刀刃(10);所述的横管(3)与打孔管(1)的侧壁相连接，负压腔(8)与横管(3)相连通。
9. 根据权利要求1所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，其特征是所述的 中心打孔管(4)为圆柱形管，上端边沿与橡胶负压囊(5)的下端边沿密封连接，下端沿制有 所述的斜边刀刃(IO)，各个打孔管(1)通过横管(3)与中心打孔管(4)的侧壁相连接，所述 的横管(3)与橡胶负压囊(5)相连通。
10. 根据权利要求1所述的一种梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，其特征是在所述 的中心打孔管(4)周围均匀排列有五至七个打孔管(1)。
全文摘要
本发明公开了一种梅花型琼脂免疫扩散试验方法及打孔装置，包括至少五个排列成梅花型的打孔管和一个中心打孔管；打孔管和中心打孔管分别制有用于吸附琼脂的负压腔，在负压腔内固定有螺旋针；负压腔的下端制有开口，打孔管的侧壁和中心打孔管的侧壁在开口处制有斜边刀刃；各个打孔管通过中空的横管与中心打孔管固定连接，在中心打孔管上端设置有橡胶负压囊，各个打孔管的负压腔与橡胶负压囊相连通。本发明操作简单，效率高，而且使用梅花型琼脂免疫扩散试验打孔装置，可以一次性在琼脂凝胶上打出梅花型孔，并且梅花型孔形状规则，不易产生边缘开裂。
文档编号G01N33/559GK101793896SQ201010127238
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月18日 优先权日2010年3月18日
发明者张疆 申请人:张疆