专利名称：分离培养新生鼠皮层神经细胞记录t型钙通道电流的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别涉及一种分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法。
背景技术：
T型钙离子通道主要存在于心脏、神经组织、肾脏、平滑肌、精子以及多种内分泌器官。T型钙流存在于心脏浦肯野纤维细胞、窦房结、潜在起搏细胞上，有助于起搏细胞的复极，动作电位的始动，窦房结自律性，在起搏细胞动作电位平台期上发挥着重要的作用。同时，T型钙通道也参与了肌肉兴奋-收缩偶联，内分泌腺的兴奋-分泌偶联及细胞的调控过程。研究证明，T型钙通道不仅是治疗肾性高血压和心律失常，也是治疗意识丧失型癫痫及神经性疼痛的重要药物靶点。此外，细胞内钙超载与房颤、心衰、偏头痛、阿尔茨海默病、睡眠障碍等发病有关。因此，观察药物对T型钙通道的作用已成为协助评价治疗心血管及神经系统疾病药物药效的重要手段。膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”，是研究离子通道的最重要的技术。传统的胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基维持细胞生长虽简便易行，但存在接种的细胞贴壁不良，生长时间较短及神经元纯度欠佳等问题。细胞外灌流液中直接去除了钠离子，造成实验过程中细胞存活时间明显缩短等缺陷，需要进行改良剂提高，从而确保实验的成功率，稳定性和重复性。

发明内容
本发明的目的，在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种易操作、能提高神经细胞收获率和纯度的分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法。本发明的目的是这样实现的一种分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，包括以下步骤A、选取新生24h的SD大鼠，处死并在无菌条件下取出全脑后，用解剖液清洗数次；B、置于冰浴中解剖，小心分离得到皮层，仔细剔除皮层上的微细血管后，充分剪碎皮层组织；C、将剪碎的皮层组织置于广口瓶内，加入同体积的O. 25%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，置于5%二氧化碳、37°C培养箱内消化18-25分钟；D、充分消化后，加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻吹打数分钟至液体成迷糊状即停止吹打，用70微米网筛过滤，收集细胞悬液；E、将细胞悬液以IOOOrpm离心5分钟，弃上清，根据计数结果，调整细胞密度，接种于放置了多聚赖氨酸包被处理的盖玻片培养皿，用添加了 B27的Neurobasal培养液，置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养7-21天，得到生长有皮层神经细胞的盖玻片；
F、将生长有皮层神经细胞的盖玻片加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，用细胞外灌流液灌流清洗细胞，流速保持1-1. 5毫升/分钟；选择生长饱满的细胞进行膜片钳实验，采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录T型钙通道电流；实验在22-25°C下进行，使用的玻璃电极充满细胞内灌流液，电阻为3-5兆欧。上述分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其中，步骤A中所述的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素及链霉素、5毫升浓度为I摩尔的氯化镁、3. 5毫升浓度为I摩尔的HEPES和5毫升浓度为200毫摩尔的L-glutamine配制而成，经过滤且高压灭菌后4°C冷藏备用。
上述分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其中，步骤F中所述的细胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7. 4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，CsCl的浓度为5. 4mM,MgCl2的浓度为1禮，CaCl2的浓度为I. 8mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为10mM，溶液的渗透压为290m0sm ；上述分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其中，步骤F中所述的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl2、镁-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至7. 2，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaCl2的浓度为1禮，镁-三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为llmM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为 310m0Sm。上述分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其中，步骤E中所述的置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养7-21天的具体做法是，每六天换培养液一次，每次换半量。上述分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其中，步骤F中所述的电压钳模式为，钳制电压-90毫伏，施予50毫秒的-40毫伏预脉冲后给予300毫秒、O毫伏去极化脉冲。本发明分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法的优点在于I、采用无血清培养基培养的方法，收获的细胞产量增加，接种后细胞贴壁良好，生长时间显著延长以及后期神经元纯度高；2、采用低浓度胰蛋白酶溶液，长时间消化，均匀振摇分散的方法，消化过程中细胞损伤小，减少了分离过程中的化学和机械损伤。3、取出全脑后，分离得到皮层，剔除微细血管等取材过程，均在冰浴上进行，充分保证了细胞的活力。4、Neurobasal培养液中添加了 B27，以抑制胶质细胞的增殖，同时又保证了神经细胞的健康生长所需营养因子的供给。5、细胞外灌流液中加入了正常浓度的钠离子，维持了细胞内胎的离子平衡，有效延长了实验中细胞的存活时间，也保证了细胞状态的稳定性。总之，本发明中稳定培养的新生鼠皮层神经细胞具有正常的离子通道的功能，适用于膜片钳技术对其生理特性及药理特性的研究，本实验操作易于掌握，是一种简单有效的稳定培养分离新生鼠皮层神经细胞的方法。
具体实施例方式本发明分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，包括以下步骤一、新生鼠皮层神经细胞的分离与培养选取新生24h的SD大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮，颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，解剖液清洗数次。小心分离皮层，置于冰浴中解剖，仔细剔除微细血管，充分剪碎组织；加入同体积的O. 25%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，5% 二氧化碳，37摄氏度培养箱内消化20分钟左右，期间轻摇数次；充分消化后，加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻吹打数分钟至液体成糊状即停止吹打,随后用70微米网筛过滤，收集细胞悬液；以IOOOrpm离心数分钟，弃上清；根据计数结果，调整细胞密度，接种于放置了多聚赖氨酸包被处理的盖破片的培养皿，用添加了 B27的Neurobasal培养液,置于37度摄氏度,含5%二氧化碳培养箱中进行培养。每六天，换维 持培养液一次，每次换半量。二、T型钙通道电流的记录体外培养7-21天的神经细胞，可用于电生理实验。将生长有皮层神经细胞的盖玻片加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，细胞静置后沉底贴壁，细胞外灌流液灌流清洗细胞，流速保持1-1. 5毫升/分钟。选择边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的细胞进行膜片钳实验。所有实验在室温(22-25摄氏度)下进行。使用的玻璃电极在充满细胞内灌流液时的电阻约为3-5兆欧。采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录通道电流。记录T型钙通道电流时，钳制电压-90毫伏，施予100毫秒的-30毫伏去极化脉冲。本发明中所采用的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素或链霉素、5毫升浓度为I摩尔的氯化镁、3. 5毫升浓度为I摩尔的HEPES和5毫升浓度为200毫摩尔的L-glutamine配制而成，经过滤且高压灭菌后4°C冷藏备用。本发明中所采用的细胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2, CaCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7. 4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，CsCl的浓度为5. 4mM, MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为I. 8mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为10mM，溶液的渗透压为290m0sm.本发明中所采用的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl2、镁-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至7. 2，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaClJ^浓度为1禮，镁-三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为llmM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为310m0Sm。
权利要求
1.一种分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其特征在于，包括以下步骤 A、选取新生24h的SD大鼠，处死并在无菌条件下取出全脑后，用解剖液清洗数次； B、置于冰浴中解剖，小心分离得到皮层，仔细剔除皮层上的微细血管后，充分剪碎皮层组织； C、将剪碎的皮层组织置于广口瓶内，加入同体积的O.25%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，置于5%二氧化碳、37°C培养箱内消化18-25分钟； D、充分消化后，加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻吹打数分钟至液体成迷糊状即停止吹打，用70微米网筛过滤，收集细胞悬液； E、将细胞悬液以IOOOrpm离心5分钟，弃上清，根据计数结果，调整细胞密度，接种于放置了多聚赖氨酸包被处理的盖玻片培养皿，用添加了 B27的Neurobasal培养液，置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养7-21天，得到生长有皮层神经细胞的盖玻片； F、将生长有皮层神经细胞的盖玻片加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，用细胞外灌流液灌流清洗细胞，流速保持1-1. 5毫升/分钟；选择生长饱满的细胞进行膜片钳实验，采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录T型钙通道电流；实验在22-25°C下进行，使用的玻璃电极充满细胞内灌流液，电阻为3-5兆欧。
2.根据权利要求I所述的分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其特征在于步骤A中所述的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素及链霉素、5毫升浓度为I摩尔的氯化镁、3. 5毫升浓度为I摩尔的HEPES和5毫升浓度为200毫摩尔的L-glutamine配制而成，经过滤且高压灭菌后4°C冷藏备用。
3.根据权利要求I所述的分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其特征在于步骤F中所述的细胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2, CaCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7. 4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，CsCl的浓度为5. 4mM,MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为I. 8mM，4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为10mM，溶液的渗透压为290m0sm。
4.根据权利要求I所述的分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其特征在于；步骤F中所述的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl2、镁-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至7. 2，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaClJ^浓度为1禮，镁-三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为llmM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为310m0Sm。
5.根据权利要求I所述的分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其特征在于步骤E中所述的置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养7-21天的具体做法是，每六天换培养液一次，每次换半量。
6.根据权利要求I所述的分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其特征在于步骤F中所述的电压钳模式为，钳制电压-90毫伏，施予100毫秒的-30毫伏去极化脉冲。
全文摘要
本发明提供了一种分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，稳定培养的新生鼠皮层神经细胞具有正常的T型钙离子通道的功能，适用于膜片钳技术对其生理特性及药理特性的研究，本实验操作易于掌握，是一种简单有效的稳定培养分离新生鼠皮层神经细胞的方法。本发明中通过稳定培养分离的新生鼠皮层神经细胞，从而显著提高了实验的成功率，稳定性和可重复性。
文档编号G01N27/26GK102809596SQ201210299399
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者谈学海, 林佩元, 陈景才, 范柳 申请人:辉源生物科技(上海)有限公司