专利名称：一种阳离子型壳聚糖键合修饰的毛细管电色谱开管柱及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种阳离子型壳聚糖键合修饰的毛细管电色谱开管柱及其制备方法， 属于毛细管电色谱技术领域。
背景技术：
毛细管电色谱(capillary electrochromatography)是近年发展起来的一种高 效、快速的新型色谱微分离技术。毛细管开管柱作为毛细管色谱柱主要类型之一，是毛细管 电色谱分离分析技术的重要组成。对比毛细管填充柱和毛细管整体柱，毛细管开管柱具有 制备简单，无须塞端子，柱效高，快速分离等特点，越来越受到色谱工作者的重视。在碱性蛋白或生物碱分析中，石英毛细管内壁含有大量负电荷的硅羟基，碱性化 合物和蛋白质会与管壁会发生非特异性吸附，使得这类物质分离时产生峰拖尾、峰缺失、重 现性差等现象。目前，已有多种高分子化合物用于修饰开管柱管内壁，如聚乙二醇、聚乙烯 醇、聚丙烯酰胺、聚多烯胺、葡聚糖和纤维素等。其中糖类化合物，因其分子的亲水性和易 成膜，作为管壁的修饰试剂倍受“青睐”。壳聚糖是自然界中唯一带有氨基的碱性天然多 糖，在PH小于6.0的体系中带正电荷，通过静电作用而直接吸附于管壁上形成涂层。根据 文献报道，Huang 等(Talanta 2006，69，463-468)和 Fu 等(Electrophoresis 2007,28, 1958-1963)分别将壳聚糖和羧甲基壳聚糖物理吸附于管壁，操作简易，但由于物理吸附涂 层稳定性较差，适用PH范围较小(pH3. 0-5. 5)，在流动相运动过程中会发生流失，柱使用寿 命有限，流失的多糖甚至会干扰检测。目前，基于管壁硅烷化、管壁醛基修饰、链端壳聚糖胺 醛缩合改性、壳聚糖分子链交联等化学反应制备的阳离子型壳聚糖键合修饰的毛细管电色 谱开管柱尚未见其他研究文献或专利报道。

发明内容
为了克服现有物理吸附或静电电荷吸附修饰存在的稳定性差的不足，本发明提供 了一种阳离子型壳聚糖化学键合修饰的毛细管电色谱开管柱及制备方法，通过采用毛细管 内表面硅烷化、管壁醛基修饰、壳聚糖胺醛缩聚键合、壳聚糖分子链交联聚合等反应。即首 先通过硅烷化反应在管壁内表面引入可反应性的氨基，然后使氨基与双官能团试剂戊二醛 反应进一步引入醛基；再以醛基为接点，与羧甲基壳聚糖分子侧链上的氨基反应，将壳聚糖 分子化学键合于毛细管表面；最后应用戊二醛进一步对壳聚糖分子链之间进行交联聚合， 从而形成稳定的毛细管管壁-阳离子壳聚糖化学键合层。阳离子壳聚糖键合层以化学键形 式存在，稳定性高、重现性好。所制得的阳离子聚糖化学键合毛细管电色谱开管柱同时具有 碱性氨基和酸性羧基，具有阴极/阳极电渗流两种作用，应用于碱性蛋白质、罂粟碱等生物 碱分离，具有良好的效果。本发明采用的技术方案一种阳离子型壳聚糖化学键合修饰的毛细管电色谱开管 柱，所述开管柱的内表面化学键合有阳离子型壳聚糖，阳离子型壳聚糖为羧甲基壳聚糖。
所述阳离子型壳聚糖化学键合修饰的毛细管电色谱开管柱的制备方法包括以下 步骤首先将30%氨丙基乙氧硅烷的甲苯溶液注入活化的毛细管，iio°c反应1 实现毛细 管内壁硅烷化。然后应用10%戊二醛(pH 8. 0，50mmol/L磷酸盐缓冲液配制)与硅烷化后的 毛细管温室反应lh，完成管壁的醛基修饰反应，将醛基固定于毛细管内壁；将0.2%-0.8% 壳聚糖溶液注入醛基修饰的毛细管内60°C反应lh，完成管壁表面上醛基与壳聚糖分子侧 链的氨基发生缩合反应。最后用氮气吹出残留的壳聚糖溶液，继续注入10%戊二醛室温继 续反应lh，使壳聚糖分子链之间发生稳定的交联反应，反应后用甲醇-水冲洗，除去残留的 戊二醛试剂，即制备阳离子壳聚糖高聚物层修饰的毛细管电色谱开管柱。所用的阳离子壳 聚糖为羧甲基壳聚糖。本发明的优点本发明采用毛细管内表面硅烷化、管壁醛基修饰、链端壳聚糖胺醛缩合改性、壳聚 糖分子链交联等反应，将羧甲基壳聚糖分子通过化学反应键合到毛细管上，不是采用常规 的物理吸附，所制备的开管柱聚合层具有很高的化学稳定性，重现性好，电渗流在0. lmol/L NaOH, 0. lmol/L HCl，甲醇和乙腈洗脱液连续冲洗30min，偏差小于2%，特别对于NaOH稳定 高，电渗流测定RSD远小于文献物理吸附法中的12. 5%水平。同时，本发明的羧甲基壳聚糖 修饰柱，阳离子型羧甲基壳聚糖通过屏蔽石英表面的大部分硅羟基，避免了碱性化合物尤 其是大分子蛋白质的在分析过程的吸附作用，而且柱表面所键合的羧甲基壳聚糖同时具有 碱性氨基和酸性羧基，具有阴极/阳极电渗流两种作用，羧基提供阴极电渗流作用，氨基提 供阳极电渗流作用，在不同的PH值的缓冲溶液中产生两个方向的电渗流，可在阳极或阴极 电渗流模式下分离碱性化合物而不产生吸收峰的拖尾现象，具有广阔的开发应用前景。


图1 羧甲基壳聚糖修饰开管柱于阳极电渗流模式下碱性蛋白质分离图1.胰蛋白酶，2.核糖核酸酶，3.细胞色素C，4.溶菌酶.图2 羧甲基壳聚糖修饰开管柱于阴极电渗流模式下分离生物碱分离图1.吗啡，2.啼吧因，3.那可叮，4.婴粟碱.
具体实施例方式实施例1 化学键合法制备羧甲基壳聚糖修饰的开管柱将30% Y-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液灌注于活化后的毛细管中，两端密 封，在气相色谱炉中110°c加热对小时，取出冷至室温后用甲苯、甲醇分别冲洗0.5小时，氮 气吹干。应用10%戊二醛(pH 8.0 50mM磷酸盐缓冲液配制)冲洗硅烷硅化后的毛细管柱 1小时，随后用去离子水冲洗至中性，完成毛细管的醛基修饰。继续应用0. 2% -0. 8%羧甲 基壳聚糖溶液注入醛基修饰的毛细管，两端封口，60°C水浴1小时，应用氮气吹出多余的溶 液；最后再用10%戊二醛(pH 8.0 50mM磷酸盐缓冲液)室温反应1小时，反应后用去离子 水洗至中性，氮气室温吹干，即制得阳离子羧甲基壳聚糖高聚物修饰的毛细管电色谱开管 柱。该开管柱内表面键合有阳离子羧甲基壳聚糖。实施例2 羧甲基壳聚糖修饰开管柱于阳极电渗流模式下分离碱性蛋白质应用羧甲基壳聚糖修饰开管柱(内径50mm，总长60. 0cm，有效长度40. Ocm)，以
4PH 3. 020mM磷酸盐为缓冲液为流动相，分离电压+15kV，在CEC阳极电渗流模式下，对胰蛋 白酶、核糖核酸酶、细胞色素和溶菌酶四种碱性蛋白质进行点色谱分离-紫外检测，蛋白质 在上述条件下实现了完全分离，如图2所示，洗脱峰依次为1.胰蛋白酶，2.核糖核酸酶， 3.细胞色素C，4.溶菌酶，减少了蛋白吸附引起的拖尾现象。实施例4 羧甲基壳聚糖修饰开管柱于阴极电渗流模式下分离生物碱应用羧甲基壳聚糖修饰开管柱(内径50mm，总长60. 0cm，有效长度40. Ocm)，以pH 6. 050mM磷酸盐为缓冲液为流动相，分离电压+15kV，在CEC阴极电渗流模式下，对吗啡、啼 吧因、那可叮和婴粟碱四种碱性蛋白质进行分离，如图3所示。洗脱峰依次为1.吗啡，2.啼 吧因，3.那可叮，4.婴粟碱。生物碱在上述条件下实现了基线分离。
权利要求
1.一种阳离子型壳聚糖键合修饰的毛细管电色谱开管柱，其特征是所述开管柱采用 毛细管内表面硅烷化、管壁醛基修饰、壳聚糖胺醛缩聚键合、壳聚糖分子间交联等反应制 备，所述开管柱内表面键合有阳离子型壳聚糖，所用的阳离子型壳聚糖是羧甲基壳聚糖。
2.权利要求1所述的阳离子型壳聚糖键合修饰的毛细管电色谱开管柱，其特征在于所 述阳离子壳聚糖先与石英毛细管内壁硅羟基通过含二醛基团的耦合试剂胺醛缩合反应，以 "-Si-O-CH2-OSi (OCH3) 2- (CH2)n_N(CH2)n_CN_壳聚糖”的化学键合形式键合；所述壳聚糖键合 后分子链间继续发生交联反应，形成稳定的永久性壳聚糖聚合层。
3.权利要求1所述的阳离子壳聚糖键合修饰的毛细管电色谱开管柱，其特征在于开管 柱同时具有碱性氨基和酸性羧基，具有阴极/阳极电渗流两种作用，所键合的阳离子壳聚 糖中羧基提供阴极电渗流作用，氨基提供阳极电渗流作用。
4.权利要求1所述的阳离子壳聚糖键合修饰的毛细管电色谱开管柱的制备方法，其 特征是包括以下步骤首先将30%氨丙基乙氧硅烷的甲苯溶液注入活化的毛细管，110°C 反应12h实现毛细管内壁硅烷化。然后应用10%戊二醛(pH 8.0，50mmol/L磷酸盐缓冲 液配制)与硅烷化后的毛细管温室反应lh，完成管壁的醛基修饰反应，将醛基固定于毛细 管内壁；将0. 2% -0. 8%壳聚糖溶液注入醛基修饰的毛细管内60°C反应lh，完成管壁表面 上醛基与壳聚糖分子侧链的氨基发生缩合反应。最后用氮气吹出残留的壳聚糖溶液，继续 注入10%戊二醛室温继续反应lh，使壳聚糖分子链之间发生稳定的交联反应，反应后用甲 醇-水冲洗，除去残留的戊二醛试剂，即制备阳离子壳聚糖高聚物层修饰的毛细管电色谱 开管柱。所用的阳离子壳聚糖为羧甲基壳聚糖。
全文摘要
本发明公开了一种阳离子型壳聚糖键合修饰的毛细管电色谱开管柱及其制备方法。该开管柱采用毛细管内表面硅烷化、管壁醛基修饰、壳聚糖胺醛缩聚键合、壳聚糖分子间交联等修饰技术制得。所制备的毛细管开管柱内部键合有阳离子型壳聚糖，所用的阳离子型壳聚糖是羧甲基壳聚糖。本发明所提供的阳离子型壳聚糖修饰改性的毛细管开管柱功能涂层化学键合牢固、性质稳定，并具备阴极/阳极电渗流两种作用模式，对碱性蛋白分子和活性生物碱具有良好的分离效果，重现性好，适用于正电荷型物质的毛细管电色谱微分离分析。
文档编号G01N30/60GK102072944SQ20101050204
公开日2011年5月25日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者周孙英, 林旭聪, 谢增鸿 申请人:福州大学