专利名称：大鼠促黄体生成素和催乳素的四氯二苯脲标记法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定大白鼠垂体分泌的促黄体生成素(rLH)和催乳素(rPRL)的标记方法。
在生殖生理和计划生育科研中，经常需要测定大白鼠垂体分泌的促黄体生成素(rLH)和催乳素(rPRL)，放射免疫测定的关键环节之一是标记抗原的制备，它要求标记物具有高纯度、高比活度，并且保持良好的免疫活性和稳定性。在国内尚未见报道rLH和rPRL的标记方法，国外对人生长激素等多肽激素的标记从60年代开始见诸报道，但多采用氯胺-T(Chloramine-T)法，这种方法，存在一些缺点，如需要较大剂量的碘化钠(Na125I)和氯胺T，需要加还原剂，标记率较低等。
本发明的目的是提供一种用碘量小，标记率高，不需要加还原剂，可获得免疫活性高，稳定性好的标记抗原大白鼠促黄体生成素(rLH)和催乳素(rPRL)的四氯二苯脲(Iodogen)标记法。
为此，本发明rLH和rPRL的Iodogen标记法如下所述先将氧化剂四氯二苯脲(Iodogen)溶于二氯甲烷中，浓度为0.4～0.6mg/μl，取其中40～60ml置于具盖反应管中，在15～20℃室温下干燥使溶剂挥发干，这样，可使氧化剂在反应管底部形成均匀的薄膜。标记用促黄体生成素(rLH)或催乳素(rPRL)10～20μg溶液，8～12μl及0.5M、PH7.2～7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)90～110ml，分别置于上述的具盖反应管中，然后加入0.4～0.6mCi的碘化钠溶液，连续搅拌7～10分钟，此时即把125碘标记到了激素酪氨酸残基的羟基上。最后加入150～250μl、0.05M、PH7.2～7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)静置4～6分钟后上柱。以30×1.0cm葡聚糖G100层析柱分离纯化，0.05M、PH7.2～7.6的PBS平衡并洗脱柱子，用自动收集器收集洗脱液，流速1ml/2分钟管，共收集30～40管，然后依次测定各管的放射性。标记产品(125I-rLH或125I-rPRL)为大分子物质，通过凝胶间隙向下速度较快，首先被淋洗下来，即在第9～11管出现标记激素峰，而小分子的无机碘在第19～21管出现，即游离峰。标记激素(产品)以0.1M、PH7.2～7.6含有0.4～0.6的牛血清白蛋白和0.1～0.3%的迭氮钠的PBS稀释一倍，存在2～5℃温度下存放备用。
经试验证实，本方法标记率达80%，放射化学纯度在90%以上，最大抗体结合在80%以上，而非特异性结合较低，为3%，贮存8周而无明显变化，适于放射免疫分析或放射受体测定。
本发明采用Iodogen方法标记大鼠rLH和rPRL，获得了纯度和比活度均较高的产品，而且激素旦白免疫活性损伤小，较为稳定，重复性好。此外，本方法用碘量小、标记率高，不需要加还原剂，就可获得免疫活性高、稳定性好的标记抗原。
实施例将Iodegen溶于二氯甲烷中，浓度为0.5mg/ml，取其中50ml置于3.6×1.2cm的具盖聚丙管中，在20℃温度使溶液挥发干。标记用rLH或rPRL15μg溶液10μl及0.5M、PH7.4的PBS100μl，分别置于上述的聚丙烯管中，然后加入0.5mCi的碘化钠溶液，连续搅拌8分钟，最后加入200μl、0.05M、PH7.4的PBS静置5分钟后上柱，以30×1.0cm葡聚糖G100层析柱分离，0.05M、PH7，4的PBS平衡，采用BS-100A自动收集器收集洗脱液，以1ml/2分钟/管的流速收集30管，然后依次测定各管的放射性。
权利要求
1.一种大鼠促黄体生成素和催乳素的四氯二苯脲标记法，其特征在于先将氧化剂四氯二苯脲溶于二氯甲烷中，浓度为0.4～0.6mg/ml，取其中40～60μl置于具盖反应管中，在15～20℃室温下干燥，标记用促黄体生成素或催乳素10～20μg溶液8～12μl及0.5M、PH7.2～7.6的磷酸盐缓冲溶液90～110μl，分别置于上述的盖反应管中，然后加入0.5～0.6mCi的碘化钠溶液，连续搅拌7～10分钟，最后加入150～250μl、0.05M、7.2～7.6的磷酸盐缓冲溶液，静置3～5分钟后上柱，以30×1.0cm葡聚糖G100层析柱分离，0.05M、PH7.2～7.6磷酸盐缓冲溶液平衡并洗脱柱子，用自动收集器收集洗脱液，流速1ml/2分钟/管，共收集30～40管，然后依次测定各管的放射性，标记激素以0.1M、PH7.2～7.6含有0.4～0.6%的牛血清白蛋白和0.1～0.3%的迭氮钠的磷酸盐缓冲溶液稀释一倍，在2～5℃温度下存放。
全文摘要
一种测定大鼠rLE和rPRL的Iodogen标记法。将Iodogen溶于CH
文档编号G01N33/534GK1063941SQ9110078
公开日1992年8月26日 申请日期1991年2月9日 优先权日1991年2月9日
发明者毛培忠, 李爱英, 胡白正, 王燕复 申请人:天津市计划生育研究所