专利名称：检测自身免疫性肝病相关抗体抗ama-m2型抗体的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，本发明还涉及使用该试剂盒检测抗AMA-M2型抗体的方法。
背景技术：
自身免疫性肝病(autoimmune liver dise ases)主要包括三种与自身免疫密切相关的、以肝胆损伤为主的疾病自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)和原发性硬化性胆管炎(primarysclerosing cholangitis, PSC)。AIH是一种伴循环自身抗体和高免疫球蛋白血症、病因未明、呈慢性炎性坏死的肝脏疾病，PBC是以自身免疫介导的肝内胆管损伤、以后呈肝纤维化、最终导致肝功能衰竭为特征的一类病因不明的自身免疫性肝脏疾病，PSC是一种原因不明的慢性综合征，其特征是肝外和/或肝内胆管弥漫性炎症及纤维化所引起的慢性胆汁淤积症。近年来，国际上对自身免疫性肝病基础与临床的研究高度重视，并且进展迅速，主要涉及自身免疫性肝病的发病机制、遗传背景、相关自身抗体及其靶抗原性质、临床流行病学、临床诊断及治疗和预后等方面。自身免疫性肝病的诊断主要依靠病史、临床表现、体征和实验室检查结果。肝组织病理学检查被认为是AIH，PBC诊断的“金标准”，但此项检查临床应用具有局限性，例如，自身免疫性肝病的肝活检组织病理学表现特异性不强，非自身免疫性肝病所特有；患者不愿或不适接受此项创伤性检查；此外，目前多数医院采用B超引导下细针穿刺取材进行肝组织病理学检查，此检查受取材标本局限，是否能取得病变组织，对检查结果影响很大。尽管如此，肝组织病理学检查对自身免疫性肝病诊断、鉴别诊断及病变程度的判断至关重要，仍是诊断的重要标准之一。AIH，PBC早期病变(胆管炎期、慢性胆汁淤积期)属临床治疗可逆转期或可部分逆转期，后期或终末期(肝纤维化/肝硬化期、肝衰竭期)属临床治疗不可逆转期，愈后不佳。因此，早期诊断、早期治疗尤为重要。自身免疫性肝病发病机制与免疫功能异常密切相关，自身抗体在发病机制中起重要作用。每种自身免疫性肝病都具有特征性自身抗体谱，自身抗体检测对自身免疫性肝病的诊断、分型及鉴别诊断具有重要意义。近年来，国外对自身免疫性肝病相关自身抗体谱靶抗原性质、临床诊断应用价值(尤其是无症状期的早期诊断)、与疾病临床特点及活动性的关系等方面研究进展迅速，有关自身抗体谱的研究已引起临床高度重视，自身抗体检测已成为自身免疫性肝病临床诊断的常规检查项目。近年来，由于临床经验的积累和实验室诊断技术的进步，发现我国人群中自身免疫性肝病患者逐渐增多。国内有关自身免疫性肝病的发病机制、相关自身抗体靶抗原、病例报道、临床病例讨论和临床病理分析的文章逐渐增多，以上的工作说明自身免疫性肝病在中国并不少见。抗线粒体抗体(AMA)为一组可同线粒体内膜或外膜上多种酶复合物成分相结合的自身抗体的总称。AMA是一种以线粒体为靶抗原、无种属和器官特异性的自身抗体，在PBC中的敏感性和特异性都高于90% 95%，已成为诊断PBC (原发性胆汁性肝硬化)的主要检查项目。PBC早期AMA常为低滴度，随着病情进展，AMA可逐渐升高，但其滴度高底与疾病严重度或预后并不相关。若AMA高滴度阳性，即使无PBC症状及生化异常，亦强烈提示为PBC。极少数患者临床、生化及组织学均符合PBC诊断但AMA阴性，其自然病程及相关的自身免疫状况和AMA阳性的PBC患者无差异。AMA可分为M1-M9共9个亚型，与PBC密切相关的是M2、M4、M8、M9，其中M2诊断PBC的特异性最高。以线粒体内膜上的2-酮酸脱氢酶复合物为靶抗原的AMA-M2抗体(抗线粒体抗体M2亚型)，是PBC患者的高度特异性自身抗体，敏感性为95% 98%，特异性达97%。有学者认为当AMA-M2亚型抗体高滴度时，确诊PBC不再需要肝组织活检病理证实。临床上常用间接免疫荧光法(HF)检测患者中出现的抗AMA-M2抗体，其实验基质通常为不同灵长类动物的肝脏、胃、肾脏组织冰冻切片，含有完整的抗原谱，但是对间接免疫荧光分析法着染得鉴定具有一定的主观性，因而对结果的解释可能在不同时间点、不同观察者之间、新老组织切片之间存在差异，并且需要荧光显微镜等仪器的辅助，在一般的中小医院 难以开展。所以，目前对抗AMA-M2抗体(抗线粒体M2型抗体)的诊断方法还需进一步改进。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，使用该试剂盒可以定量和定性检测抗AMA-M2抗体，从而准确诊断出自身免疫性肝病的类型及严重程度，指导医生用药；本发明还公开了使用该试剂盒检测抗AMA-M2型抗体的方法，该方法灵敏度高、特异性强、准确性好，适用于半自动或全自动检测系统或肉眼判读。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，包括固相载体，酶标二抗工作液，阳性对照品，阴性对照品，校准品，样品稀释液，底物和洗涤液，所述固相载体为固定有抗AMA-M2型抗体靶抗原的微孔板、磁微粒或磁球，即将AMA-M2抗体特异性结合的靶抗原作为捕获抗体结合到相同固相载体上，形成抗原-载体结合物；所述酶标二抗工作液中所用二抗为鼠或羊或兔抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，所用二抗标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，吖啶酯、异鲁米诺或稀土元素。所述样品稀释液由浓度小于10%的氯化钠缓冲液和浓度小于1%的保护蛋白组成。所述保护蛋白为酪蛋白、白蛋白、蛋白胨、明胶、动物血清或人血清。所述祀抗原为天然抗原、重组抗原、合成肽、HepG2细胞、Hep2细胞、Hela细胞或细胞裂解抗原。所述底物为发光底物或显色底物。所述发光底物为发光底物A和发光底物B，所述发光底物A由O. 2M Tris-HCUO. 15mM Luminol.O. 59mM羟基香豆素、O. 35mM没食子酸组成；所述发光底物B由O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM维生素C组成。本发明试剂盒的检测方法，包括下述步骤
第一步，将待检测血清用样品稀释液稀释成血清样本，分别将阳性对照品、阴性对照品、校准品和血清样本加入到固相载体中孵育，使待测血清样本与抗原-载体结合物接触，使得血清样本中的AMA-M2抗体(如果存在的话)被捕获，形成抗体-抗原-载体结合物；如果样品是血浆时，需要离心后进行检测；
第二步，样本反应结束后，弃去反应液，用洗涤液洗板；
第三步，将酶标二抗工作液于第二步洗板后加入固相载体的每一反应孔中，孵育；该步骤可使酶标二抗和上述的抗体-抗原-载体结合物接触，反应；
第四步，反应结束后，弃去反应液，用洗涤液洗板；
第五步，加入相应的底物(如发光底物或显色底物)检测，仪器检测信号值来定性或定量判断样本中被测抗体，或通过免疫层析或免疫渗滤法肉眼或仪器读取样本定性或定量结果O本发明的优点在于通过化学发光法或酶标法或金标法或时间分辨法或荧光法可以定量和定性检测抗AMA-M2抗体，当AMA-M2抗体浓度大于或等于lAU/ml时，可判断为PBC阳性，病情严重度与检测样本浓度值正相关，适用于半自动或全自动检测系统或肉眼判读结果，从而准确诊断出自身免疫性肝病的类型以及严重程度，指导医生用药，为病人早期诊断、早期治疗提供保障。
具体实施例方式下面分别举出板式结构试剂盒和磁微粒结构试剂盒，并说明其检测使用方法。应该理解的是，下述实施例仅用于例证的目的，绝不仅限制本发明的范围。实施例I :
本发明检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体(抗线粒体抗体M2亚型)的试剂盒(板式)包括
1、靶抗原-载体结合物的制备将不高于10ug/ml的靶抗原(天然抗原、重组抗原、合成肽、HepG2细胞、H印2细胞、Hela细胞或细胞裂解抗原)100 μ I加入到96孔板中，4°C包被16-24h或37°C包被2h，之后用配制好的(PBST)洗涤液洗涤两遍；
2、封闭用50-200 μ I 的含 O. 05-0. 5%Tween20, 1_5%BSA，l_5%Casein，1-5% 蛋白胨，5-10%的蔗糖的O. 01-0. IM的磷酸缓冲液，4°C封闭16_24h或37°C封闭2h，之后甩去多余的缓冲液，置于干燥的环境中晾干，晾干后，密封于2-8°C保存；
3、校准品、阳性对照品和阴性对照品的配制取临床上定值的高值样本，用校准品稀释液(PBS+3%BSA)按不低于I :50倍稀释，取线性较好的4 8个点作为校准品，选择不低于2AU/ml浓度的校准品作为阳性对照品，选择OAU/ml浓度的校准品作为阴性对照品；
4、酶标二抗工作液的配制所述酶标二抗工作液中所用二抗为抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，用酶稀释液(PBS+l%Casein)按不高于1:200倍稀释制备酶标二抗工作液；所用二抗标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯、异鲁米诺或稀土元素。5、组装将上述96孔抗原包被板一块，校准品6X1. Oml,阴性对照1X1. Oml,阳性对照1X1. Oml,酶标二抗工作液IX 12ml，样品稀释液(PBS+3%BSA) IX 100ml，浓缩洗液20X50ml(PBST),发光底物Α(0· 2Μ Tris-HCl.O. 15mM Luminol、0· 59mM羟基香豆素、O. 35mM没食子酸)和发光底物B (O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM维生素C)各lX7ml组装在一起形成完整的试剂盒。检测方法测试样本的处理
血清使用不含热原和内毒素的试管取静脉血2-5ml,操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转/min离心IOmin,将血清和红细胞迅速小心的分离,血清标本保存于2-8 V，在24h内不能测试的标本应放在-20 V冰箱内保存，严重溶血、有絮状物的血清标本会影响测试结果。血浆使用EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，3000转/min离心30min取上清，保存方法
同血清。I、加样用样品稀释液(含有BSA的Tris-NaCl缓冲液)按照1:100稀释待检样本，充分混匀后各加入100 μ I不同浓度(I 100AU/ml)的校准品和100 μ I稀释后的待检样本到靶抗原-载体结合物中，放入37°C恒温箱中孵育30min ； 2、洗板样本反应结束后，弃去反应液，用配制好的洗液手工或在自动洗板机洗涤6XImin ；
3、加入酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体1:500倍稀释，向每一反应孔中加入100 μ 1，放入37°C恒温箱中孵育30min ；
4、洗板样本反应结束后，弃去反应液，用配制好的洗液手工或在自动洗板机洗涤6XImin ；
5、加入底物检测向每一反应孔中加入配制好的发光底物A和B各50μ1，震荡混匀后，室温5min用发光仪检测结果，以校准品浓度为横坐标，对应发光值为纵坐标，绘制出校准品线性回归曲线，按曲线方程计算待测样本的浓度值。当计算出的浓度值小于lAU/ml时，标本呈阴性，说明诊断PBC的可能性比较小。当计算出的浓度值大于或等于lAU/ml时，标本呈阳性，说明诊断PBC的可能性比较大。实施例2
本发明所述的检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型(抗线粒体抗体M2亚型)抗体的试剂盒(磁微粒)包括
1、革巴抗原-载体结合物的制备取IOmg磁微粒,用磷酸盐缓冲液洗漆5遍,加入不低于
O.15mlEDC或(和)NHS或戊二醛(和)活化剂活化2h后，洗涤3遍，之后加入O. Img的靶抗原，室温震荡包被2h ；
2、封闭用Iml 的含 O. 05-0. 5%Tween20,1_5%BSA，l_5%Casein，1-5% 蛋白胨，5-10% 的蔗糖的O. 01-0. IM的磷酸缓冲液，室温振荡封闭lOmin，连续封闭四次，之后加入2ml封闭液于2-8°C保存；
3、校准品、阳性对照品和阴性对照品的配制取临床上定值的高值样本，用校准品稀释液(PBS+3%BSA)按不低于I :50倍稀释，取线性较好的4 8个点作为校准品，选择不低于2AU/ml浓度的校准品作为阳性对照品，选择OAU/ml浓度的校准品作为阴性对照品；
4、酶标二抗工作液的配制所述酶标二抗工作液中所用二抗为抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，用酶稀释液(PBS+l%Casein)按不高于1:200倍稀释制备酶标二抗工作液；所用二抗标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，吖啶酯、异鲁米诺或稀土元素。5、试剂盒的组装将2ml祀抗原_磁微粒结合物，校准品6X1. Oml>阴性对照I X I. Oml、阳性对照I X I. Oml、样品稀释液I X IOOml、浓缩洗液20 X 50ml (PBST)、发光底物A (O. 2M Tris-HCl、0. 15mM Luminol、0. 59mM羟基香豆素、0. 35mM没食子酸)和发光底物B (O. 85mM 氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM 维生素 C)各 I X 7ml 组装在一起即可。检测方法
测试样本的处理同实施例I。I、加样用样品稀释液(含有BSA的Tris-NaCl缓冲液)按照1:100稀释待检样本，之后各加入100 μ I不同浓度(I 100AU/ml)的校准品和100 μ I稀释后的待检样本到反应孔中，之后每个反应孔中各加入20 μ I靶抗原-磁微粒结合物，放入37 °C恒温箱中孵育15min ；
2、洗板样本反应结束后，弃去反应液，用配制好的洗液手工或在自动洗板机洗涤6XImin ；· 3、加入酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体1:500倍稀释，向每一反应孔中加入100 μ 1，放入37°C恒温箱中孵育15min ；
4、洗板样本反应结束后，弃去反应液，用配制好的洗液手工或在自动洗板机洗涤6XImin ；
5、加入底物检测向每一反应孔中加入配制好的发光底物A和B各50μ1，震荡混匀后，室温5min用发光仪检测结果，以校准品浓度为横坐标，对应发光值为纵坐标，绘制出校准品线性回归曲线，按曲线方程计算待测样本的浓度值。当计算出的浓度值小于lAU/ml时，标本呈阴性，说明诊断PBC的可能性比较小。当计算出的浓度值大于或等于lAU/ml时，标本呈阳性，说明诊断PBC的可能性比较大。
权利要求
1.一种检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，包括固相载体,酶标二抗工作液，阳性对照品，阴性对照品，样品稀释液，底物和洗涤液，其特征在于所述固相载体为固定有抗AMA-M2型抗体靶抗原的微孔板、磁微粒或磁球；所述酶标二抗工作液中所用二抗为鼠或兔或羊抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，所用二抗标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，吖啶酯、异鲁米诺或稀土元素。
2.根据权利要求I所述的检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，其特征在于所述样品稀释液由浓度小于10%的氯化钠缓冲液和小于1%保护蛋白组成。
3.根据权利要求2所述的检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，其特征在于所述保护蛋白为酪蛋白、白蛋白、蛋白胨、明胶、动物血清或人血清。
4.根据权利要求I所述的检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，其特征在于所述IE抗原为天然抗原、重组抗原、合成肽、HepG2细胞、Hep2细胞、Hela细胞或细胞裂解抗原。
5.根据权利要求I所述的检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，其特征在于所述底物为发光底物或显色底物。
6.根据权利要求5所述的检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，其特征在于所述发光底物为发光底物A和发光底物B，所述发光底物A由O. 2M Tris-HCl、O. 15mM Luminol、0. 59mM羟基香豆素、O. 35mM没食子酸组成；所述发光底物B由O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM 维生素 C 组成。
7.如权利要求I所述试剂盒的检测方法，其特征在于包括下述步骤 第一步，将待检测血清用样品稀释液稀释成血清样本，分别将阳性对照品、阴性对照品、校准品和血清样本加入到固相载体中孵育； 第二步，样本反应结束后，弃去反应液，用洗涤液洗板； 第三步，将酶标二抗工作液加入每一反应孔中，孵育； 第四步，反应结束后，弃去反应液，用洗涤液洗板； 第五步，加入底物检测，仪器检测信号值来定性或定量判断样本中被测抗体，或通过免疫层析或免疫渗滤法肉眼或仪器读取样本定性或定量结果。
全文摘要
本发明公开了一种检测自身免疫性肝病相关抗体抗AMA-M2型抗体的试剂盒，本发明还公开了使用该试剂盒定量和定性检测抗AMA-M2抗体的方法。通过使样品与连有标记物的IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA与检测抗体所对应的特异性抗原结合，加入发光系统或显色系统或激发光系统底物后，读取待检样品信号值，计算定量或定性结果或通过免疫层析或免疫渗滤法肉眼或仪器读取样本定量或定性结果，从而准确诊断出自身免疫性肝病的类型及严重程度，指导医生用药，该方法具有灵敏度高、特异性强、准确性好，适用于半自动或全自动检测系统或肉眼判读。
文档编号G01N21/76GK102955028SQ20121019022
公开日2013年3月6日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者吴学炜, 何丽, 张学东, 于林, 杨皓宇, 鲁清月, 付光宇, 马建军, 刘功成, 项立红, 渠海, 李桂林 申请人:郑州安图绿科生物工程有限公司