专利名称：乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及基因芯片技术领域，具体地是涉及乙肝病毒突变位点的寡核苷酸检测芯片，利用寡核苷酸芯片的固相PCR来检测乙肝病毒突变位点。
基因芯片技术是在二十世纪九十年代发展起来的一项新兴的生物技术，它是聚合酶链式反应(PCR)和邵氏(Southern)杂交的集成。它通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的DNA有序地固定在载体表面，形成储存有大量信息的DNA阵列。该阵列与标记的探针杂交后，在短时间内快速、准确地获取大量信息。具有高通量、缩微化及平行分析的特点。基因芯片的制备主要有两种方式，固相合成和合成后点样。埃菲麦瑞克斯(Affymetrix)公司利用固相光化学合成法已开发出一系列寡核苷酸芯片，每平方厘米上探针的数量可达244000个。但该方法合成成本高，不适合较长的寡核苷酸。与之相比，合成后点样法是将合成的寡核苷酸或是其它DNA分子通过点样仪点到基片上。该方法灵活多样，可以根据需要灵活设计探针的排列，尤其适合低密度的临床检测芯片。

发明内容本实用新型针对现有技术的不足，提供一种乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片。
本实用新型的乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，包括长方形或正方形玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照的点涂层，所述点涂层为圆形涂层，在玻璃基片上阵列式均匀分布的，含有包括乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的12个突变位点和其相对应的野生位点的72条寡核苷酸探针。
上述玻璃基片表面有修饰层，修饰层是3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化层或者经三甲氧基丙基-乙烯亚胺修饰、丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯活化的层面。
上述寡核苷酸芯片上的所有探针通过5′末端氨基己烷连接在上表面修饰后的玻璃载片上。
上述寡核苷酸探针所在阵列与对照的点涂层的大小可以根据点的大小，点间距的变化而变化；阵列的排列和分布数量可以根据待分析样品的数目而变化。
上述寡核苷酸探针排列如附

图1所示，探针点直径为100μm，点间距为300μm，寡核苷酸探针所在阵列与相应的点涂层大小为2.2mm×2.5mm。
上述的72条寡核苷酸探针包含的12个突变位点是，乙肝表面抗原区已知的5个突变位点546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原区7个已知的突变位点1896G-A、1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
上述的72条寡核苷酸探针，每一个待检测位点包括6条探针，突变位点和野生位点的正、反义链探针共计4条。阳性对照探针2条，分别位于正、反义链，它缺少3′末端的待检测碱基。
上述的寡核苷酸探针的长度为14-19mer。
本实用新型总的构思是集寡核苷酸芯片和固相PCR反应于一体。在PCR反应中，鉴于TaqDNA聚合酶在引物的3′末端存在错配时不能正确延伸的特点，将突变位点设计在检测探针的3′末端，然后将其5′末端固定在修饰层的玻璃基片上作为寡核苷酸芯片的探针、固相PCR反应的固相引物，其3′末端游离。设计不同的液相引物，使其与固相引物配对。为确保扩增的效率和准确性，所扩增的PCR区域不超过150bp，荧光标记采用Cy3-dCTP。固相PCR扩增结果的检测采用荧光扫描或是荧光显微镜观察。
本实用新型中，乙肝每一个突变位点在DNA的正、反义链上分别设计有相应的检测探针，同时还有与检测探针相对应，仅缺少3′末端待检测碱基在内的阳性对照探针。所以，每一突变位点设计有6条寡核苷酸探针，阳性对照探针2条、突变检测探针2条、野生检测探针2条，均分别设计在DNA的正、反义链上。根据阳性对照，如果某一位点的在正、反义链上的突变探针的阳性信号强度远高于野生探针，证明该位点为纯合突变位点M/M；反之为纯合野生位点W/W。如果同一位点在正、反义链上的探针信号强度相近，证明该位点为杂合位点M/W。
表1乙肝前S区与C区突变位点检测探针
Tm值是解链温度，GC％是鸟嘌呤与胞嘧啶的百分含量。
其中，每一位点所标出的6条探针的排列次序按序号从低到高分别是正义链的阳性对照探针、野生检测探针和突变检测探针，反义链的阳性对照探针、野生检测探针和突变检测探针。同时，该表中还包含了探针的序列、长度、Tm值和GC百分比等内容。
本实用新型的优良效果是，与传统的突变检测技术，如PCR和RFLP等分子标记技术相比，它可以同时高通量地检测很多突变位点，平行分析多个样品。与常规的基因芯片相比，它直接在芯片上进行PCR扩增，PCR扩增结束后即可直接通过扫描检测结果而不必要经过杂交，从而缩短了检测时间。本实用新型利用寡核苷酸芯片的固相PCR反应来检测乙型肝炎病毒突变位点，可获得与突变位点相关的临床信息，指导临床用药。
其中，1为玻璃基片，2为寡核苷酸探针与对照的点涂层，3为修饰层。圆圈内的数字与表1所列出的寡核苷酸探针序号相对应。
寡核苷酸探针与对照的点涂层2阵列共计8行9列，探针点直径为100μm，点间距为300μm，总面积为2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分别代表乙肝S区待检测位点546、551、552、585、587；前C区待检测位点1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12组72条寡核苷酸检测探针。每一组的6条探针分左右两排排列，左边的一排从上到下分别是该位点正义链上的阳性对照、野生探针和突变探针；右边的一排从上到下分别是该位点反义链上的阳性对照、野生探针和突变探针。点样后的阵列经水合后直接用于固相PCR扩增。
固相PCR在寡核苷酸芯片上进行，寡核苷酸探针同时是固相PCR扩增的固相引物，三对液相引物包括了所有待检测突变位点在内的区域，且保证最长的扩增片段不超过150bp。在固相PCR扩增过程中采用Cy-3-dCTP荧光掺入标记。寡核苷酸芯片的固相PCR产物经激光共聚焦扫描仪扫描后分析各突变位点。
实施例2.如实施例1所述的乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，所不同的是玻璃基片1是正方形薄片，是经过三甲氧基丙基-乙烯亚胺修饰、丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯活化的玻璃载片，3是修饰层。
权利要求1.乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，包括长方形或正方形玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照的点涂层，其特征在于点涂层为圆形，所述点涂层是在玻璃基片上阵列式均匀分布的，含有包括乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的12个突变位点和其相对应的野生位点的72条寡核苷酸探针。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，其特征在于，所述玻璃基片上表面有修饰层，修饰层是3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化层或者经三甲氧基丙基-乙烯亚胺修饰、丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯活化的层面。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，其特征在于，所述寡核苷酸芯片上的所有探针通过5′末端氨基己烷连接在修饰后的玻片上。
4.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针所在阵列与对照的点涂层的大小是探针点直径为100μm，点间距为300μm时，肽核酸探针所在阵列与相应的点涂层大小为2.2mm×2.5mm。
5.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针的长度为14-19mer。
专利摘要乙型肝炎病毒突变位点寡核苷酸检测芯片，属于基因芯片技术领域。包括长方形或正方形玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照的点涂层，点涂层是在玻璃基片上阵列式均匀分布的，含有包括乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的12个突变位点和其相对应的野生位点的72条寡核苷酸探针；玻璃基片是硅烷化玻璃载片，或是经过三甲氧基丙基－乙烯亚胺修饰、丁二酸－N－羟化丁二酰亚胺酯活化的玻璃载片；寡核苷酸探针的长度为15－19mer。本发明用于乙型肝炎病毒突变位点的检测，集寡核苷酸芯片和固相PCR于一体，具有快速、高效、准确、平行诊断的特点。
文档编号G01N33/574GK2574056SQ0227006
公开日2003年9月17日 申请日期2002年10月14日 优先权日2002年10月14日
发明者鲁艳芹, 韩金祥 申请人:山东省医药生物技术研究中心