专利名称：：双靶生物传感器细胞试验的制作方法双靶生物传感器细胞试验胃鮮射是棚_封_青_&本申请要求2008年3月5日提交的美国临时申请序列号61/068，266的权益。该文件的内容和本文述及的出版物、专利及专利文件的全部内容通过引用纳入本文。背景本发明涉及，例如用于化合物筛选和化合物模式分析的细胞试验所用的生物传感器，例如共振波导光栅(RWG)生物传感器和电阻抗生物传感器。概述本发明提供用于化合物筛选和化合物模式分析，例如针对一种细胞类型中的两种不同细胞靶标，或针对不同细胞类型的两种不同细胞靶标的细胞试验所用的方法和装置。附图简述图1A-1B显示在本发明的各实施方式中，分别采用RWG生物传感器和电子生物传感器进行双重或双靶标特异性筛选的生物传感器细胞试验各方面的内容。图2A-2D显示在本发明的各实施方式中，针对两类G蛋白偶联受体(GPCR)的示范性RWG生物传感器细胞试验。图3A-3C显示在本发明的各实施方式中，针对两类G蛋白偶联受体的另一示范性RWG生物传感器细胞试验。图4显示在本发明的各实施方式中，采用RWG生物传感器的示范性双重和靶标特异性筛选。图5A-5C显示在本发明的各实施方式中，检测A431细胞中的两种内源性受体-β2-肾上腺素能受体和组胺Hl受体的示范性光学生物反应器细胞试验。图6A-6D显示在本发明的各实施方式中，采用RWG生物传感器的示范性双重和靶标特异性筛选。图7A-7F显示在本发明的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物文库中的激动剂结果。图8显示在本发明的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物文库中的激动剂结果。图9显示在本发明的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物文库中的拮抗剂结果。详述参考附图(如果有的话)详述本发明的各种实施方式。参考各种实施方式不是限制本发明的范围，该范围只由随附的权利要求书限制。此外，本说明书中的实施例不是限制性的，仅是列出本发明许多可能的各实施方式中的一些。“试验”、“测定”等术语指分析以测定，例如用外源性刺激，例如用候选配体化合物刺激后，细胞是否存在光学或生物阻抗反应、其量度、程度、动力学(kinetics)、或动态学(dynamics)类型。“结合”、“连接”、“粘附”、“附着”、“粘附的”、“固定的，，等术语通常指通过，例如物理吸附、化学键合等过程或它们的组合，而将(例如)本发明的表面修饰物质、增容剂、细胞、候选配体化合物等实体固定于表面。“细胞连接”、“细胞粘附”等术语，具体指通过(例如培养)使细胞与表面相互作用或结合，或使细胞与表面，例如生物传感器表面相互作用。这种生物传感器表面可以是未经修饰或经过修饰的，例如具有表面涂层、锚定材料、增容剂(例如，纤连蛋白、胶原、核纤层蛋白、明胶、聚赖氨酸等)等修饰，以促进细胞粘附和细胞生长。对于悬浮细胞，可以(例如)通过培育期间细胞的物理沉降或通过表面与细胞的相互作用，使细胞与生物传感器检测区接触。可通过以下几种方式实现这种表面-细胞相互作用，例如共价偶联反应活性表面与基底细胞膜蛋白或分子、电荷为基础的电子相互作用、传感器表面-呈递分子(例如，抗体、配体)与基底细胞表面分子结合等方法。“粘附细胞”指维持与基材外表面结合、固定于其上或相接触的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。此类细胞在培育后能经受洗涤和培养液更换过程而存活，而这些过程是许多细胞试验的先决条件。“弱粘附细胞”指在细胞培养期间与基材表面相互作用或结合或接触弱的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。然而，物理干扰方法，例如洗涤或培养液更换易使这些类型的细胞，例如人胚胎肾(HEK)细胞从基材表面脱离下来。“悬浮细胞”指优选在培养液中培养时不附着或粘附于基材表面的细胞或细胞系。“细胞培养”指原核或真核细胞在受控制条件下的生长过程。“细胞培养”不仅指培养多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞，而且指培养复杂的组织、器官等系统。“细胞”等术语指通过半透膜与外部分界的小(通常微观)原生质团，任选包含能单独执行或与其它类似物质相互作用而执行生命功能的一个或多个核和各种其它细胞器，形成能独立执行功能的活物质的最小结构单元，包括合成的细胞构造、细胞模型系统和类似的人造细胞系统。“细胞系统”等术语指细胞的集合，可包括一种以上类型的细胞(或一类细胞的分化形式)，它们通过彼此相互作用执行生物学或生理学或病理生理学功能。此类细胞系统可包括，例如器官、组织、干细胞、分化的干细胞和类似的细胞系统。“靶标”等术语指细胞蛋白质或生物分子，其活化可介导细胞信号转导或调节细胞功能。靶标可以是，例如受体、磷酸酶、激酶、酶、DNA、RNA和类似实体。受体可以是，例如G蛋白-偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、转运蛋白、离子通道、整联蛋白受体、钠/质子交换剂和类似实体。激酶可以是，例如蛋白激酶A、蛋白激酶C、有丝分裂原激活的蛋白(MAP)激酶、胞外信号-调节的激酶、SrC、Ih0激酶、灶性黏着激酶和类似实体。酶可以是，例如膜-结合的腺苷酸环化酶、可溶性腺苷酸环化酶、蛋白酶和类似实体。“双_”、“双重”、“双重的_”等术语指检测由两种不同的靶标，例如Gtl-偶联受体和Gs-偶联受体，两种不同的Gtl-偶联受体，GPCR和受体酪氨酸激酶，GPCR和酶，GPCR和激酶及类似组合介导的细胞反应或活性的试验。“多重”、“多重的”等术语指检测由两种以上各个靶标介导的细胞反应或活性的试验。所述靶标可属于(例如)同一类别的靶标，如GPCR，或不同类别的靶标，如两种GPCR和一种受体酪氨酸激酶。“筛选”等术语指，对(例如)一种或多种化合物或候选药物或生物物质(例如，RNAi、抗体)的系统性研究，检测它们作用于特定靶标、细胞类型或细胞系统的药理学活性。药理学或生物学活性表现为药物对生命物质的有益或有害作用。“模式”、“模式分析”等术语指外推的信息，是关于候选药物、化合物通过一种或多种细胞靶标，通过特定靶标介导的已知的或预定的信号输出，例如细胞的光学或生物阻抗反应的幅度，对活细胞或细胞系统的生物学作用的信息。“标记”等术语指，例如能调节至少一种细胞靶标(例如，Gtl-偶联受体、Gs-偶联受体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、离子通道、受体酪氨酸激酶、转运蛋白、钠-质子交换蛋白、核受体、细胞激酶、细胞蛋白等)的活性，产生可用生物传感器检测的可靠的可检测生物传感输出信号的分子、生物分子或生物物质。根据所需细胞靶标的类别及其随后的细胞反应，所述标记可以是活化剂，例如激动剂、部分激动剂、反激动剂，例如GPCR或受体酪氨酸激酶或离子通道或核受体或细胞腺苷酸环化酶。所述标记也可以是某些类别细胞靶标的抑制剂，例如肌动蛋白丝或微管的抑制剂；或是激酶，例如Mio激酶的抑制剂，或是细胞表面分子的抗体，或类似实体，例如抗-表皮生长因子受体抗体。“检测”等术语指本发明装置和方法能同时发现或感知至少两种配体诱导的细胞反应并区分缺乏配体化合物时的感知反应。“鉴定”等术语指本发明装置和方法不仅能识别配体化合物对至少两种靶标的影响，而且能辨别配体化合物特性对至少两种靶标的影响或相互作用的类型。“刺激物”、“治疗性候选化合物”、“治疗性候选药物”、“预防性候选药物”、“预防剂”、“候选配体”等术语指，能与固定或连接于生物传感器的细胞靶标相互作用的感兴趣的天然或合成的分子或材料。治疗性或预防性候选药物可包括，例如能特异性结合两种或多种靶标，例如蛋白质、DNA、RNA、离子、脂质等活细胞结构或组分的至少一种，或与之相互作用的化学化合物、生物学分子、肽、蛋白质或生物学样品、候选小分子药物、候选药物生物学分子、候选小分子药物-生物学物质偶联物和类似的材料或分子实体，或它们的组合。“生物传感器”等术语指与合适设备联用可检测所需分析物的制品。生物传感器可联合生物学组件与理化检测器组件。生物传感器通常由三部分构成生物学组件或元件(例如，组织、微生物、病原体、细胞、细胞组分或它们的组合)、检测器元件(以理化方式，例如光学、压电、电化学、热量、磁力等方式工作)和与这两种组件结合的转换器。在各实施方式中，光学生物传感器可将活细胞中的分子识别或分子刺激反应转换成可定量信号。可采用本领域普通技术人员熟知的缩写，例如〃h〃或“hr”为小时，‘‘g〃或〃gm〃为克，“mL“为毫升，“Tt"为室温，“nm”为纳米和类似的缩写。“包括”等术语表示包括但不限于。修饰用于描述本发明各实施方式中的，例如组合物中成分的含量、浓度、体积、加工温度、加工时间、产率、流速、压力等类似数值，以及它们范围的“大约”指，例如对制备化合物、组合物、浓缩物或所用制剂的常规检测和处理过程可允许的数值差异；这些工艺中偶发的误差；制备过程的差异；实施所述方法的起始材料或成分的来源或纯度的差异；和类似考虑。术语“大约”还包括，例如由于含有特定起始浓度或配料的组合物、制剂或细胞培养的老化导致的而含量差异，和因含有特定起始浓度或配料的组合物或制剂的混合或加工导致的含量差异。无论有无术语“大约”的修饰，随附的权利要求包括这些数量的等价含量。在各实施方式中，“基本上由...构成”指，例如本发明的组合物、在生物传感器表面制备或利用组合物、制剂的方法，和制品、装置、或设备，可包括权利要求所列的组分或步骤，加上不会实质性影响本发明组合物、制品、设备和制备使用方法的基本特性和新颖特性的其它组分或步骤，例如选择的具体反应物、具体添加剂或成分、具体试剂、具体细胞或细胞系、具体表面修饰剂或条件、具体候选配体，或类似的结构、材料或所选的不同方法。可实质性影响本发明组分或步骤基本特征或可能对本发明特征造成不良影响的项目包括，例如细胞对生物传感器表面的亲和力降低、候选配体对细胞的亲和力降低、病原体对细胞的亲和力降低、对候选配体或类似刺激反应的异常或相反细胞活性，和类似特征。在一些例子中，上面举例的不良特征在本发明的筛选或模式分析应用中，例如发现能降低候选配体对细胞的亲和力，或降低病原体对细胞的亲和力的条件或配体，可能是极其需要而有益的。除非另有说明，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该”表示至少一个或一个或多个。组分、成分、添加剂、细胞类型、病原体和类似方面及其范围所公开的具体值和优选值，只是说明；它们不排除所限定范围内的其它限定值或其它值。本发明的组合物、装置和方法包括具有本文所述任何值或所述值的任何组合、比值、更多比值和优选值。本发明提供的方法和装置可用于化合物筛选和化合物模式分析试验，例如分析一种细胞类型的两种不同细胞靶标的试验。在各实施方式中，本发明提供采用不用标记的生物传感器的多重靶标特异性筛选方法，分析化合物的模式、进行筛选或二者。在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如提供生物传感器；将表达至少两种不同靶标(例如，第一靶标和第二靶标)的细胞系样品固定在生物传感器表面上；使接触生物传感器的细胞系样品与候选配体接触，例如温育一段时间；使经过候选配体处理的细胞系与包含至少两种标记的混合物接触，例如温育，各标记能选择性调节所述不同靶标中至少一种活性；监测温育期间生物传感器的输出；和测定候选配体对所述混合物诱导生物传感器输出的作用。在各实施方式中，所述靶标可以是，例如受体、细胞蛋白的至少一种，或它们的组合。所述细胞蛋白可以是，例如细胞酶、细胞激酶、细胞结构蛋白质的至少一种或它们的组合。所述受体可以是，例如Gtl-偶联受体、Gs-偶联受体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠-质子交换蛋白、整联蛋白受体和转运蛋白的至少一种或它们的组合。在各实施方式中，所述标记可以是，例如激动剂、部分激动剂或反激动剂的至少一种。在各实施方式中，所述激动剂可以，例如能活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。在各实施方式中，所述标记可以是抑制剂或抗体的至少一种，所述标记可活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。在各实施方式中，所述标记各自可特异性调节不同靶标的活性。在各实施方式中，所述靶标可以是，例如以下至少一种一对Gtl-偶联受体、一对Gtl-偶联受体和Gs-偶联受体、一对Gi-偶联受体和Gs-偶联受体、一对G蛋白-偶联受体和受体-酪氨酸激酶，或一对受体和细胞蛋白。在各实施方式中，候选配体对生物传感器输出的影响可以是，例如调节所述标记诱导的信号反应。在各实施方式中，所述调节可以是，例如信号幅度、动力学变化或它们的组合。在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如提供生物传感器；将表达至少两种不同靶标(例如，第一靶标和第二靶标)的细胞系样品固定在生物传感器表面上；将细胞系样品与含有至少一种阻断剂的混合液一起温育，所述阻断剂抑制细胞蛋白的活性，而所述细胞蛋白并非靶标但能干扰靶标的活性；将接触生物传感器的细胞系样品与候选配体一起温育合适的时间；将经候选配体处理的细胞系与包含至少两种活化剂的混合物一起温育，各活化剂能选择性活化所述不同靶标中的一种；监测温育期间生物传感器的输出；和测定候选配体对所述混合物诱导的生物传感器输出的作用。在各实施方式中，可分别或一起加入所述阻断剂和候选配体。如果分别加入，优选先加入阻断剂再加入候选配体。所述阻断剂可以是，例如细胞蛋白的拮抗剂、细胞蛋白的抑制剂、细胞蛋白的干扰性RNA(RNAi)、细胞蛋白的反义核酸或类似实体。在各实施方式中，所述阻断剂，例如溶液可以在候选配体之前加入。在各实施方式中，所述阻断剂，例如溶液可以与候选配体一起加入。在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如提供生物传感器；将含有表达第一靶标的第一细胞系和表达第二靶标的第二细胞系的混合细胞群固定在生物传感器表面上；使生物传感器上固定的混合细胞群与候选配体接触合适或足够时间；将经候选配体处理的细胞系与包含两种活化剂的混合物一起温育，一种活化剂选择性活化所述第一靶标而另一种活化所述第二靶标；监测温育期间生物传感器的输出；和测定候选配体对所述混合物诱导的生物传感器输出的作用。在各实施方式中，所述两种细胞系彼此相关，例如亲代细胞系和用该亲代细胞系工程改造的细胞系。或者，两种细胞的来源可以不同。在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如提供生物传感器；将含有表达靶标的第一细胞系和不表达靶标的第二细胞系的混合细胞群固定在生物传感器表面上；将接触生物传感器的细胞系与候选配体温育合适或足够时间；将经候选配体处理的细胞系与，例如包含能选择性活化所述靶标的活化剂溶液一起温育；监测温育期间生物传感器的输出；和测定候选配体对所述活化剂诱导的生物传感器输出的作用。在各实施方式中，所述两种细胞系优选彼此相关，例如表达GPCR的工程改造细胞和不表达GPCR的亲代细胞。可预定两种细胞系的接种数量从而在培养后，这两类细胞之间的理想比例可以是，例如约11。当采用靶标活化剂刺激得到的混合细胞群时，获得的平均反应将是与只采用表达该靶标的细胞的大约50%。当候选配体也是靶标的特异性活化剂时，可提供与活化剂相当的反应。当候选配体是靶标的非特异性活化剂时，可提供不同的反应。在各实施方式中，所述筛选方法可包括，例如提供生物传感器；将含有表达第一靶标的第一细胞系和表达第二靶标的第二细胞系样品的混合细胞群固定在生物传感器表面上；将细胞系样品与含有至少一种阻断剂的混合溶液一起温育，所述阻断剂能抑制细胞蛋白的活性，而所述细胞蛋白并非靶标但能干扰至少一种靶标的活性；将接触生物传感器的细胞系样品与候选配体一起温育合适或足够时间，例如以检测或测量任何配体与细胞，或更具体地说，与细胞靶标或受体的相互作用；将经候选配体处理的细胞系与包含至少两种活化剂的混合物一起温育，各活化剂能选择性活化不同靶标之一种；监测培育期间生物传感器的输出；和测定候选配体对所述混合物诱导的生物传感器输出的作用。在各实施方式中，所述生物传感器可以是，例如光学生物传感器，特别是共振波导光栅生物传感器，或者是例如电阻抗生物传感器，特别是生物阻抗生物传感器。所述细胞可以是表达两种不同受体，例如受体A和受体B(图1，165、170)的一种细胞类型。或者，所述细胞可以是各自表达一种受体的两种不同类型细胞，其中可先将两类细胞混合在一起再置于传感器表面上。两种受体可属于同一类受体(例如，Gtl-偶联受体)、不同类型的受体，例如一对Gtl和Gs-偶联受体、一对GPCR和受体酪氨酸激酶，或类似的受体组合。当两种受体导致相似的信号传导途径时，它们相应活化剂的浓度优选约为它们的EC5tl值(S卩，活化剂结合而活化受体，产生50%最大反应的浓度)。当两种受体导致不同的信号传导途径时，它们相应活化剂的浓度范围可以较宽，例如约ECltl至约IOxECicici,或更高。在各实施方式中，本发明提供利用各自可激活不同靶标的两种不同激动剂或活化剂的组合进行化合物筛选和模式分析的方法。该方法可用于靶特异性筛选和模式分析，特别适合于双重或多重受体或靶标筛选。在各实施方式中，本发明提供利用不用标记的生物传感器，例如RWG生物传感器或电阻抗生物传感器，在活细胞环境中进行多重靶特异性化合物筛选和模式分析。本发明无需工程改造细胞等操作，对于相同类别的靶标，例如Ca2+动员，它们的细胞信号传导途径不需要相似或相同。然而，可工程改造细胞或对细胞进行操作。在各实施方式中，所述靶标可属于同一家族(例如，Gtl-偶联受体)或不同家族(例如，一个是Gtl-偶联受体，另一个是Gs-偶联受体；或者一个是Gs-偶联受体，另一个是Gi-偶联受体；一对G蛋白-偶联受体和受体酪氨酸激酶；一对受体和胞内激酶(例如蛋白激酶C)；或一对胞内激酶和酶，例如一对蛋白激酶C和腺苷酸环化酶)。在各实施方式中，所述活化剂或标记可以是受体的激动剂，或激酶或酶的活化剂。对于给定的细胞或细胞系统，可预定并选择各自能导致可靠和可检测的生物传感器信号的一组活化剂。例如，当在人表皮样癌A431细胞中利用光学生物传感器，例如RWG生物传感器时，可选择以下活化剂内源性GPCR的激动剂或部分激动剂，例如缓激肽B2受体的缓激肽、β2肾上腺素能受体的肾上腺素、腺苷Α2Β受体的腺苷、蛋白酶活化受体亚型1的凝血酶或SFLLR-酰胺、蛋白酶活化受体亚型2的胰蛋白酶或SLIGKV-酰胺、组胺Hl受体的组胺、Ρ2Υ受体的三磷酸腺苷(ATP)、LPA受体的溶血磷脂酸(LPA)，参见，例如Fang，Y.等.，J.Pharmacol.Tox.Methods,2007，55，314-322。内源性受体酪氨酸激酶的激动剂可以是，例如EGFR的表皮生长因子(EGF)，参见，例如Fang，Y等·，Anal.Chem.，2005，77，5720-5725。内源性离子通道的离子通道打开剂(ionchannelopener)可以是，例如ATP-敏感性钾离子通道的吡那地尔(pinacidil)。细胞酶的活化剂可以是，例如腺苷酸环化酶的福斯高林(forskolin)。细胞激酶的活化剂可以是，例如蛋白激酶C的12-脱氧佛波醇13-乙酸酯和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；或蛋白激酶A的8-溴-cAMP和Sp-cAMPS及二丁基-cAMP。破坏剂可以是，例如肌动蛋白丝的细胞松弛素D或微管的噻氨酯哒唑(nocodozale)0整联蛋白受体的活化剂可以是，例如可溶性纤连蛋白或其片段。细胞膜破坏剂可以是，例如导致细胞膜渗漏的皂苷，参见，例如Fang，Y等.，FEBSLett.，2005，579，4175-4180。凋亡诱导剂可以是，例如，可触发Ca2+依赖性细胞凋亡的Ca2+离子载体A23187。激酶抑制剂可以是，例如Iiho激酶的Y-27632。由于用各标记刺激所检测的细胞可导致特定细胞反应、信号传导途径或信号传导网络相互作用，并且各信号传导途径可能涉及不同组别细胞靶标，选择的一组标记应覆盖给定细胞系统中的许多(如果不是全部的话)细胞信号传导途径。在各实施方式中，本发明提供采用生物传感器对化合物进行靶特异性多重筛选和模式分析的方法。所述方法的明显属性包括，例如应用于光学生物传感器或电阻抗生物传感器的细胞试验；提高该试验的通量至少二倍；可在一次试验中同时测定不同类别的靶标因而具有广泛适用性；和该方法适合于检测受体-受体相互作用。可发生不同水平的受体-受体相互作用，例如两种受体二聚化，受体的寡聚化，通过受体下游信号传导级联反应的串话(cross-talk)或类似相互作用，和它们的组合。常规细胞试验依赖于通过靶受体，例如G蛋白-偶联受体检测特定细胞反应。由于这种维度以及知道给定细胞类型中不同类别的靶受体可导致不同的细胞信号传导，因此对多种靶受体的筛选有很大困难。虽然采用标准筛选方法(通常包括一次测定一个靶标)已成功鉴定了强效候选药物，但关于化合物选择性的信息非常少。目前进行选择性的研究集中于药物开发过程的下游。然而，这种后期研究需要弃去有害结合的化合物因而使得药物发现过程更昂贵费时。能同时检测化合物对多种靶标的活性的多靶筛选方法，极其有利于在药物发现过程的早期有效寻找化合物的选择性。常规多重筛选方法通常依据于微阵列技术，该技术已成为在一次实验中同时分析许多基因和蛋白质的通用方法。蛋白质微阵列的应用已从蛋白质丰度模式分析扩展到测定，例如蛋白质的位置、蛋白质的修饰以及蛋白质与其它化学和生物学分子的相互作用。这些进步对药物发现和开发工艺提供了新的范例。用于化合物模式分析和筛选的微阵列的例子包括，例如空气稳定的GPCR微阵列，参见，例如Fang，Y等.，“Membraneproteinmicroarrays(月莫蛋白■阵歹Ij)，，，JournaloftheAmericanChemicalSociety,2002,124,2394-2395;Fang,Yφ.,"Air-stableGprotein-coupledreceptormicroarraysandligandbindingcharacteristics(WG^[=|-{^Wi^W^X阵列和配体结合特征)”，AnalyticalChemistry,2006,78,149-155，采用条码CellCard载体(bar-codedCelICardcarrier)培养的细胞的细胞阵列，参见，例如Beske，0等.，"Anovelencodedparticletechnologythatenablessimultaneousinterrogationofmultiplecelltypes(能同时查询多种细胞类型的新型编码的颗粒技术)”，JournalofBiomolecularScreening,2004，9，173-185，或采用固态转染的转染细胞集群阵列，参见，例如Mishina,Y.M等.,"MultiplexGPCRassayinreversetransfectioncellmicroarrays(反转染细胞微阵列的多重GPCR试验)”，JournalofBiomolecularScreening,2004，9，196-207。这些技术通常要求工程改造或操作细胞，例如用于GPCR微阵列的含过表达靶受体的裂解细胞的纯化细胞膜片段，或用于转染细胞集群阵列的，或用于CellCard技术的不同类型细胞或一种类型细胞的工程改造变体。也开发了依据Ca2+流量进行检测的双功能试验，例如通过混合合适比例的两种稳定转染的细胞群，其中各群细胞表达一种靶标。如果存在能活化一种受体的“选中物”，可用，例如FLIPR(荧光计成像平板读数计)系统检测其导致的50%荧光信号。此外，如果另一选中物具有交叉活性而能活化两种受体，则此“选中物”能导致100%的信号。此类筛选采用单靶标筛选可使产生的潜在选中物翻倍。然而，需要采用单靶标筛选进行额外筛选而去卷积选中物。此类双重试验仅限于两种Gtl-偶联受体，二者均通过和随后的Ca2+动员介导信号传导。在各实施方式中，本发明提供不用标记的筛选方法，包括提供具有混合细胞群的生物传感器，所述细胞群含有共同固定在生物传感器表面上的两类细胞；使固定的细胞与候选配体接触；和测定候选配体诱导的生物传感器输出。这两类细胞可以是，例如亲代细胞和其表达一种靶标的工程改造细胞；各自表达一种靶标的两种工程改造细胞；或两种天然细胞。在各实施方式中，本发明提供不用标记的筛选方法，包括提供具有混合细胞群的生物传感器，所述细胞群含有表达第一靶标的第一类细胞和表达第二靶标的第二类细胞，这两种细胞类型共同固定在生物传感器的表面上；使固定的细胞与候选配体接触；使经候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触，每种标记能特异性调节一种靶标的活性；和测定所述候选配体对标记混合物-诱导的生物传感器输出的作用。1.不用标记的生物传感器细胞试验不用标记的细胞试验通常采用生物传感器来监测活细胞中配体诱导的反应。生物传感器通常利用转换器，例如光学、电子、量热、声学、磁力等转换器将与生物传感器接触的细胞中分子识别或配体诱导的变化转换成可定量的信号。这些不用标记的生物传感器可用于分子相互作用的分析，包括表征分子复合物如何随时间形成和解离，或分析细胞反应，包括表征分子如何对刺激起反应。图1突出显示了目前用作不用标记的细胞试验基础的两类生物传感器共振波导光栅(RWG)生物传感器和电子生物传感器，以及如何利用依据生物传感器的细胞试验进行化合物的双靶标筛选和模式分析。RffG生物传感器和系统-RWG生物传感器可包含，例如基板(如，玻璃)、具有嵌入光栅结构和细胞层的波导薄膜(图la)。RWG生物传感器采用借助衍射光栅将光共振耦合入波导管，导致溶液-表面界面完全的内部反射(totalinternalreflection)，进而在该界面产生电磁场。该电磁场的性质为逐渐消散接近于零，意味其从传感器表面开始呈指数衰减；将其衰减到初始值的Ι/e处的距离称为穿透深度，此深度与特定RWG生物传感器的设计呈函数关系，但数量级通常约为200nm。此类生物传感器利用此类消散波可特征分析配体诱导的传感器表面或附近细胞层的变化。可依据角度漂移(angle-shift)或波长漂移(wavelength-shift)的测量，将RWG仪器再分成多个系统。在波长漂移检测中，利用角度恒定覆盖入射波长范围的偏振光照亮波导管；特定波长的光耦合入波导管并沿波导管传播。或者，在角度-漂移仪器中，用单色光照亮传感器并检测光的共振耦合角度。与生物传感器表面直接接触的细胞层(例如，汇合和粘附状态细胞)能影响共振状态。当配体或分析物与活细胞中的细胞靶标(例如，GPCR、激酶)相互作用时，可检测细胞层内局部折射率的任何变化表示为共振角度(或波长)的变化。Corning:Epic系统采用RWG生物传感器进行不用标记的生物化学或细胞试验(纽约州康宁市康宁公司(CorningInc.，Corning，NY))。Epic系统由RWG平板读数计和SBS(生物化学筛选协会(SocietyforBiomolecularScreening))标准微量滴定板构成。平板读数计中的检测器系统利用集成光纤可检测细胞中配体诱导变化所致的入射光波长漂移。以线性方式安排一系列照明检测头，从而能同时收集384-孔微量板中一列孔内各孔的反射光谱。扫描整块板，多次寻址各传感器并顺序寻址各列孔。收集入射光的波长用于分析。该仪器中可包括温度控制单元，以最大程度减小温度波动导致的入射波长伪漂移。电子生物传感器和系统-电子生物传感器由基板(例如，塑料)、电极和细胞层构成(图lb)。在该电子检测方法中，将细胞培养在基板上排列的小金电极上，监测该系统随时间而变的电阻抗。阻抗是对细胞层电导率变化的衡量。通常将频率固定的或变化的小恒定电压施加于电极或电极阵列，随时间监测通过回路的电流。配体诱导的电流变化是对细胞反应的衡量。1984年首次实现了全细胞传感(wholecellsensing)的阻抗测量。自此后，阻抗检测已应用于研究各种细胞反应，包括细胞粘附和传播、细胞微动(cellmicromotion)、细胞形态的变化和细胞死亡。阻抗系统的典型问题是由于采用小检测电极和大参比电极导致试验的差异高。为克服这种差异，最新一代的系统，例如加利福尼亚州南旧金山MDSS公司的细胞匙系统(CellKeysystem，MDSSciex,SouthSanFrancisco,CA)和加利福尼亚州圣迭戈ACEA生物科学公司(ACEABiosciencesInc.,SanDiego,CA)的RT-CES采用了含微电极阵列的集成电路。该细胞匙系统由环境控制的阻抗检测系统、96-孔电极-嵌入微量滴定板、负载96-孔板射流器(onboard96-wellfiuidics)及客户获取和分析软件构成。将细胞接种在培养孔中；各孔含有集成的电极阵列。该系统利用M种频率(ΙΚΗζ-ΙΟΜΗζ)的小幅交流电压进行操作。以2秒的适时修正率(updaterate)检测所产生的电流。量热调节该系统后，可在例如沘1-371进行实验。用96-孔头液体递送装置(96iellheadfluiddeliverydevice)处理液体的加入并交换(板孔)负载。RT-CES系统可包括四种获取数据和展示的主要组件电子微量滴定板(E-PlateTM)、E-平板站、电子分析仪和监测系统。电子分析仪发送和接收电子信号。E-平板站置于组织培养孵育箱内。E-平板站以三种通量方式工作一次运行6块16-孔E-平板的16x站、一个96-孔E-平板站和一次可容纳最多6块96-孔E-平板的多重-E-平板站。可将细胞接种入与微电子传感器集成阵列的E-平板中。该系统以多种频率的低电压(低于20mV)AC信号操作。GPCR活化的光学信号与RWG生物传感器细胞是具有较大尺寸，例如数十微米的动态研究对象。RWG生物传感器通过检测消散波的穿透深度而能测定细胞底部配体诱导的变化。此外，通过入射光源的斑点大小(约100微米)测定光学生物传感器的空间分辨率。因此，通常采用高度汇合的细胞层以获得最佳试验结果；可将该传感器构造视作三层波导复合构造，包括，例如基板、波导薄膜和细胞层。按照3-层波导生物传感器理论和细胞生物物理学，我们发现对于全细胞传感，配体-诱导的有效折射率变化(检测到的信号ΔΝ)受以下方程⑴的控制权利要求1.一种不用标记的的筛选方法，包括提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种不同靶标；使固定的细胞与候选配体接触；使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触；和测定候选配体对标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两种不同靶标包括用生物传感器彼此区分的第一靶标和第二靶标。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各标记可选择性调节不同靶标之一的活性。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选配体包括化学化合物、生物学分子、肽、蛋白质、生物学样品、候选小分子药物、候选生物学分子药物或候选小分子药物-生物学偶联物中的至少一种。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标包括受体或细胞蛋白质中的至少一种。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述受体包括Gtl-偶联受体、Gs-偶联受体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠-质子交换蛋白、整联蛋白受体、转运蛋白中的至少一种。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞蛋白质包括细胞酶、细胞激酶或细胞结构蛋白中的至少一种。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括激动剂、部分激动剂或反激动剂中的至少一种，所述激动剂活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括抑制剂或抗体中的至少一种，所述标记活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各标记特异性调节不同靶标的活性。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述靶标包括以下至少一种一对Gtl-偶联受体、一对Gtl-偶联受体和Gs-偶联受体、一对Gi-偶联受体和Gs-偶联受体、一对G蛋白-偶联受体和受体-酪氨酸激酶，或一对受体和细胞蛋白质。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选配体对生物传感器输出的作用包括调节所述标记诱导的信号反应。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述调节包括改变信号幅度、动力学、动态学或它们的组合。14.一种不用标记的筛选方法，包括提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种不同靶标；使固定的细胞与两种标记的混合物接触；使经过标记混合物处理的固定的细胞与候选配体接触一段时间；和测定所述标记对候选配体诱导的生物传感器输出的作用。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述至少两种不同靶标包括用生物传感器彼此区分的第一靶标和第二靶标。16.一种不用标记的筛选方法，包括提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种不同靶标；使固定的细胞与含至少一种阻断剂的溶液接触；使固定的细胞与候选配体接触；使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触；和测定候选配体对所述标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述阻断剂包括细胞蛋白质的拮抗剂、抑制剂、干扰性RNA、反义核酸或抑制性抗体中的至少一种，所述细胞蛋白质不是所述标记的靶标，但其活化干扰生物传感器对靶标的反应。18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，加入所述阻断剂后再加入候选配体。19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述阻断剂与候选配体一起加入。20.一种不用标记的筛选方法，包括提供生物传感器，在该生物传感器的表面上共同固定含有两类细胞的混合细胞群；使固定的细胞与候选配体接触；和测定该选配体诱导的生物传感器输出。21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述两类细胞包括亲代细胞系和其表达靶标的工程改造细胞；各自表达靶标的两种工程改造细胞；或两种天然细胞。22.—种不用标记的筛选方法，包括提供含有表达第一靶标的第一类细胞和表达第二靶标的第二类细胞的混合细胞群的生物传感器，两类细胞共同固定在该生物传感器的表面上；使固定的细胞与候选配体接触；使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触，各标记特异性调节靶标的活性；和测定候选配体对标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。全文摘要本发明公开了一种不用标记的多重筛选方法，涉及含有表面固定了活细胞的生物传感器，所述活细胞至少有两种靶标，或涉及表面共同固定了含两种类型细胞的混合细胞群的生物传感器，或涉及表面共同固定了混合细胞群的生物传感器，所述混合细胞群包含表达第一种靶标的第一类细胞和表达第二种靶标的第二类细胞，这两类细胞共同固定在所述生物传感器的表面上。所述靶标可以是Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠-质子交换蛋白、整联蛋白受体或转运蛋白。不同类别的GPCR大多能独立地介导信号转导，强烈提示信号转导级联反应的空间时间腔室化是GPCR信号转导的关键。受体信号转导下游发生的大多数细胞反应是“开通”或“传送”。文档编号G01N33/566GK102037357SQ200980115574公开日2011年4月27日申请日期2009年3月4日优先权日2008年3月5日发明者E·特兰,T·A·邦奇,方晔申请人:康宁股份有限公司