专利名称：一种检测胎膜早破的免疫层析试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫层析试纸，具体涉及一种检测胎膜早破的免疫层析试纸。
背景技术：
免疫层析试纸是一种利用层析原理将待检测液中的目标检测分子或成分等在试纸条上流动至检测线(T线)和质控线(C线)，当检测线发生颜色变化则说明检测结果为阳性，否则为阴性，当质控线发生颜色变化时，则说明检测结果有效，否则无效。免疫层析试纸在检测或诊断某些疾病时具有非常便利的优点，因此其已被充分运用到多种疾病或症状的检测或诊断过程中，例如早孕试纸。一般情况下，免疫层析试纸包含有以下几种结构:样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫、胶板，所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴在胶板上；所述层析膜上依次设置有检测线和质控线；其工作原理为:将待测液滴加至样品垫上，待测液利用层析原理流向胶体金结合垫，待测液溶解胶体金结合垫中的胶体金结合物，并与其共同依次流向层析膜上的检测线和质控线；当待测液中含有目标检测分子，则目标检测分子、胶体金结合物会与检测线内包含的抗体成分结合从而形成免疫复合物，同时检测线颜色发生变化；当待测液流至质控线时，质控线内包含的抗体成分会与胶体金结合物结合，从而质控线颜色发生变化。胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane,简称ROM)在孕期可能随时发生,在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破(PR0M)。足月后(37孕周后)PR0M的发生率约为10%，足月前(37孕周前)PROM的发生率为2-3.5%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素，也是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。现有检测胎膜·早破的方法中除以往的临床询问病史等方法外，主要以妊娠妇女阴道分泌物中的可溶性细胞间粘附分子-1 (简称SlCAM-1)为检测指标的检测工具为较新的方法。其中以sICAM-1为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸对于产科病人及时诊断是否发生胎膜早破起到了较好的效果；所述免疫层析试纸的检测线内包被有羊抗人sICAM-1多克隆抗体工作液，质控线内包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体工作液，胶体金结合物中含有鼠抗人sICAM-1单克隆抗体。现有临床对胎膜早破的诊断过程中，部分胎膜破口大、阴道羊水流量大的产科病人能够得到及时的诊断，而对于部分胎膜破口小、破口位置高、阴道羊水流量小的产科病人而言，目前临床诊断仍然存在一定的困难，从而容易耽误产科病人及时就诊的时间；而现有仅以sICAM-1为检测指标的检测胎膜早破的免疫层析试纸对于前述的胎膜破口小、破口位置高、阴道羊水流量小的产科病人而言，其检测结果的灵敏性和特异性往往受限，不够理想，从而容易造成误诊，对产科病人来说同样会造成不便。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种检测胎膜早破的免疫层析试纸，该免疫层析试纸在检测胎膜早破时，其检测结果的灵敏性和特异性有较明显的提高，分别可达到99%以上和96%以上，从而减少误诊的发生率。为解决以上技术问题，本发明的技术方案是采用一种检测胎膜早破的免疫层析试纸，该免疫层析试纸包括有样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫、胶板；所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫依次按顺序与胶板连接；所述层析膜上依次设置有检测区和质控区，所述检测区靠近胶体金结合垫一端，所述质控区靠近吸水垫一端；所述检测区内设置有检测线，所述检测线依次设置为主检测线和副检测线，所述主检测线为由羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体包被形成；所述副检测线为由一种或两种不同的抗体分别包被形成一条或两条副检测线；所述副检测线中包被的抗体为选自兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体以及兔抗人Axl多克隆抗体；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成；所述各抗体的工作液浓度为:羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体1-2.5mg/mL、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体0.2_2mg/mL、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体0.5-2.5mg/mL、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体0.5-2.5mg/mL、兔抗人Axl多克隆抗体0.5-2mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体0.5-2mg/mL ；所述胶体金结合垫中包被有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体。优选的，所述副检测线中包被的抗体为一种或两种选自兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体。优选的，所述副检测线中包被的抗体分别为兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体。

优选的，所述检测线以及质控线中各抗体的工作液浓度为羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体1.5-2.5mg/mL、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体l_2mg/mL、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体0.5-1.5mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体0.5-1.5mg/mL。优选的，所述检测线以及质控线中各抗体的工作液浓度为羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体2.5mg/mL、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体1.5mg/mL、兔抗人胎盘ct -微球蛋白-1抗体lmg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体1.5mg/mL。本发明与现有技术相比，其详细说明如下:本发明采用的技术方案为:检测胎膜早破的免疫层析试纸，该免疫层析试纸包括有样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫、胶板；所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫依次按顺序与胶板连接；所述层析膜上依次设置有检测区和质控区，所述检测区靠近胶体金结合垫一端，所述质控区靠近吸水垫一端；所述检测区内设置有检测线，所述检测线依次设置为主检测线和副检测线，所述主检测线为由羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体包被形成；所述副检测线为由一种或两种不同的抗体分别包被形成一条或两条副检测线；所述副检测线中包被的抗体为选自兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体以及兔抗人Axl多克隆抗体；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成；所述各抗体的工作液浓度为:羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体1-2.5mg/mL、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体0.2_2mg/mL、兔抗人胎盘α -微球蛋白-1抗体0.5-2.5mg/mL、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体0.5-2.5mg/mL、兔抗人Axl多克隆抗体0.5-2mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体0.5-2mg/mL ；所述胶体金结合垫中包被有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体。首先,细胞间粘附分子(intercellularadhesive moleculel,简称 ICAM-1)是一种参与细胞与细胞之间以及细胞与外基质之间相互作用的分子统称，包括有存在于体液中的可溶性细胞间粘附分子(soluble intercellular adhesive moleculel,简称 sICAM-1)和存在于细胞表面的膜型细胞间粘附分子(简称膜型ICAM-1)。其中，sICAM-1不仅保留了膜型ICAM-1的生物学特性，其还是膜型ICAM-1在体液中的可溶形式。本发明人经过充分的研究发现，发生胎膜早破的妊娠妇女受羊水中的单核细胞上sICAM-1的表达和中性粒细胞的影响，其阴道分泌物中的sICAM-1含量明显升高，现已有将sICAM-1为目标分子来检测胎膜早破的检测工具，如免疫层析试纸，但在实际应用过程中，其检测目标分子单一，若发生胎膜早破时，出现胎膜破口小、破口高、阴道羊水流量小的情况时，则易造成灵敏性和特异性均较低，容易产生误诊。本发明所述灵敏性为患病人群中得出阳性检测的样本占病人总数的百分比，特异性为健康人群中得 出阴性检测的样本占健康人总数的百分比。影响本发明免疫层析试纸检测结果灵敏性和特异性的因素较多，包括有免疫层析试纸本身的差异，如检测线工作液的选择、检测线工作液的浓度以及质控线工作液的浓度等，另外，试纸本身的制作工艺也同样会对检测结果的灵敏性和特异性有一定的影响。本发明人经过充分的研究发现，sICAM-1是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质之一，含量一般为14ng/mL左右；而发生胎膜早破时,羊水中含量较多的sICAM-1则会出现在阴道分泌物中。另外，除了上述sICAM-1在发生胎膜早破的妇女阴道液样本中含量较多夕卜，其他含量明显增多的抗原还有胰岛素样生长因子结合蛋白-1、胎盘α -微球蛋白-1、甲胎蛋白以及Axl。因此，本发明主要采用以妊娠妇女阴道分泌物中的多种抗原成分作为共同检测目标分子。本发明经过蛋白芯片筛选试验发现，确诊的胎膜早破产妇与确诊的非胎膜早破产妇相比(两组产妇的年龄与妊娠周龄匹配，无基础疾病，无妊娠合并症)，其阴道分泌物样本中sICAM-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-1、胎盘α-微球蛋白-1、甲胎蛋白以及Axl的浓度具有明显差异；其中，确诊的胎膜早破产妇阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在2ng/mL以上，而确诊的非胎膜早破产妇阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在Ing/mL以下；确诊的胎膜早破产妇以及健康对照组的阴道分泌物样本中的sICAM-1的平均浓度、胰岛素样生长因子结合蛋白-1的平均浓度、以及Axl的平均浓度可参见下表(详见实施例1);胎盘α -微球蛋白-1在检测妊娠妇女胎膜早破的应用等数据可参考文献:郭广玲，刘永珍，等.检测阴道液中胎盘α微球蛋白-1诊断胎膜早破的价值[J].中国医师进修杂志，2010，33 (15);甲胎蛋白的平均浓度可参见文献:易媛媛，其木格，等.检测阴道液HCG及AFP水平诊断胎膜早破的临床价值[J].内蒙古医学杂志，2008，40 (7):794-797.本发明中不再赘述。
权利要求
1.一种检测胎膜早破的免疫层析试纸，该免疫层析试纸包括有样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫、胶板；所述样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫依次按顺序与胶板连接；其特征在于:所述层析膜上依次设置有检测区和质控区，所述检测区靠近胶体金结合垫一端，所述质控区靠近吸水垫一端；所述检测区内设置有检测线，所述检测线依次设置为主检测线和副检测线，所述主检测线为由羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体包被形成；所述副检测线为由一种或两种不同的抗体分别包被形成一条或两条副检测线；所述副检测线中包被的抗体为选自兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体以及兔抗人Axl多克隆抗体；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成； 所述各抗体的工作液浓度为:羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体1-2.5mg/mL、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体0.2-2mg/mL、兔抗人胎盘a-微球蛋白-1抗体0.5-2.5mg/mL、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体0.5-2.5mg/mL、兔抗人Axl多克隆抗体0.5-2mg/mL、羊抗鼠 IgG 多克隆抗体 0.5-2mg/mL ； 所述胶体金结合垫中包被有鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的免疫层析试纸，其特征在于:所述副检测线中包被的抗体为一种或两种选自兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘a-微球蛋白-1抗体。
3.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的免疫层析试纸，其特征在于:所述副检测线中包被的抗体分别为兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘a-微球蛋白-1抗体。
4.根据权利要求3所述的检测胎膜早破的免疫层析试纸，其特征在于:所述检测线以及质控线中各抗体的工作液浓度为羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体1.5-2.5mg/mL、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体l_2mg/mL、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体0.5-1.5mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体0.5-1.5mg/mL。
5.根据权利要求4所述的检测胎膜早破的免疫层析试纸，其特征在于:所述检测线以及质控线中各抗体的工作液浓度为羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体2.5mg/mL、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体1.5mg/mL、兔抗人胎盘a -微球蛋白-1抗体lmg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗体1.5mg/mL。
6.一种制备权利要求1所述的检测胎膜早破的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于包括有以下各步骤: A、将各抗体检测线工作液和质控线工作液在硝酸纤维素膜上进行包被，所得硝酸纤维素膜在36-38°C下干燥8-12小时得层析膜； B、将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体和胶体金制备成胶体金结合垫； C、将A和B步骤所得的层析膜和胶体金结合垫按照样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水垫的顺序依次粘贴在胶板上制备得所述检测胎膜早破免疫层析试纸。
全文摘要
本发明公开一种免疫层析试纸，具体涉及一种检测胎膜早破的免疫层析试纸。所述免疫层析试纸上设置有多条检测线，每条检测线由不同的抗体包被形成，所述抗体选自羊抗人可溶性细胞间粘附分子-1多克隆抗体、兔抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1抗体、兔抗人胎盘α-微球蛋白-1抗体、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体以及兔抗人Axl多克隆抗体；质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成；本发明免疫层析试纸在检测胎膜早破时，其检测结果的灵敏性和特异性有较明显的提高，分别可达到99%以上和96%以上，从而减少误诊的发生率。
文档编号G01N33/531GK103235134SQ20131016695
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者关祥乾, 胡怀忠 申请人:成都创宜生物科技有限公司