专利名称：利用免疫层析技术联合检测多种具有相似分子结构的有机化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及应用免疫层析技术区分检测两种及两种以上具有相似分子结构有机化合物的方法。
背景技术：
免疫层析技术是上世纪80年代初期的一种简便快速检测技术，由该技术制成的免疫层析试纸条通常由以下几部分组成底板及粘贴在底板上的样品垫、结合垫、纤维素膜、吸收垫等。由于该技术具有使用方便、快捷等特点，尤其适用于大批量样品的快速筛查，已经广泛应用于蛋白质、微生物、小分子(有机化合物)检测领域。有机化合物(如抗生素)具有分子量小、分子结构简单，抗原位点少的特点，所以在用免疫学方法对这些分子进行检测时无法采用夹心法进行检测，只能采用竞争法进行检测。原材料的优劣、特别是抗原、抗体/受体质量的好坏将直接关系到用这些材料制备出来的免疫层析试纸条的灵敏性和特异性。而由于某些有机化合物的分子结构很相似，用现有生物技术制备出的有机化合物的抗体或受体，往往与两种或两种以上分子结构相似的有机化合物有交叉反应，用这种抗体/受体制成的免疫层析试纸条难以对分子结构接近的有机化合物进行区分检测。以克伦特罗和沙丁胺醇为例，这两种物质的分子结构非常相似，现有抗体制备技术制备出的克伦特罗抗体，除了能与克伦特罗发生反应外，还易与沙丁胺醇或沙丁胺醇-载体蛋白偶联物发生反应，如果将此抗体机械地用于制备克伦特罗和沙丁胺醇联检免疫层析试纸条在检测沙丁胺醇易出现假阴性，不能对分子结构相似的有机化合物进行区分检测。

发明内容
本发明旨在提供一种可区分检测两种及两种以上分子结构相似有机化合物的免疫层析试纸条的制备方法。I)本发明的一个技术方案是(为了便于说明，假定A和B是两种分子结构相似的有机化合物)提供一种免疫层析试纸条，该试纸条由底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、标记物结合垫、免疫层析复合膜、吸水纸，标记物结合垫上含有标记物-A的抗体/受体复合物、标记物-B的抗体/受体复合物。如上所述的试纸条，其特征是在免疫层析复合膜上分别设有A检测区、B检测区，分别包被有A-载体蛋白偶联物、B-载体蛋白偶联物，A检测区和B检测区之间设有一个阻隔区。如上所述的试纸条，其特征是若A的抗体/受体易于与B-载体蛋白偶联物发生交叉反应，则A检测区靠近样品垫一端、B检测区远离样品垫，A检测区和B检测区之间的阻隔区包被能捕获标记物-A的抗体/受体复合物的物质,能够捕获没有被A检测区捕获的标记物-A的抗体/受体复合物。2)为了实现上述目的，本发明的另一个技术方案是(为了便于说明，假定A和B是两种分子结构相似的有机化合物)提供一种检测装置，包括试纸条和反应杯两部分试纸条包括底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、免疫层析复合膜、吸水纸；反应杯内含有标记物-A的抗体/受体复合物、标记物-B的抗体/受体复合物。如上所述的试纸条，其特征是在免疫层析复合膜上分别设有A检测区、B检测区，分别包被有A-载体蛋白偶联物、B-载体蛋白偶联物，A检测区和B检测区之间设有一个阻隔区。如上所述的试纸条，其特征是若A的抗体/受体易于与B-载体蛋白偶联物发生交叉反应，则A检测区靠近样品垫一端、B检测区远离样品垫，A检测区和B检测区之间的阻隔区包被能捕获标记物-A的抗体/受体复合物的物质,能够捕获没有被A检测区捕获的标记物-A的抗体/受体复合物。本发明在免疫层析膜的两个检测区之间增加一个阻断区，阻止了与前一检测区反应的标记物-抗体/受体复合物进入下一检测区进行交叉反应而导致的假阴性的发生，实现了用同一试纸条对两种或两种以上结构相似有机化合物的区分检测。与现有技术相比，本方法在检测分子结构相似有机化合物方面具有特异性更强的特点，实现了分子结构相似有机化合物的联合检测，既降低了检测成本，又缩短了检测时间。


下面结合附图对本发明做进一步说明。图1是本发明中有标记物结合垫的免疫层析试纸条结构示意图。图2是本发明中无标记物结合垫的免疫层析试纸条结构示意图。图中1:样品塾；2 :免疫层析复合I旲；3 :A检测区；4 :阻断区；5 :B检测区；6 :吸水纸；7 :标记物结合垫。
具体实施例方式尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。实施列I试纸条+反应杯模式联检试纸条的制备(瘦肉精三联检)I)试纸条的制备样品垫的制备将纤维素膜剪成1. 5 X 30cm规格的条带，备用；免疫层析复合膜的制备将硝酸纤维素膜剪成2. 5 X 30cm规格的条带，在NC膜上依次(自样品垫到吸水纸方向)喷涂莱克多巴胺-OVA偶联物(lmg/ml)、克伦特罗-BSA偶联物(lmg/ml)、抗克伦特罗抗体的抗体(10mg/ml)、沙丁胺醇-BSA偶联物(lmg/ml),室温晾干;吸水纸的制备将吸水纸裁成3. 5 X 30cm的条带，备用；试纸条的组装将吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫依次贴在PVC底板上，彼此之间有2_的搭接，随后切成5_宽的试纸条，2-8°C干燥保存。2)反应杯的制备按照100 U L/孔的量，往96孔微孔板中加入胶体金标记的沙丁胺醇抗体、胶体金标记的莱克多巴胺抗体、胶体金标记的克伦特罗抗体混合液；冷冻干燥孔内的胶体金标记抗体；将冻干后的胶体金标记抗体置于干燥环境中保存。实施例2单一试纸条模式联检试纸条的制备(瘦肉精三联检)I)试纸条的制备样品垫的制备将纤维素膜剪成1. 5 X 30cm规格的条带，备用；标记物结合垫的制备按照10 U L/cm的量往玻璃纤维素膜上喷涂胶体金标记的沙丁胺醇抗体、胶体金标记的莱克多巴胺抗体、胶体金标记的克伦特罗抗体混合液，将喷涂好的玻璃纤维素膜置于室温干燥，备用。免疫层析复合膜的制备免疫层析复合膜的制备将硝酸纤维素膜剪成2. 5X30cm规格的条带，在NC膜上依次(自样品垫到吸水纸方向)包被莱克多巴胺-BSA偶联物(lmg/ml)、克伦特罗-BSA偶联物(lmg/ml)、抗克伦特罗抗体的抗体(10mg/ml)、沙丁胺醇-OVA偶联物(lmg/ml),室温晾干；吸水纸的制备将吸水纸裁成3. 5 X 30cm的条带，备用；试纸条的组装将吸收垫、免疫层系复合膜、标记物结合垫、样品垫依次贴在PVC底板上，彼此之间有2_的搭接，并切成5_宽的试纸条，2-8 °C干燥保存。实施例3沙丁胺醇、克伦特罗联检试纸条的制备I)试纸条的制备样品垫的制备将纤维素膜剪成1. 5 X 30cm规格的条带，备用；标记物结合垫的制备按照10 U L/cm的量往玻璃纤维素膜上喷涂胶体金标记的沙丁胺醇抗体、胶体金标记的克伦特罗抗体混合液，将喷涂好的玻璃纤维素膜置于室温干燥，备用。免疫层析复合膜的制备免疫层析复合膜的制备将硝酸纤维素膜剪成
2.5X 30cm规格的条带，在NC膜上依次(自样品垫到吸水纸方向)包被克伦特罗-BSA偶联物(lmg/ml)、抗克伦特罗抗体的抗体(10mg/ml)、沙丁胺醇-BSA偶联物(lmg/ml),室温晾干;吸水纸的制备将吸水纸裁成3. 5 X 30cm的条带，备用；试纸条的组装将吸收垫、免疫层系复合膜、标记物结合垫、样品垫依次贴在PVC底板上，彼此之间有2_的搭接，并切成5_宽的试纸条，2-8 °C干燥保存。实施例4使用方法步骤一前处理I)检测尿样直接检测。2)检测饲料样品中瘦肉精残留用乳钵研碎饲料,称Ig研碎的饲料样品加入IOml 0. OlM的盐酸,充分混合5min ；调节PH值至6. 5-8. O之间；3500rpm离心5min，转移出上清液，待检。
3)低脂肪含量的肝、肌肉、组织5g粉碎的样品与25ml 50mM盐酸混合,均质15min ;取6g均质物，10_15°C离心15min,4000rpm或更高的转速；转移出上清液至另一个离心瓶中，加300 ii L IM NaOH,混合15min ;加入4ml 500mM磷酸二氢钾缓冲液(pH3. 0)，简单混合并在4°C保存至少1. 5小时或过夜。10-15°C，4000g离心15min。分离上清液，平衡至室温，待检。4)高脂肪肉类组织取5g样品到离心管中，加入 25ml 50mM Tris-HCl (pH 8. 5),振荡 30min ;加入 15ml庚烷振荡5min ；4000g离心15min ;用巴斯德吸管除去上面的庚烷层及中间薄薄的脂肪层；再用15ml庚烷重复步骤振荡、离心及吸去脂肪层操作；向均质的肉液中加入0. 5ml 6M的盐酸，振荡I小时(或是振荡过夜)；4000g离心15min ;移取上清液到另一个离心管中，加入300 u I IMNaOH,混合15min ;加入4ml 500mM KH2PO4溶液(pH3)，简单混合并在4°C存放至少1. 5小时或过夜；4000g离心15min ;移取上清液，平衡至室温；待检。步骤二 检测方法一取200 ii L样品至反应杯中，40°C充分反应3min后,将试纸条(无标记物结合垫)插入反应杯内，继续反应5min,读取结果。方法二 取样品80 ii L于试纸条(带标记物结合垫)样品垫上,室温反应5min,读取结果。
权利要求
1.一种联合检测两种或两种以上具有相似分子结构有机化合物(以下各权项均假定A 和B是两种分子结构相似的有机化合物)的免疫层析装置，包括底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、标记物结合垫、免疫层析复合膜、吸水纸，标记物结合垫上含有标记物-A的抗体/受体复合物、标记物-B的抗体/受体复合物，免疫层析复合膜上设有A检测区、B检测区，在A检测区和B检测区之间设有一个阻断区。
2.如权利I所述免疫层析装置，还可以是由免疫层析试纸条和反应杯两部分组成免疫层析试纸条包括底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、免疫层析复合膜、吸水纸，免疫层析复合膜上设有A检测区、B检测区，在A检测区和B检测区之间设有一个阻断区；反应杯内含有标记物-A的抗体/受体复合物、标记物-B的抗体/受体复合物。
3.如权利I和权利2所述的免疫层析复合膜，其特征是在免疫层析复合膜上分别设有 A检测区、B检测区，分别包被有A-载体蛋白偶联物、B-载体蛋白偶联物；在A检测区和B 检测区之间设有一个阻断区。
4.如权利I和权利2所述的免疫层析复合膜，其特征是若A的抗体/受体易于与B-载体蛋白偶联物发生交叉反应，则A检测区靠近样品垫一端、B检测区远离样品垫，A检测区和 B检测区之间的阻隔区包被能捕获标记物-A的抗体/受体复合物的物质，能够捕获没有被 A检测区捕获的标记物-A的抗体/受体复合物。
全文摘要
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及应用免疫层析技术区分检测两种及两种以上具有相似分子结构有机化合物的方法。本发明在免疫层析膜的两个检测区之间增加一个阻断区，阻止了与前一检测区反应的标记物-抗体/受体复合物进入下一检测区出现交叉反应而导致的假阴性的发生，实现了用同一试纸条对两种或两种以上结构相似有机化合物的区分检测。与现有技术相比，本方法在检测分子结构相似有机化合物方面具有特异性更强的特点，实现了分子结构相似有机化合物的联合检测，既降低了检测成本，又缩短了检测时间。
文档编号G01N33/544GK102998446SQ20121054776
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者朱海, 王西丽, 李细清, 李金峰 申请人:深圳市易瑞生物技术有限公司