专利名称：均相凝集免疫测定方法和用于这种方法的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于均相凝集测定的方法和用于这种方法的试剂盒。
背景技术：
均相凝集测定通常被用于，通过采用在用于分析物检测和定量的特异性免疫伴侣 (immunopartner)之间的结合反应，来确定样品中分析物的浓度。在这样的测定中，由于聚集体形成而产生的凝集程度被测量并且被用作分析物计算的基础。作为均相测定中的原则，将待分析的样品与结合性伴侣相混合，并且在任选的温育期后，直接测量在测定中的凝集情况，无需任何必需的分离步骤。通常，结合伴侣是对所关注的分析物具有特异性的抗体。合适的分析物必须暴露出两个以上用于结合伴侣的均相或多相表位。当然，如果抗体是所关注的分析物，也可以使用抗原作为结合伴侣。即使本发明不被具体限定，本发明也特别指向特定类型的凝集测定，该特定类型的凝集测定通常是指微粒增强的凝集测定。这些凝集测定法使用被用于所关注的分析物的结合伴侣所涂敷的微粒。通过例如形成抗体-抗原聚集体，所使用的结合伴侣能够特异性地与所关注的分析物进行反应。通过例如在给定时间期间内的比浊或者浊度测量法，能够监控在样品中这种聚集体的形成(凝集)。被测量的凝集程度是样品中分析物浓度的指示，并且可以通过使用适当的校准曲线而被确定。在一个典型的方法中，通过将用例如抗体涂覆的微粒加入至样品/缓冲混合物中，来启动该测定。如果所关注的分析物存在于样品中，则由于通过不同颗粒上的至少2个抗体与同一个分析物相结合而能够使两个以上颗粒被连接在一起，微粒的聚集将会发生。 通过使用某一波长的比浊或者浊度测量法，能够进行凝集的检测，使用的波长的选择取决于微粒的光散射特性。作为原则，波长大于微粒的平均直径。基于样品中检测的凝集性，利用校准曲线计算出分析物浓度。已知的微粒凝集测定法的一个主要缺陷是它们的被限制的动态范围。术语“动态范围”应该表示浓度范围，在该范围中测定产生精确的明确结果，尤其是在该范围内剂量反应曲线是线性的。已知的测定法的正常动态范围，S卩，在检测极限和测量上限之间的范围，是两个数量级。许多分析物，例如可提供仅两个实施例的C反应性蛋白0:rp)或者人绒毛膜促性腺激素(HCG)，能够具有几个数量级的样品浓度，这意味着在一些情况中，测定必须重复或者必须分别进行系列稀释。在样品含有高浓度分析物时，甚至能够观察到没有发生凝集或者仅发生低程度凝集。如果这些被样品充分稀释，则将发生对应于分析物浓度的凝集。在高分析物浓度下没有凝集或者低程度凝集的现象被称作前带效应或者“钩状效应”，并且与如下事实有关例如，样品中过量的抗原导致形成较小的抗体-抗原聚集体，其
4不会凝块而形成可见的凝集。一般来讲，可以说，与抗体相比，抗原的浓度越高，在样品中观察到的信号就越低，显示出前带效应。当提高抗原浓度超过抗体种群识别并结合的相对容量时，所造成的后果是，样品中的凝集程度不再代表分析物的浓度，导致信号降低。这种效应是动态的，并且代表着反应平衡从抗原-抗体聚集体形成到更高概率的非聚集性形成占优势的变化。已知的免疫测定方法提供了不同的方法来拓宽凝集测定的动态范围。美国专利6，248, 597公开了用于凝集测定的试剂，其包含两个不同的微粒种群。 一个微粒种群具有相比另一个微粒种群更强的光散射特性，并且被额外地涂敷有结合伴侶，该结合伴侣相比涂覆到另一个微粒种群上的结合伴侣具有更高的朝向分析物的反应性。根据US 6，M8，597，两个微粒种群的混合物可提供更宽的动态范围。该颗粒用较高亲合性的抗体涂敷，覆盖测量范围的敏感部分，而用较低亲合性的抗体涂敷的颗粒提供可检测的具有高分析物浓度的凝集。美国专利4，590，169描述了别的凝集测定。而且这种测定法用两个不同类型的抗体进行操作，这些抗体任选地被涂覆于不同类型的颗粒。这些抗体中的一种具有比另一种抗体低的对于分析物的亲合常数，并且被提供的量可避免在高抗原浓度下的假阴性效应。已知方法的缺陷是，它们需要在抗原上不同的表位，这些表位能够在空间上容易接近。这不适用于所有的临床分析物。另外，在已知的测定中对使用不同抗体的需求代表了一项缺点。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于均相凝集免疫测定的方法，其与已知方法相比具有提高的动态范围，允许分析物的所有临床相关浓度的测量，而没有假阴性结果的风险。本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，其能够被用于这种凝集测定。所述目的可通过权利要求1所述的方法和权利要求13所述的试剂盒得到理解。根据本发明的均相凝集免疫测定方法，要求将应该检查其内可能含有的分析物的浓度的样品与用于分析物的结合伴侣相混合，并且要么与至少一种离液剂相混合、要么与呈至少一种盐形式的单价离子相混合，或者与具有权利要求1所限定浓度的至少一种离液剂和单价离子的组合物相混合。除非另外说明，所有浓度值指的是在用于测量法的测定样 (测量用测定样)中各个组分的浓度。
具体实施例方式为了便于更好地理解，参见表1中的值，其指的是通常用于免疫测定的尿素和 NaCl及它们的组合物于37°C下在缓冲液(Tris缓冲液，pH 7.4)中的溶解度。在根据本发明的方法中，尿素是优选使用的离液剂，NaCl是优选使用的盐。表1显示了尿素的近似饱和浓度、NaCl的近似饱和浓度、以及尿素浓度与盐浓度的不同组合中的一些配对数值，该组合中发生了饱和。表 权利要求
1.一种均相凝集免疫测定方法，其中(a)将可能含有待测分析物的样品与下述物质相混合-用于分析物的结合伴侣，和-至少一种离液剂，其中调节离液剂的浓度以使得在用于步骤(b)中测量的测定样 (测量用测定样)中的离液剂终浓度超过其于测量温度下在测量用测定样中的饱和浓度的 40%，或者-呈至少一种盐形式的单价离子，其中调节盐的浓度以使得盐在测量用测定样中的终浓度超过其于测量温度下的饱和浓度的40%，或者-至少一种离液剂和呈至少一种盐形式的单价离子的组合物，其中调节离液剂和盐的浓度以使得组合物的终浓度超过于测量温度下的饱和浓度的70%，(b)在反应时间期间，测量至少一种与在测量用测定样中的结合伴侣和分析物间的相互作用相关的信号，以及(c)由在步骤(b)中测得的至少一种信号计算出样品中的分析物的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定是颗粒增强的测定，其中结合伴侣被固定在微颗粒上。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所选择的颗粒的直径优选是在50nm 500nm之间。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，使用至少2个不同直径的颗粒种群的混合物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种群之一所包括的颗粒的直径在 50nm IOOnm之间，而另一个种群所包含的颗粒的直径在IOOnm 500nm之间，所述至少2 个种群的混合比率在1 99 99 1之间、优选在20 80 80 20之间、并且最优选在40 60 60 40之间。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述离液剂是尿素。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在结合伴侣和分析物之间的相互作用通过比浊技术确定。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，用于比浊法的波长处于450nm-800nm之间、 优选在500nm-700nm之间。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣是抗体、优选多克隆抗体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗体对分析物具有高亲和性或亲和力。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述样品的混合包括下述步骤(al)提供第一试剂A，(a2)将样品加入试剂A，以及(a3)加入含有用所述结合伴侣涂敷的颗粒的第二试剂B，得到测量用测定样，其中或者试剂A、或者试剂B、或者两者都含有离液剂，并且或者试剂A、或者试剂B、或者两者都含有单价离子。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述离液剂和单价离子被包含在试剂A 中，而试剂B包含所述单价离子。
13.用于如权利要求11所述方法的试剂盒，其包括试剂A和试剂B。
全文摘要
一种均相凝集免疫测定方法，其中，将可能含有待测分析物的样品与用于分析物的结合伴侣和至少一种离液剂、呈至少一种盐形式的单价离子相混合，或者与至少一种离液剂和呈至少一种盐形式的单价离子的组合物相混合，在反应时间期间测量至少一种与结合伴侣和分析物的相互作用相关的信号，并且由测量的至少一种信号计算出样品中的分析物浓度。
文档编号G01N33/543GK102395885SQ201080016290
公开日2012年3月28日 申请日期2010年4月14日 优先权日2009年4月15日
发明者马丁·伯克哈特 申请人:贝克曼考尔特生物医学有限公司