专利名称：一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于V型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用。
背景技术：
腺病毒是一种没有包膜的直径为70 90 nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7 9 nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100 bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5’端同相对分子质量为55X IO3Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状结构。上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了 100余个血清型，其中人腺病毒有47种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。而V型腺病毒是目前最常用的腺病毒，具有广泛的应用前景。腺病毒可以感染并且在HEK293细胞中复制，而5型腺病毒表达一种特殊的外壳蛋白Hexon，感染腺病毒的HEK293细胞使用甲醇固定后，再用抗Hexon的一抗孵育，一抗会与腺病毒上的Hexon 蛋白结合，此时加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，待二抗与一抗结合后再加入辣根过氧化物酶的底物DAB进行染色，然后洗脱多余的染色液，被病毒感染的阳性细胞会被染成褐色，计数阳性细胞，利用公式计算病毒滴度。而其测定方法目前仅限于TCID50法，该检测方法耗时长，可重复性低，为精确测定带来极大挑战。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种测定V型腺病毒滴度的酶联免疫法。本发明的目的之二在于提供该酶联免疫法的操作方法。本发明的目的之三在于提供该酶联免疫法的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种用于V型腺病毒滴度检测的试剂盒，其特征在于该该试剂盒测定V型腺病毒滴度采用了酶联免疫法。—种制备根据权利要求1所述的用于测定V型腺病毒滴度的酶联免疫法，其特征在于该方法的具体步骤为
(1)选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成2. 5X IO5个/ml 的细胞悬液二4孔板每个孔中种入Iml细胞，37°C、5%0)2培养1小时。(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100 μ 1病毒样品。(3) 37°C、5% CO2 感染 2 天。(4)轻轻的去除培养液，沿着M孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0. 5ml, _20°C孵育 20mino(5)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。(6)使用1%BSA的PBS室温封闭1小时。(7)加入0. 25ml的IXanti-Hexon抗体溶液至每个孔中，室温孵育1小时。(8)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
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(9)加入0. 25mlIX辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，室温孵育1小时。(10)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。(11)加入0. 25ml新配置的IXDAB工作液至每孔，室温孵育lOmin。(12)弃DAB，使用PBS冲洗2次，每孔加入lmlPBS。(13)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜IOX物镜下计算阳性细胞个数。(14)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度，公式如下
\*iral Titer ^ifivmL) = Cavgrage positive celis/fieid) χ (79 tiekb/wsli) s (cliliitioii factor)
(0.1 iiiL)
根据权利要求1所述的V型腺病毒滴度检测的试剂盒在测定V型腺病毒滴度中的应用。本发明设计对测定V型腺病毒滴度采用了酶联免疫法，并应用人胚胎肾细胞 HEK293为模型研究其对V型腺病毒滴度检测的精确性。为酶联免疫法在V型腺病毒滴度检测应用提供了一种新手段。
具体实施例方式
HEK293细胞的培养人胚胎肾细胞HEK293细胞系培养于37°C，5%C02恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混勻细胞；用移液器将其移入 15ml离心管中，1500rpm离心!Bmin ；去上清；用5ml无菌IXPBS将细胞悬起，并吹打混勻； 加约7ml细胞悬液于装有Iml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37°C，5%C02培养箱中培养， 约2天左右传代1次(主要查看细胞有无铺满培养瓶)。病毒的感染(1)选取状态良好的两组HEK293细胞TCID50病毒滴度，使用完全培养基重悬细胞，制备成2. 5X105个/ml的细胞悬液，M孔板每个孔中种入Iml细胞， 37°C、5%C02培养1小时。(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100 μ 1病毒样品。(3) 37°C、5%C02感染10天或2天。然后分别用TCID50和V型腺病毒滴度检测的试剂盒进行检测，如

图1，图2和表一所示。图1为TCID50法检测V型腺病毒滴度的结果。图2为和V型腺病毒滴度检测的试剂盒检测V型腺病毒滴度的结果。
表一 .V型腺病毒滴度检测的试剂盒和TCID50腺病毒滴度检测的差异
|TCID50法IV型腺病毒滴度检测的试剂盒
实验原理病毒感染细胞,在细胞内复制使细胞病变,观察病变细胞病毒感染细胞,抗体耦合病毒颗粒,
__染色计数_
实验操作将HEK293细胞接种于96孔板中，病毒原液做梯度稀释，加入96只需将HEK293细胞接种于树孔板
孔板中，共需要加80个孔,操作复杂中,4个孔即可,病毒稀释液也只需
__加8个孔,操作简单_
实验结果不容易观察，10天之后病变细胞于未病变细胞不容易区分阳性细胞被染成褐色,容易观察
重复性I实验结果基本不可重复I实验结果重复性高—
五、结果通过V型腺病毒滴度检测的试剂盒进行病毒滴度检测，比传统的TCID50法更精确，可重复性高，时程短，极大地促进了 V型腺病毒滴度检测的效率和数据可信度。
权利要求
1.一种用于V型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用，其特征在于该试剂盒测定V型腺病毒滴度采用了酶联免疫法。
2.一种制备根据权利要求1所述的用于测定V型腺病毒滴度的酶联免疫法，其特征在于该方法的具体步骤为(1)选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5 X IO5个/ ml的细胞悬液，M孔板每个孔中种入Iml细胞，37°C、5%C02培养1小时。(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100μ 1病毒样品。 (3) 37°C、5%C02 感染 2 天。(4)轻轻的去除培养液，沿着M孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml, -20°C孵育20mino(5)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。(6)使用1%BSA的PBS室温封闭1小时。(7)加入0.25ml的IXanti-Hexon抗体溶液至每个孔中，室温孵育1小时。(8)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。(9)加入0.25mlIX辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，室温孵育1小时。(10)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。(11)加入0.25ml新配置的IXDAB工作液至每孔，室温孵育lOmin。(12)弃DAB,使用PBS冲洗2次，每孔加入ImlPBS0(13)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜IOX物镜下计算阳性细胞个数。 (14)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度，公式如下Viral Titer lifu/uiL) = (average positive celb.;field) χ P9 fields/weil) χ (dilution factor)(0.1 niL)°
3.根据权利要求1所述的V型腺病毒滴度检测的试剂盒在测定V型腺病毒滴度中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用。本发明设计对Ⅴ型腺病毒滴度检测采用酶联免疫的方法，极大地提高了测定的精度，缩短了时程。为Ⅴ型腺病毒滴度检测应用提供了一种新方法。
文档编号G01N15/10GK102455359SQ20101051144
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者叶思灵, 夏清梅, 武佳, 潘讴东, 陈国泽, 黄红军 申请人:上海生博生物医药科技有限公司