专利名称：人脑胶质瘤标志物gfap自身抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术和医学领域。涉及人脑胶质瘤标志物，具体涉及一种能区分人脑胶质瘤的蛋白标志物GFAP(glial fibrillary acidic protein, GFAP)自身抗体及其检测方法和用途。
背景技术：
脑胶质瘤是一种起源于神经胶质细胞的肿瘤，它在脑部肿瘤中最为常见。现有的影像诊断技术因其高昂费用而无法得到广泛应用，因而发展基于临床血液样本且价格相对低廉的脑胶质瘤早期检测手段成为本领域技术人员的关注热点。自身抗体是一类免疫系统产生的针对集体自身蛋白、细胞、组织或是器官的抗体，其与自身免疫疾病密切相关。与此同时，有关研究在许多不同类型癌症病人中也鉴定到了肿瘤相关自身抗原导致的抗体产生。据推测，肿瘤自身抗体由肿瘤细胞自身抗原的非正常表达引发，它可能直接影响肿瘤生长，也可能通过激活免疫活性细胞诱导可溶性介导因子释放来促进炎症反应。研究人员认为，肿瘤可能在可检出之前就已诱发自身抗体反应，自身抗体被认为可作为肿瘤检测的早期标志物。研究显示，多种肿瘤自身抗原相关的自身抗体已被发现，其中包括在多种肿瘤中广泛存在的 cAMP-d印endent protein kinase A禾口 p53 ；乳腺癌中的 Annexin XI_A，ASB_9， SERAC 1 和 RELT ；前列腺癌中的 HIP-1 ；肺癌中的 Annexin T, 14_3_3theta，Tim, MnSOD, LAMRl，CAGE 和 GBU4-5 以及结肠癌中的 LGR6，hCG1989951，C6orf 192，PDE4A 和 AGBL5。虽然 P53自身抗体在多种癌症中被检出，p53突变也在脑胶质瘤的发生中起着重要作用，Rainov 的研究却表明脑胶质瘤病人血清中不存在P53自身抗体。脑胶质瘤病人血清里被鉴定出存在GLEA2，PHF3和Survivin自身抗体，而它们却未经证实是否适用于临床检测，例如以临床上常用的ELISA方式检测。

发明内容
本发明的目的是提供一种人脑胶质瘤标志物，具体涉及一种能区分人脑胶质瘤的蛋白标志物 GFAP(glial fibrillary acidic protein, GFAP)自身抗体。本发明的另一目的是提供该蛋白标志物GFAP的检测方法；尤其涉及脑胶质瘤自身抗体能用于ELISA检测。本发明的另一目的是提供该蛋白标志物GFAP的用途，具体涉及GFAP自身抗体可作为人脑胶质瘤的标志物的用途，尤其用于脑胶质瘤的早期检测和诊断。本发明的目的通过下述技术方案实现，本发明采用健康人和不同分级的脑胶质瘤病人的血清为样本，其相关临床信息如表1所示。通过使用2D-Western在脑胶质瘤中鉴定出12个自身抗原，采用

图1所示的技术路线，通过2D-Western应用于血清蛋白组学研究鉴定可能用于脑胶质瘤检测、诊断及预后的自身抗体。用20个病人血清及其对应健康血清配对进行免疫印迹检测以筛选有用的自身抗原(如表1所示)；经分析比对，仅出现在病人血清中的蛋白点被选中用于进一步分析。本发明采用质谱技术得到了 35个高置信度的蛋白，该些蛋白可能在病人血清中产生自身抗体，经检测，其中的11个出现在不止一个病人的血清中，这11个蛋白，其中的大部分在20个病人血清中出现了两次，HSP70相应的自身抗体出现了三次，而GFAP相应自身抗体则出现了五次(如表2所示)。本发明基于GFAP自身抗体在病人血清中出现的高频率，分析了 GFAP自身抗体应用于临床的可能性。在使用大量病人样本进行确认之前，本发明通过使用鼠抗人GFAP抗体确认GFAP自身抗体的存在。该抗体在2D胶上检测到了 GFAP蛋白点的存在，且其位置与病人血清样本孵育的2D-western膜上的GFAP自身抗体位置一致。GFAP经确认不存在于正常对照及阴性案例中(数据未显示)。本发明进一步为确认GFAP自身抗体是否可作为脑胶质瘤标志物，应用纯化的 GFAP蛋白进行ELISA分析，从而检测血清中的GFAP自身抗体水平，其包括步骤克隆人源 GFAP基因到pGEX-6p-l载体上，在细菌中表达该蛋白并行纯化；本发明中，ELISA实验在96孔板上进行，使用该方法检测包括19个二级，17个三级，M个四级及21个正常血清在内的81个临床样本(如表1所示)，结果显示，GFAP自身抗体水平在正常血清中最低，并随肿瘤等级提升而依次升高；线性回归显示，GFAP自身抗体水平与脑胶质瘤等级的相关性达到显著水平(P = 0. 002，R = 0. 343) ；T测试表明三级和四级脑胶质瘤的GFAP自身抗体水平与正常对照相较均达显著水平(分别为ρ = 0. 031 和 ρ < 0. 001)。本发明中，根据世卫组织分级标准，和根据其他临床因素如年龄、肿瘤体积、肿瘤位置、复发率等诊断指标及的p53、MIB-l、01ig2等分子标志物，检测了这些因素与GFAP自身抗体的相关性。结果显示，所检测指标中只有肿瘤体积与其显著相关(P = 0. 017)，表1 是研究样本的临床特征和统计分析结果。为测验所述的标志物对于脑胶质瘤病人的检测能力，本发明将各等级的脑胶质瘤病人数据合并，通过脑胶质瘤病人组相对于正常对照组进行ROC分析，结果显示，曲线下区域为0. 69(如图5所示)。表1研究样本的临床特征和统计分析结果
权利要求
1.人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体，其特征在于，为下表所示的11个蛋白，其 MALDI-T0F质谱鉴定的特征为SpotAccessionProtein NameMWΡ CoverageFrequencyNumber a(%)C(%)d1GI:5729877heat shock 70kDa protein 8 isoform 1 (HSPA8)70854.25.3738152GI:671527gamma subunit of CCT chaperonin (CCT3)60292.26.2325103GI:31416989pyruvate kinase, muscle (PKM2)57942.17.9614104GI:12025678actinin (ACTN3)104788.55.2734105GI:50845388annexin A2 (ANXA2)40385.78.5328106GI:4507677tumor rejection antigen (gp96)l (HSP90B1)92411.34.7639107GI:38566198glial fibrillary acidic protein (GFAP)49718.65.4224258GI:5453539phosphoribosylaminoimidazole carboxylase47049.16.951810(PAICS)9GI:56204623phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH)53051.46.47371010GI 48146045voltage-dependent anion channel 2 (VDAC2)303936.81551011GI:23274163septin 2 (SHPT2)42657.96.383810
2.按权利要求1所述的的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体，其特征在于，所述的GFAP 自身抗体通过下述方法获得采用健康人和不同分级的脑胶质瘤病人的血清样本，用2D-Western在脑胶质瘤中鉴定出自身抗原和自身抗体；配对进行免疫印迹检测筛选如权利要求1所示的自身抗原，经分析比对，仅出现在病人血清中的蛋白点被选中用于进一步分析；采用质谱技术得到高置信度的蛋白，其中的11个确定为所述的GFAP自身抗体；用鼠抗人GFAP抗体确认GFAP自身抗体的存在；应用纯化的GFAP蛋白进行ELISA分析，从而检测血清中的GFAP自身抗体水平，确认 GFAP自身抗体作为脑胶质瘤标志物。
3.—种检测权利要求1的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体的方法，其特征在于，采用 ELISA分析方法，使用蛋白定量试剂盒检测GFAP蛋白浓度，其包括步骤在96孔板中每孔加入0. 1微克GFAP重组蛋白，溶于pH9. 6的碳酸盐缓冲液，过夜包被，洗涤后，加入含5 % BSA的PBST溶液于4度封闭后，加入血清样品孵育；孵育完毕洗涤，加入1 50000稀释的 goat anti-human IgG-HRP conjugated antibody 在室温下孵育；室温下加入 TMB 底物反应以显色，加入2M硫酸终止反应，在450nm波长下检测各孔吸光度。
4.权利要求1的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体在制备早期检测脑胶质瘤制剂中的用途。
5.权利要求1的人脑胶质瘤标志物GFAP自身抗体在制备诊断脑胶质瘤制剂中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术和医学领域。涉及人脑胶质瘤标志物，具体涉及一种能区分人脑胶质瘤的蛋白标志物GFAP自身抗体的检测及其用途。本发明应用纯化的GFAP蛋白进行ELISA分析，检测正常人和各级脑胶质瘤病人血清中的GFAP自身抗体水平，结果显示GFAP自身抗体水平在正常血清中最低，并随肿瘤等级提升而依次升高；线性回归显示GFAP自身抗体水平与脑胶质瘤等级的相关性达到显著水平；T测试表明三级和四级脑胶质瘤的GFAP自身抗体水平与正常对照相较均达显著水平。实验表明，本发明的GFAP自身抗体可作为人脑胶质瘤的标志物，用于脑胶质瘤的早期检测和诊断。
文档编号G01N33/574GK102532315SQ201010594950
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者危平, 张伟, 施前, 杨柳松 申请人:复旦大学