专利名称：犬瘟热减毒疫苗株及医用用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了一株犬瘟热减毒疫苗株，同时还公开了该犬瘟热减毒疫苗株的制备方法及医用用途，属于生物技术领域。
背景技术：
犬瘟热是影响犬类养殖业的重要疫病，疫苗接种是预防犬瘟热的最有效手段。然而因临床上犬瘟热病毒变异较快，可能导致广泛使用的疫苗株对现有流行株不能完全保护，而通过分离临床犬瘟热流行株并驯化为疫苗株，则可克服当前犬瘟热防治中所存在的困境。目前对犬瘟热病毒进行驯化致减时广泛采用非洲绿猴肾细胞(Vero)连续传代法，该方法传代致弱周期较长，并且还造成犬瘟热病毒主要保护性抗原——血凝素蛋白表达水平下降，严重影响以Vero细胞为基质所制备的犬瘟热疫苗的免疫原性。

发明内容
本发明提供了一个犬瘟热减毒疫苗株，为一种新的疫苗株，由当前流行的犬瘟热病毒强毒株通过传代细胞驯化而来。本发明还公开了该犬瘟热减毒疫苗株的制备方法。本发明进一步提供了该犬瘟热减毒疫苗株的用途。本发明公开的犬瘟热病减毒疫苗株，命名为犬瘟热病毒减毒疫苗株
caninc distempervirus virus vaccine sirai/ ),简称CC12-30 ;该疫苗株已于 2012 年 7月4日保藏《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏号为CGMCC6339。所述犬瘟热减毒疫苗株的H基因序列为SEQ ID NO :2。所述犬瘟热减毒疫苗株的N基因序列SEQ ID NO :5。所述犬瘟热减毒疫苗株的NP基因的序列SEQ ID NO :6。本发明的目的是通过如下的技术方案实现的
将筛选到的临床流行株CC12接种到猫肾传代细胞FK81细胞，按常规方法连续传代，每5代对其保护性抗原基因进行扩增和序列分析，当传代驯化的犬瘟热病毒主要保护性抗原基因的同源性与经典疫苗株相近时，终止传代，并以此代次的犬瘟热病毒作为候选疫苗株；对候选疫苗株通过易感犬和vero细胞传代，评价其遗传稳定性，从中筛选稳定性良好的犬瘟热病毒株作为犬瘟热减毒疫苗株，命名为CC12-30。获得本发明所述犬瘟热减毒疫苗株的方法，具体步骤如下
1)MEM无血清培养基的配制
将RPMI MEM、谷氨酰胺、NaHCO3用去离子水溶解，调pH值至7. 2后定容到1000毫升，
O.22 μ m滤膜过滤除菌，无菌分装；
2)双抗的配制
配制含青霉素100万单位、链霉素100万单位的双抗溶液；3)MEM完全培养基的配制
取89毫升步骤I的MEM无血清培养基，加入胎牛血清10毫升、双抗溶液I毫升；
4)病毒传代培养基的配制
取97毫升步骤I的MEM无血清培养基，加入胎牛血清2毫升、双抗溶液I毫升；
5)传代细胞的培养和犬瘟热病毒的增殖
将猫肾传代细胞FK81和VeiO细胞分别按常规方法分散，加入MEM完全培养基，当细胞生长对数生长后期时，正常分散，并加入病毒传代培养基，同时以培养基总体积的1%接种筛选到的临床流行株CC12，冻融法收获96h的培养液，用于传代或犬瘟病毒保护性抗原基 因的扩增；
6)筛选临床流行株和候选疫苗株
通过临床流行的犬瘟热病毒主要保护性抗原基因的比较获得主要流行株，在传代细胞上对主要流行株进行驯化致弱,对符合疫苗株要求的犬瘟热病毒传代株的遗传稳定性和免疫原性进一步鉴定。本发明的弱毒疫苗株和药学上可接受的佐剂能够制成防治犬瘟热疫苗。本发明的犬瘟热减毒疫苗株在制备防治犬瘟热药物中的用途。本发明的犬瘟热减毒疫苗株在制备诊断或检测犬瘟热病毒试剂中的用途。本发明的积极效果在于通过FK81细胞传代驯化致弱的犬瘟热减毒疫苗株CC12-30，具有犬瘟热病毒的典型特征，遗传稳定，接种犬可产生高滴度的中和抗体，并可抵抗强毒株的攻击，可有效解决现有犬瘟热疫苗与当前临床流行的犬瘟热病毒间的变异问题。


图I为CC12的N，H和NP基因PCR产物电泳 图2为CC12-30的N，H和NP基因PCR产物电泳 图3为电镜下CC12-30病毒粒子的形态图。
具体实施例方式为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例I
I、主要流行株的筛选
I)总RNA的提取及反转录
采集临床确诊为犬瘟热病犬的肺组织，用无菌PBS研磨制成10%肺组织悬液，-80°C贮存。从忙存液中取100 μ L悬液,按常规方法提取总RNA,应用PrimeScript RT reagent试剂盒进行逆转录反应。反转录体系如下
表1，RT反应体系5 X P rime Script Buffer 2 4,0 pL PrimeScript RT Enzyme I 1,0 yL RT Primer Mi^ 1.0 pL RN as8 Free dH i-0 4,0 yL 总 RNA 10,0 ill 总体积_ 20.0 pL_
逆转录在PCR仪中进行，反应条件为37°C逆转录反应15 min，85°C加热5 s使逆转录酶失活。反应结束后，将cDNA溶液放置于_20°C保存。2) H基因的PCR扩增
以cDNA为模板，应用针对H基因的引物 QHl TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC,·QH2 : CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT,
按表4体系进行PCR扩增。表2，PCR反应体系
IOxTaq Reaction Buffer5,0 pL
dNTP Mixture3,0 yL
QHl (lOpmol/μΙ)1.0 yL
QH 2 (lOpmol/μΙ)1,0 pL
模板1.0 yL
ddHr038,5 pL
Taq DMA 聚合酶 0.5μ10.5 yL
总体积__50 nL_
PCR扩增条件95°C预变性4 min ;94°C变性 I min，57. 5°C退火2 min，72°C延伸 I min，30次循环；72°C延伸10 min。PCR扩增产物经I. 0%琼脂糖凝胶电泳。3)扩增产物的序列测定
通过对多个分离株的序列测定和序列比对发现，分离株(命名CC12)与国内从2006-2011年间的多个NCBI收录的分离株序列同源性达99%以上，因此以CC12为当前主要的临床流行株。所扩增的CC12序列见SEQ ID NO :1，片段长度为846bp 表3.与CC12序列比对具有显著意义的分离株序列
权利要求
1.一种犬瘟热减毒疫苗株，命名为犬瘟热病毒减毒疫苗株(aite/watei/ canincdistempervirus virus vaccine sirai/ ),该疫苗株已于2012年7月4日保藏《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为CGCC6339。
2.权利I所述犬瘟热减毒疫苗株的H基因序列为SEQID NO :2。
3.权利I所述犬瘟热减毒疫苗株的N基因序列SEQID NO :5。
4.权利I所述犬瘟热减毒疫苗株的NP基因的序列SEQID NO :6。
5.获得权利要求I所述犬瘟热减毒疫苗株的筛选方法，包括以下步骤完成 收集临床犬瘟热病料，应用序列分析法筛选到主要临床流行株CC12并接种猫肾传代细胞FK81细胞，按常规方法连续传代，每5代对其保护性抗原基因进行扩增和序列分析，当传代驯化的犬瘟热病毒主要保护性抗原基因的同源性与经典疫苗株相近时，终止传代，并以此代次的犬瘟热病毒作为候选疫苗株； RT-PCR方法获得犬瘟热血凝素H基因，片段长度为873bp ； PCR :上游引物(QHl) :5，- TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC-3，； 下游引物(QH2) :5’ - CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT -3，； 对候选疫苗株通过易感犬和vero细胞传代，评价其遗传稳定性，从中筛选稳定性良好的犬瘟热病毒株作为犬瘟热减毒疫苗株，命名为CC12-30。
6.获得权利要求I所述犬瘟热减毒疫苗株的方法，包括以下步骤完成 1)MEM无血清培养基的配制 将RPMI MEM、谷氨酰胺、NaHCO3用去离子水溶解，调pH值至7. 2后定容到1000毫升，O.22 μ m滤膜过滤除菌，无菌分装； 2)双抗的配制 配制含青霉素100万单位、链霉素100万单位的双抗溶液； 3)MEM完全培养基的配制 取89毫升步骤I的MEM无血清培养基，加入胎牛血清10毫升、双抗溶液I毫升； 4)病毒传代培养基的配制 取97毫升步骤I的MEM无血清培养基，加入胎牛血清2毫升、双抗溶液I毫升； 5)传代细胞的培养和犬瘟热病毒的增殖 将猫肾传代细胞FK81和VeiO细胞分别按常规方法分散，加入MEM完全培养基，当细胞生长对数生长后期时，正常分散，并加入病毒传代培养基，同时以培养基总体积的1%接种筛选到的临床流行株CC12，冻融法收获96h的培养液，用于传代或犬瘟病毒保护性抗原基因的扩增； 6)筛选临床流行株和候选疫苗株 通过临床流行的犬瘟热病毒主要保护性抗原基因的比较获得主要流行株CC12，在传代细胞上对主要流行株进行驯化致弱，对符合疫苗株要求的犬瘟热病毒传代株CC12-30的遗传稳定性和免疫原性进一步鉴定。
7.一种防治犬瘟热的疫苗组合物，由权利要求I弱毒疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。
8.根据权利要求I所述的犬瘟热减毒疫苗株直接用于制备预防犬瘟热病的疫苗。
9.根据权利要求I所述的犬瘟热减毒疫苗株在诊断或治疗犬瘟热的试剂中的用途。
全文摘要
本发明提供了一株犬瘟热减毒疫苗株，同时还公开了该犬瘟热减毒疫苗株的制备方法及医用用途，通过FK81细胞传代驯化致弱的犬瘟热减毒疫苗株CC12-30，具有犬瘟热病毒的典型特征，遗传稳定，接种犬可产生高滴度的中和抗体，并可抵抗强毒株的攻击，可有效解决现有犬瘟热疫苗与当前临床流行的犬瘟热病毒间的变异问题。
文档编号G01N33/569GK102839158SQ20121031120
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者杨盛华, 张茂林, 陈启军 申请人:杨盛华, 张茂林, 陈启军