专利名称：一种检测邻苯二甲酸二甲酯的胶体金试纸卡及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测塑化剂的器具，尤其涉及检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，同时还涉及一种该胶体金试纸卡的制备方法。
背景技术：
邻苯ニ甲酸酯类化合物可干扰内分泌，使男性精子数量減少、运动能力低下、形态异常，严重的还会导致死精症和睾丸癌，是造成男性生殖问题的“罪魁祸首”，甚至影响胚胎 发育，表现出殖发育毒性。目前，环境中残留、积累的邻苯ニ甲酸酯可以说普遍存在，人体主要通过食品和空气两个途径吸收它。越来越多的权威科学家认定，过去几十年来男性精子数量和生育能力的下降与摄入越来越多的邻苯ニ甲酸酯有夫。为了男性健康，专家们呼吁男性少用化妆品。一般人容易会在塑胶制品包装中接触到邻苯ニ甲酸酯类，在生活中有很多食物在加工、カロ热、包装、盛装的过程里可能会造成塑化剂的溶出且渗入食物中。例如塑胶玩具、覆盖食物微波加热的保鲜膜、盛装食物的塑胶容器、室内装潢或家庭产品亦多数属于塑胶材质、吃手扒鸡的塑胶手套、医疗用的塑胶手套或输血袋等，都可见邻苯ニ甲酸酯类的踪影。专家发现，含有邻苯ニ甲酸酯的软塑料玩具及儿童用品有可能被小孩放进口中，如果放置的时间足够长，就会导致邻苯ニ甲酸酯的溶出量超过安全水平，会危害儿童的肝脏和肾脏，也可引起儿童性早熟。ー项最新的研究表明，邻苯ニ甲酸酯可能与美国男性肥胖以及糖尿病有夫。在1982年，美国国家毒理规划署的实验报告就已确证大小白鼠通过食物长期吸收邻苯ニ甲酸酯可引发肝癌。目前，邻苯ニ甲酸酯类化合物的检测方法有分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)、气相色谱/质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)。EPA的标准方法是GC-ECD-MS法，我国拟发布的标准方法是正相高效液相色谱法(NP-HPLC)。采用分光光度法分析PAEs时，只适用于PAEs总量的測定，在特定组分的检测上具有一定的局限性，并且检测限较高，难以适应微量检测的需要。色谱法是国内外比较常用的方法。在用GC-MS、HPLC方法检测PAEs时，具有更好的灵敏度和选择性。但这些方法大都需要复杂的前处理，昂贵的仪器设备，检测费时费力且成本高，与其它检测系统相比，一次检测样品量少，检测时间长，不适合现场快速检测，仅作为少数实验室的确证方法，满足不了环境和农产品检测快速简便的需要。目前还没有检测邻苯ニ甲酸酯的商品化的试剂盒和试纸条。因此，研究和建立具有我国自主知识产权的邻苯ニ甲酸酯免疫学检测方法，对提我国高坏境和农产品邻苯ニ甲酸酯控制和监测水平，保障农产品质量安全和消费者的健康具有重要意义。

发明内容
本发明的目的在于提供ー种敏感度高，检测时间短的检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶 体金试纸卡。同时，本发明的目的还在于提供了一种该检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡的制备方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，包括反应膜，样本垫，结合物释放垫，吸水垫和背衬，在反应膜上包被有邻苯ニ甲酸ニ甲酯-载体蛋白偶联物的测试区和羊抗鼠IgG的质控区，结合物释放垫包被邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物。所述的样本垫，结合物释放垫、反应膜及吸水垫依次设置在背衬上。所述的邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物由邻苯ニ甲酸ニ甲酯经过硝化与还原反应后形成4-氨基邻苯ニ甲酸ニ甲酷半抗原，然后再与载体蛋白偶联得到。所述的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物中的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体是以邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物作为免疫抗原免疫试验动物后制备获得。 所述的邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸。同吋，本发明的技术方案还采用了一种检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡的制备方法，包括以下步骤(I)制备包被邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；(2)制备具有包被邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应月旲；(3)将步骤(I)和步骤(2)制备好的结合物释放垫和反应膜分别与样本垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。本发明的制备方法具体包括以下步骤(I)半抗原制备将邻苯ニ甲酸ニ甲酯与经过硝化与还原反应后形成4-氨基邻苯ニ甲酸ニ甲酯半抗原；(2)将邻苯ニ甲酸ニ甲酯与载体蛋白偶联，形成邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物；(3)用邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髄瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌邻苯ニ甲酸ニ甲酯的单克隆抗体杂交瘤细胞株；(4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；(5)将制备的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物；(6)将邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，用含O. 1-1. 5%卵清蛋白的磷酸氢ニ钠和磷酸ニ氢钠配制的缓冲液浸湿30秒，37°C烘2h备用；(7)将邻苯ニ甲酸ニ甲酯-人血清白蛋白偶联物(HSA)包被在反应膜上构成测试区，并将羊抗鼠IgG包被在反应膜上构成质控区，用含O. I %牛血清的封闭液进行封闭；(8)将样本垫0· 1-1. 5%的兔血清蛋白、1-1. 5%吐温-20用磷酸氢ニ钠和磷酸ニ氢钠配制的缓冲液浸泡2h，37°C烘2h备用；(9)邻苯ニ甲酸ニ甲酯胶体金试纸卡的组装在背衬上按顺序依次粘附反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，然后切成3_宽的小条，加塑料盒，真空包装。
本发明的邻苯ニ甲酸ニ甲酯快速检测试纸采用高度特异性的抗体-抗原反应及免疫层析分析技术，在反应膜测试区包被邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联抗原、结合物释放垫包被胶体金标记的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有邻苯ニ甲酸ニ甲酷。通过待测样品中邻苯ニ甲酸ニ甲酯与包被在反应膜上的邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物共同竞争邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物，根据测试区红色条带有无或顔色深浅来判断待测样品液中是否含有邻苯ニ甲酸ニ甲酯或含量多少。本发明的试纸卡将样本垫盖住结合物释放垫可以延长检测结果的观察时间，样本垫也可以将检测液体充分吸收能与金标抗体完全接触充分反应、減少误差。本发明的胶体金试纸卡具有敏感度高、价格低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长等优点。
本发明提供的试纸可用于检测鸡肉、猪肉、尿液、蜂蜜等动物源性食品中的邻苯ニ甲酸ニ甲酯的残留含量。检测时，样品滴入试剂卡孔内，当邻苯ニ甲酸ニ甲酯在样品中浓度低时，胶体金抗体在层析过程中会被固定在反应膜上的邻苯ニ甲酸ニ甲酯偶联物结合，在测试区(T)质控区(C)内会出现各一条红色条帯。如果邻苯ニ甲酸ニ甲酯在样品中浓度高时，胶体金抗体与邻苯ニ甲酸ニ甲酯全部结合，从而在(T)区内因为竞争反应不会与邻苯ニ甲酸ニ甲酯偶联物结合而不出现红色条带。阴性样品在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在(T)区与(C)区内出现红色条带。阳性当(C)区显示出红色条带，而⑴区不显色时，判为阳性。阴性当(C)区显示出红色条帯，⑴区同时也显示出红色条带，且⑴区顔色接近(C)线或者浅于(C)线时，判为阳性。无效当(C)区不显示出红色条帯，则无论(T)区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效。


图I为本发明的试纸卡的结构示意图；图2为本发明的检测结果分析示意图。
具体实施例方式实施例I本实施例的检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，包括反应膜2，样本垫3，结合物释放垫4，吸水垫5和背衬1，在反应膜2上包被有邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物的测试区6和羊抗鼠IgG的质控区7，结合物释放垫4上包被有邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物8。本实施例的样本垫3，结合物释放垫4、反应膜2及吸水垫5依次设置在背衬I上。其中，邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物由邻苯ニ甲酸ニ甲酯经过硝化与还原反应后形成4-氨基邻苯ニ甲酸ニ甲酷半抗原，然后再与载体蛋白偶联得到。邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为人血清白蛋白。邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-肢体金标记物中的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体是以邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物作为免疫抗原免疫试验动物后制备获得。
实施例2本实施例的邻苯ニ甲酸ニ甲酯检测试纸卡的制备方法如下I.邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物的合成与鉴定(I) 4-氨基邻苯ニ甲酸ニ甲酯-牛血清白蛋白的合成取碳化ニ亚胺IOOmg用ρΗ8· O的10mol/L PBS液3. Oml充分溶解(简称I液)；取4-氨基邻苯ニ甲酸ニ甲酯IOmg溶于Iml ニ甲基甲酰胺(2液)；取牛血清白蛋白20mg溶于lmllOmol/L的PBs(pH8.0)液中(3液)；将(2液)与(3液)混合，在磁力搅拌下逐渐加入(I液)，4°C搅拌12h。用蒸馏水使之充分透析4-6天，得免疫抗原。2.邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体的制备(I)动物免疫将免疫抗原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为50 μ g/只，使其产生多克隆抗体。(2)细胞融合和克隆取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5 : I比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞 争ELISA法測定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将邻苯ニ甲酸ニ甲酯的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成I X IO8个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油O. 5ml/只，7天后腹腔注射邻苯ニ甲酸ニ甲酯的单克隆杂交瘤细胞IO5个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸按法进行纯化，纯化后的腹水放入_20°C环境保存。3.邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将I %氯金酸稀释成O. 01%，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每IOOmlO. 01 %氯金酸加入2ml I %柠檬酸三钠，继续煮沸，至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为ー个月。(2)邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下,用O. IM碳酸钾调胶体金的pH值至8. 2,按I 2 μ g/ml抗体胶体金加入抗体邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10% BSA至终浓度为I %，静置30min。12000rpm、4°C离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用，保存60天。4、结合物释放垫的包被将结合物释放垫浸泡于含有O. 1-1. 5%的卵清蛋白的磷酸氢ニ钠和磷酸ニ氢钠配制的缓冲液中浸湿30秒，37°C烘2h ;用点膜仪将制备好的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合物释放垫上，真空干燥，真空封装，置4°C备用。
5、硝酸纤维素膜的处理处理包被邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物构成测试区，包被羊抗鼠IgG构成质控区，再用含O. 1%牛血清的封闭液进行封闭。包被过程将硝酸纤维素膜用用磷酸缓冲液(含3%的甲醇)将邻苯ニ甲酸ニ甲酷-血蓝蛋白(KLH)偶联物稀释到10mg/mL，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为测试区，包被量为0.8 μ g/cm2，测试区靠近结合垫端，距结合垫端约8mm;用O. OlM pH 7. 4PBS缓冲液(含3%的甲醇)将羊抗鼠IgG抗体稀释到150yg/ml，用点膜仪将其包被于纤维素膜作为质控区，包被量为O. 8 μ g/cm2,质控区靠近吸水垫，距吸收垫约8mm，两线距离5_8mm。37°C烘干，封装。
6、胶体金免疫试纸卡的组装在PVC背衬上按顺序粘附硝酸纤维素膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，将贴样本垫盖住结合物释放垫，然后切成2-3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装。原包装应在18-25°C的环境中储存，有效期一年。本发明的试纸卡将样本垫盖住结合物释放垫可以延长检测结果观察时间，样本垫也可以将检测液体充分吸收能与金标抗体完全接触、充分反应，从而减少误差。实施例3 :样本中残留的检测I、样本前处理称取鸡肉、猪肉、猪肝、香肠、鱼肉、虾肉、蜂蜜、膨化食品等样本50g，匀浆，放入具塞三角瓶中，加入IOOml提取剂(甲醇、こ酸こ酯等)，提取lh。离心，取上清，浓缩至1ml，用PBS或生理盐水稀释。2、用试纸卡检测将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴，加后计时，5_8min内观察結果。超过IOmin样品检测判读无效。3、检测结果分析阳性当(C)区显红色条带，而⑴区不显色，判为阳性。阴性当(C)区显示出红色条帯，⑴区同时也显示出红色条带，且⑴区顔色接近或浅于(C)区时，判为阴性。无效当(C)区不显示出红色条帯，则无论(T)区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效。
权利要求
1.一种检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，其特征在于包括反应膜，样本垫，结合物释放垫，吸水垫和背衬，在反应膜上包被有邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物的测试区和羊抗鼠IgG的质控区，结合物释放垫上包被有邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物。
2.根据权利要求I所述的检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，其特征在于所述的样本垫，结合物释放垫、反应膜及吸水垫依次设置在背衬上。
3.根据权利要求I所述的检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，其特征在于所述的邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物由邻苯ニ甲酸ニ甲酯经过硝化与还原反应后形成.4-氨基邻苯ニ甲酸ニ甲酷半抗原，然后再与载体蛋白偶联得到。
4.根据权利要求I所述的检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，其特征在于所述的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物中的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体是以邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物作为免疫抗原免疫试验动物后制备获得。
5.根据权利要求3或4所述的检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡，其特征在于所述的邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸。
6.一种如权利要求I检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)制备包被邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫； (2)制备具有包被邻苯ニ甲酸ニ甲酯-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜； (3)将步骤(I)和步骤(2)制备好的结合物释放垫和反应膜分别与样本垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。
7.根据权利要求6所述的检测邻苯ニ甲酸ニ甲酯的胶体金试纸卡的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤 (1)半抗原制备将邻苯ニ甲酸ニ甲酯与经过硝化与还原反应后形成4-氨基邻苯ニ甲酸ニ甲酯半抗原； (2)将邻苯ニ甲酸ニ甲酯与载体蛋白偶联，形成邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物； (3)用邻苯ニ甲酸ニ甲酷-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌邻苯ニ甲酸ニ甲酯的单克隆抗体杂交瘤细胞株； (4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金； (5)将制备的邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物； (6)将邻苯ニ甲酸ニ甲酯单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，用含O.1-1. 5%卵清蛋白的磷酸氢ニ钠和磷酸ニ氢钠配制的缓冲液浸湿30秒，37°C烘2h备用； (7)将邻苯ニ甲酸ニ甲酷-人血清白蛋白偶联物(HSA)包被在反应膜上构成测试区，并将羊抗鼠IgG包被在反应膜上构成质控区，用含O. 1%牛血清的封闭液进行封闭； (8)将样本垫0.1-1. 5%的兔血清蛋白、1-1. 5%吐温-20用磷酸氢ニ钠和磷酸ニ氢钠配制的缓冲液浸泡2h，37°C烘2h备用； (9)邻苯ニ甲酸ニ甲酯胶体金试纸卡的组装在背衬上按顺序依次粘附反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，然后切成3_宽的小条，加塑料盒，真空包装。
全文摘要
本发明涉及一种检测邻苯二甲酸二甲酯的胶体金试纸卡及其制备方法，检测邻苯二甲酸二甲酯的胶体金试纸卡包括反应膜，样本垫，结合物释放垫，吸水垫和背衬，在反应膜上包被有邻苯二甲酸二甲酯-载体蛋白偶联物的测试区和羊抗鼠IgG的质控区，结合物释放垫上包被有邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体-胶体金标记物。本发明提供的试纸卡可用于检测鸡肉、猪肉、尿液、蜂蜜等动物源性食品中的邻苯二甲酸二甲酯残留含量。该试纸操作简单、成本低、灵敏度高、检测速度快、适合大规模推广、能够现场检测，适合大量样本筛查，不需专用仪器设备及专业人员，易推广实施。
文档编号G01N33/577GK102692503SQ201210011428
公开日2012年9月26日 申请日期2012年1月15日 优先权日2012年1月15日
发明者周变华, 孔涛, 常景周, 张才, 李嘉嘉, 李润乐, 杨自军, 王振华, 赵振升, 郝雪琴, 魏迎军 申请人:河南科技大学