专利名称：柱状黄杆菌Dot-ELISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，具体地说是一种柱状黄杆菌Dot-ELISA检 测试剂盒。
背景技术：
柱状黄杆菌(Flavobacterium columnaris)又名柱状噬纤维菌(Cytophaga columnaris)，为常见的鱼类致病种。目前，国内外对柱状黄杆菌的检测工作研 究较少，人们通常采取细菌分离及生化鉴定的方法对其进行检测和诊断，也曾 有研究者采用PCR和凝集免疫法对柱状黄杆菌进行确认。但此类方法均存在操 作成本高、费时费力且依赖实验室环境程度高，无法进行现场检测等缺陷，难 以有效应用于野外现场环境。
斑点酶联免疫吸附实验(Dot-ELISA)是上世纪80年代初发展起来的一项 免疫学新技术。它与ELISA相似，只是将固相载体变为硝酸纤维素膜(NC膜)。 Dot-ELISA方法的优点在于快速、简便，既保留了常规ELISA的优点，又克服 了其繁琐的程序，且结果直观可用肉眼直接观察。这种方法不仅较其它方法快 速准确，而且可大幅度降低检验成本，减少劳动强度，省时省料。但是现有 Dot-ELISA所用的设备不易操作、成本高、劳动较复杂、无法在非实验室环境下 进行、难以快速检测、难以有效应用于野外现场环境。 发明内容
本实用新型的目的是针对上述情况，提供了一种柱状黄杆菌Dot-ELISA检测试剂盒，用以解决该致病菌无法现场检测的难题。
本实用新型的目的是这样实现的:所述的柱状黄杆菌Dot-ELISA检测试剂 盒，包括盒体和衬垫，在衬垫上设有放置硝酸纤维素膜的方格及存放不同溶液
不同颜色瓶帽的试剂瓶瓶位，所述的试剂瓶瓶位分别为浓縮PBST液瓶位、PBS 缓冲液瓶位、兔抗柱状黄杆菌抗血清标准液瓶位、辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔IgG标准液瓶位、牛血清白蛋白瓶位、DAB显色液瓶位、柱状黄杆菌抗原标 准菌液瓶位；在盒体盒盖的内侧设有放置培养皿的口袋。
浓縮PBST液瓶位内放置有50ml带白色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，PBS 缓冲液瓶位内放置有50ml蓝色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，兔抗柱状黄杆菌 抗血清标准液瓶位内放置有2ml红色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，辣根过氧 化物酶标记的羊抗兔IgG标准液瓶位内放置有lml绿色标示层瓶帽的透明塑料 试剂瓶，牛血清白蛋白瓶位内放置有紫色标示层瓶帽的深色玻璃试剂瓶，DAB 显色液瓶位内放置有黑色标示层瓶帽的深色玻璃试剂瓶，柱状黄杆菌抗原标准 菌液瓶位内放置有黄色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶。
本实用新型的有益效果由于采用以上技术方案，该试剂盒灵敏高，可检 出的最低检测限为5X 103 cfU，可一次性进行多个样本的测定，减少检测样本 所需要的时间，所需的试剂用不同大小、不同颜色的试剂瓶封装在盒内，易于 快速区分，具有成本节约、操作简便快速、可在非实验室条件进行、便于携带 和运输等优势，能快速、简便、灵敏地用于水产动物致病菌柱状黄杆菌的检测。

图1是本实用新型的结构示意图。
图中l一盒体，2—衬垫，3—方格，4一浓縮PBST液瓶位，5—PBS缓冲液瓶位，6—兔抗柱状黄杆菌抗加.清标准液瓶位，7—辣根过氧化物酶标记的羊
抗兔IgG标准液瓶位，8—牛血清白蛋白瓶位，9一DAB显色液瓶位，IO—柱状
黄杆菌抗原标准菌液瓶位，11—培养皿，12—口袋。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型作进一步说明。图1中，所述的柱状黄杆菌 Dot-ELISA检测试剂盒，包括盒体1和衬垫2，其特征在于在衬垫2上设有放 置硝酸纤维素膜的方格3及存放不同溶液不同颜色瓶帽的试剂瓶瓶位，所述的 试剂瓶瓶位分别为浓縮PBST液瓶位4、 PBS缓冲液瓶位5、兔抗柱状黄杆菌抗 血清标准液瓶位6、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液瓶位7、牛血清白 蛋白瓶位8、 DAB显色液瓶位9、柱状黄杆菌抗原标准菌液瓶位10;在盒体1 盒盖的内侧设有放置培养皿11的口袋12。
浓缩PBST液瓶位4内放置有50ml带白色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶， PBS缓冲液瓶位5内放置有50ml蓝色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，兔抗柱状 黄杆菌抗血清标准液瓶位6内放置有2ml红色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶， 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液瓶位7内放置有lml绿色标示层瓶帽 的透明塑料试剂瓶，牛血清白蛋白瓶位8内放置有紫色标示层瓶帽的深色玻璃 试剂瓶，DAB显色液瓶位9内放置有黑色标示层瓶帽的深色玻璃试剂瓶，柱状 黄杆菌抗原标准菌液瓶位10内放置有黄色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶。
用试剂盒内的试剂配制如下溶液
配制PBST缓冲液用去离子水将浓縮PBST液按1: 19体积比进行稀释；
配制封闭液取0.1克牛血清白蛋白，加PBS缓冲液至100ml; 配制兔抗柱状黄杆菌抗血清作用液(一抗)用PBST缓冲液将兔抗柱状黄杆菌抗血清标准液按l: 500体积比进行稀释；
配辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作用液(酶标二抗)用PBST缓冲液 将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液按1: 1000体积比进行稀释； 试剂盒的操作步骤
A. 滴样先将样品用匀浆器将所需检测的组织匀浆，经抗原包被缓冲液 (PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)稀释，取10nl所测样品或柱状黄杆菌抗原标准菌 液的稀释液滴于硝酸纤维素膜上，在自然条件下干燥1 2小时；
B. 洗涤将已点样的硝酸纤维素膜放置于培养皿ll中，加PBST缓冲液中
漂洗3次，每次5分钟；
C. 封闭取出，再将硝酸纤维素膜浸入配好的封闭液中，于自然条件下孵
育60min，期间摇动3 4次，取出后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5 min，每 次洗涤中间摇动数次；
D. 加抗体取出，再将硝酸纤维素膜浸入稀释后的兔抗柱状黄杆菌抗血清 标准液中，自然条件下孵育lh，取出，漂洗3次，每次5分钟；再将其浸入稀
释后的辣根过氧化物酶标记标记的羊抗兔IgG标准液中，自然条件下孵育1.5h， 取出，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5分钟；
E. 底物显色及终止反应将硝酸纤维素膜浸入DAB显色液中，于自然条 件下避光显色15min，取出，当硝酸纤维素膜出现明显斑点后，用蒸馏水漂洗2 次以终止反应，然后取出硝酸纤维素膜置于干净的滤纸上自然干燥，记录试验 结果，避光保存。
F. 结果判定观察硝酸纤维素膜上的颜色，与阳性和空白结果进行比较， 或与标准反应图例进行对照从而得出结果。
权利要求1.一种柱状黄杆菌Dot-ELISA检测试剂盒，，包括盒体(1)和衬垫(2)，其特征在于在衬垫(2)上设有放置硝酸纤维素膜的方格(3)及存放不同溶液不同颜色瓶帽的试剂瓶瓶位，所述的试剂瓶瓶位分别为浓缩PBST液瓶位(4)、PBS缓冲液瓶位(5)、兔抗柱状黄杆菌抗血清标准液瓶位(6)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液瓶位(7)、牛血清白蛋白瓶位(8)、DAB显色液瓶位(9)、柱状黄杆菌抗原标准菌液瓶位(10)；在盒体(1)盒盖的内侧设有放置培养皿(11)的口袋(12)。
2. 根据权利要求l所述柱状黄杆菌Dot-ELISA检测试剂盒，其特征在于浓缩PBST液瓶位(4)内放置有50ml带白色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，PBS缓冲液瓶位(5)内放置有50ml蓝色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，兔抗柱状黄杆菌抗血清标准液瓶位(6)内放置有2ml红色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液瓶位(7)内放置有lml绿色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶，牛血清白蛋白瓶位(8)内放置有紫色标示层瓶帽的深色玻璃试剂瓶，DAB显色液瓶位(9)内放置有黑色标示层瓶帽的深色玻璃试剂瓶，柱状黄杆菌抗原标准菌液瓶位(10)内放置有黄色标示层瓶帽的透明塑料试剂瓶。
专利摘要本实用新型提供了一种柱状黄杆菌Dot-ELISA检测试剂盒，包括盒体和衬垫，其特征在于在衬垫上设有放置硝酸纤维素膜的方格及存放不同溶液不同颜色瓶帽的试剂瓶瓶位，所述的试剂瓶瓶位分别为浓缩PBST液瓶位、PBS缓冲液瓶位、兔抗柱状黄杆菌抗血清标准液瓶位、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液瓶位、牛血清白蛋白瓶位、DAB显色液瓶位、柱状黄杆菌抗原标准菌液瓶位；在盒体盒盖的内侧设有放置培养皿的口袋。本实用新型可一次性进行多个样本的测定，减少样本检测时间，操作简便快速，可在非实验室条件进行，便于携带和运输，能快速、简便、灵敏地用于水产动物致病菌柱状黄杆菌的检测。
文档编号G01N33/551GK201402264SQ200920084810
公开日2010年2月10日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者于艳梅, 迁 刘, 吴志新, 君 夏, 杜玉东, 杨瑞斌, 王桂堂, 谢从新, 陈孝煊 申请人:陈孝煊