专利名称：兔抗大沙鼠免疫血清的制作方法
技术领域：
本发明涉及 一 种生物制品，特别是兔抗大沙鼠免疫血清。
技术背景自1877年R.克劳斯发现血清学反应，1899年J.博尔代发现免疫学交叉反 应以来，利用这种抗原与抗体的特异性免疫学反应进行疾病的诊断、生物鉴定 的技术方法得到广泛的应用和飞速发展，但这一技术方法需要开发研制特异性 的抗血清或特异性的抗体，以此作为特异性诊断试剂。同时，这种制剂可作为 进行进一步免疫学检测，如酶标记、荧光标记、分子标记等的基础制剂。目前 国内和国际多家生物制剂公司开发出了较多的常规科学试验和医学检测用特异 性免疫血清，如羊抗人免疫血清、羊抗鼠免疫血清、兔抗人免疫血清、兔抗鼠 免疫血清等等。由于免疫学反应是一种种属特异性非常高的特异性反应，因此， 上述这些巿售的免疫血清制剂均有非常强的针对性，羊抗人或兔抗人的免疫血 清主要针对人类感染疾病的研究、诊断等，而羊抗鼠或兔抗鼠的免疫血清则主 要用于实验鼠类的疾病感染、模型和生物鉴定等的科学研究和实验室诊断。如 果用上述制剂检测和研究其它物种，则会由于种属差异性的原因造成免疫交叉 反应和非特异性等问题，引起研究结果和检测结果的偏差，如假阳性或假阴性 等。鉴于此，对于大沙鼠感染性疾病的研究就需要专门研制相应的抗血清。发明内容本发明的目的在于提供一种兔抗大沙鼠免疫血清，用于大沙鼠感染性疾病、 病原体和非致病性微生物感染的研究和实验室的特异性检测诊断，使用方便。本发明的目的是这样实现的 一种兔抗大沙鼠免疫血清，它是由下列两个 工艺步骤制得的a、大沙鼠血清IgG抗原的制备(l)釆集大沙鼠血液，静置 待血清析出后以至少2000转/分钟的离心速度用离心机分离获取大沙鼠血清； (2)再以至少5000转/分钟的离心速度用离心机去除步骤(1)大沙鼠血清中 的颗粒状物；(3)将上述离心后的血清与等量生理盐水混合，逐滴加入饱合硫 酸铵溶液至20%浓度，滴加时边加边摇，然后将其放置于4。C的冰箱内保持至少 20分钟，再以至少8000转/分钟的离心速度进行离心操作5-15分钟，去除血清 中的杂物及纤维蛋白；(4)取上清液再补加饱合硫酸铵至35%浓度，然后将其放 置于4T的冰箱内保持至少20分钟，再以至少8000转/分钟的离心速度进行离 心操作5-15分钟，弃上清液留取沉淀物，即为大沙鼠血清中的粗提IgG; (5) 将所述沉淀物重新用生理盐水溶解，重复(3 )和(4 )步骤进行进一步纯化；(6 ) 将纯化后的大沙鼠IgG用生理盐水溶解后，装入透析袋用0. 01M pH7. 2 PBS进 行透析过夜，透析后获得的大沙鼠IgG抗原置于-2(TC的冰箱内备用；b、兔抗 大沙鼠IgG抗体的制备(1)选取两只各2. 5公斤左右的健康新西兰实验兔备 用；(2)用lml注射器吸取由a步骤制得的大沙鼠IgG抗原lml，沿兔背脊柱两 侧行皮下多点注射进行初次免疫；(3)间隔半个月后进行第二次免疫，免疫量 及方法同上；(4)然后再每隔15天免疫一次，剂量及方法同上，共免疫四次； (5)末次免疫15天后，由股静脉釆集实验兔血液lmL,分离血清进行抗体检测， 检测方法为免疫环状沉淀试验和红细胞凝集试验；(6)当抗体滴度已达到环状 沉淀试验要求的1: 32时，则对实验兔进行腹腔加强免疫三天后进行颈动脉釆 血；(7)釆集的血液，静置待血清析出后至少2000转/分钟的离心速度进行离 心操作即可获得兔抗大沙鼠免疫血清。大沙鼠是新疆平原荒漠地区分布最广、数量最多的鼠类之一。不仅对野生 植被和农作物具有巨大的破坏性，而且其自身携带和传播的一些动物性疾病的 对广大人民群众的生命健康构成巨大威胁，如鼠疫、寄生病等。本发明兔抗大 沙鼠免疫血清将对研究大沙鼠感染性疾病、病原体和非致病性微生物起到重要 的作用。为制定有效的疾病预防措施提供科学依据。釆用本发明工艺步骤制得 的兔抗大沙鼠免疫血清可以用于大沙鼠感染性疾病、病原体和非致病性微生物 感染的研究和实验室的特异性检测诊断，也可用于以大沙鼠为模型的疾病研究， 并可作为与其它鼠种的进行特异性生物鉴定和鉴别诊断的免疫血清制剂。同时， 本制剂可作为进一步制备酶标记免疫血清、荧光标记免疫血清制剂的基础制剂， 广泛用于大沙鼠、相关疾病和生物鉴别的研究和生产活动中。本发明工艺步骤 简单，易于制造，使用方便。
具体实施方式
一种兔抗大沙鼠免疫血清，它是由下列两个工艺步骤制得的 a、大沙鼠血清IgG抗原的制备(1) 采集大沙鼠血液，静置待血清析出后以4000转/分钟的离心速度用 离心机分离获取大沙鼠血清；(2) 再以6000转/分钟的离心速度用离心机去除步骤(1)大沙鼠血清中 的颗粒状物；(3) 将上述离心后的血清与等量生理盐水混合，逐滴加入饱合硫酸铵溶液 至20%浓度，滴加时边加边摇，然后将其放置于4'C的冰箱内保持30分钟，再 以10000转/分钟的离心速度进行离心搡作10分钟，去除血清中的杂物及纤维 蛋白；(4) 取上清液再补加饱合硫酸铵至35%浓度，然后将其放置于4。C的冰箱 内保持30分钟，再以10000转/分钟的离心速度进行离心操作10分钟，弃上清
液留取沉淀物，即为大沙鼠血清中的粗提IgG;(5) 将所述沉淀物重新用生理盐水溶解，重复(3)和(4)步骤进行进一 步纯化；(6) 将纯化后的大沙鼠IgG用生理盐水溶解后，装入透析袋用0. 01MpH7.2 PBS进行透析过夜，其间至少换液三次以除去IgG中的NH/及S(V离子；透析后 获得的大沙鼠IgG抗原置于-2(TC的冰箱内备用。b、兔抗大沙鼠IgG抗体的制备(1) 选取两只各2. 5公斤的健康新西兰实验兔备用；(2) 用lml注射器吸取由a步骤制得的大沙鼠IgG抗原lml,沿兔背脊柱 两侧行皮下多点注射进行初次免疫；(3) 间隔半个月后进行第二次免疫，免疫量及方法同上；(4) 然后再每隔15天免疫一次，剂量及方法同上，共免疫四次；(5) 末次免疫15天后，由股静脉采集实验兔血液lmL分离血清进行抗体 检测，检测方法为免疫环状沉淀试验和红细胞凝集试验；(6) 若抗体滴度已达到环状沉淀试验要求的1: 32,则对实验兔进行腹腔 加强免疫三天后进行颈动脉采血，若抗体滴度未达到环状沉淀试验要求的1: 32, 则继续按步骤(4)进行免疫直至抗体达到上述标准后再进行颈动脉釆血；(7) 采集的血液，静置待血清析出后以4000转/分钟的离心速度进行离 心搡作获取血清，本血清即为兔抗大沙鼠免疫血清；(8) 用免疫环状沉淀试验和红细胞凝集试验检测抗体效价，按20mL/每袋 分装，置于-2(TC冰箱内保存。抗大沙鼠IgG免疫血清检测。1、 环状沉淀试验1) 将环状试验管排列到小试管架上并编号；2) 用移液器将大沙鼠IgG抗原置于环状试验管中，每管0.1ml;3) 将抗大沙鼠IgG免疫血清行1: 4、 1: 8、 1: 16、 1: 32、 1: 64稀释后，分别吸取各稀释度的抗大沙鼠二抗血清用移液器沿环状试验管壁缓慢加入到相 应小试管大沙鼠IgG抗原液上，每管O. lml;4) 静放l小时后观察结果；5) 阳性则在两液界面上出现环状沉淀带，阴性则不出现环状沉淀带；6) —般情况下，环状沉淀试验免疫效价在1: 32或1: 64为可使用效价。2、 红细胞凝集试验 双醛化血球制备1)用大三角烧瓶配制3. 8%的柠檬酸三钠抗凝液100ml,至冰箱冷却到4'C左右；2) 用大号釆血针颈静脉釆集新鲜绵羊血液150ml加入到已加好抗凝剂的三角烧瓶中，其间轻微摇动三角烧瓶以防血液凝固；3) 用100ml大号离心管将上述含绵羊红细胞溶液以3000转/分钟的离心速 度进行离心操作，20分钟后轻轻倒去上清液；4) 用O. 01M pH7. 2 PBS缓冲液清洗绵羊红细胞5遍以去除血液中的蛋白；5) 用1%戊二醛和洗净的绵羊血球混匀，边加戊二醛边摇动血球，血球戊二 醛溶液比例大约为l: 5左右，作用30分钟进行初步醛化；6) 将初步醛化后的绵羊红细胞再用0. 01M pH7. 2 PBS缓冲液洗绵羊红细胞3遍57) 将洗净的绵羊红细胞用0. 01M pH7. 2 PBS缓冲液配成10%绵羊红细胞溶 液与甲醛溶液混勾，甲醛溶液与绵羊红细胞溶液混合比例约为1: 5左右，混合 液在摇床上摇动过液；8) 将甲醛处理过的绵羊红细胞再用0. 01M pH7. 2 PBS缓冲液洗血球5遍； 单宁酸处理双醛化血球1)将双醛化处理的血球用0. 01M pH6. 4 PBS配成10%浓度与1/2万单宁酸 溶液等量混合，室温作用30分钟后用0. 01M pH5. 0 PBS洗血球3遍； 大沙鼠IgG抗原致敏血球的制备 1. 1大沙鼠IgG抗原致敏浓度的选择1. 1. 1将中号试管排在试管架上并编号，用0. 01M pH5.0 PBS将大沙鼠 IgG抗原稀释成l: 10、 1: 20、 1: 40、 1: 80、 1: 160、 1: 320等不同稀释度， 将经单宁酸处理的双醛化血球加入上述各管中，绵羊红细胞终浓度为5%，摇床 上摇动过液使大沙鼠IgG抗原致敏到绵羊红细胞上；1. 1. 2次日将上述不同稀释度大沙鼠IgG抗原致敏的绵羊血球，以4000转/分钟的离心速度进行离心操作后弃上清液；1. 1. 3各浓度致敏的绵羊红细胞血球用10%兔血清盐水饱和30分钟以减少血球非特异性凝集；1. 1. 4用1%兔血清盐水将上述各浓度致敏的绵羊红细胞血球洗5遍以去 除绵羊血球上多余的兔蛋白；1. 2将不同浓度致敏的血球配成ly。血球用于兔抗大沙鼠免疫血清的检测，选择凝集相好、敏感性高的为兔抗大沙鼠免疫血清检测的使用浓度。 结果兔抗大沙鼠免疫血清环状沉淀试验效价l: 32,血凝效价l: 8192。 兔抗大沙鼠免疫血清的用途1.建立ELISA检测大沙鼠鼠疫F1抗体的方法1. 1用0. 05M pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释兔抗大沙鼠免疫血清包被酶标板； 1. 2加入大沙鼠被检血清； 1. 3 37。C温箱反应l小时；1. 4冲洗反应板后，加HRP-F1(鼠疫Fl抗原酶标记物)，37。C温箱反应1 小时；1. 5冲洗反应板后，加显色液；1. 6出现颜色者为阳性，反之则为阴性。本发明兔抗大沙鼠免疫血清为国内外免疫学生物制剂的新品种。其发明工 艺中采用的大沙鼠血清IgG抗原为本发明的特有产品，并在生产工艺中采用了 双醛化方法处理血球技术，增加了试剂的稳定性，检测结果凝集相好且敏感性 高，便于结果观察，也弥补了一般检测试剂特异性高，敏感性差的不足。
权利要求
1、一种兔抗大沙鼠免疫血清，其特征在于它是由下列两个工艺步骤制得的a、大沙鼠血清IgG抗原的制备(1)采集大沙鼠血液，静置待血清析出后以至少2000转/分钟的离心速度用离心机分离获取大沙鼠血清；(2)再以至少5000转/分钟的离心速度用离心机去除步骤(1)大沙鼠血清中的颗粒状物；(3)将上述离心后的血清与等量生理盐水混合，逐滴加入饱合硫酸铵溶液至20％浓度，滴加时边加边摇，然后将其放置于4℃的冰箱内保持至少20分钟，再以至少8000转/分钟的离心速度进行离心操作5-15分钟，去除血清中的杂物及纤维蛋白；(4)取上清液再补加饱合硫酸铵至35％浓度，然后将其放置于4℃的冰箱内保持至少20分钟，再以至少8000转/分钟的离心速度进行离心操作5-15分钟，弃上清液留取沉淀物，即为大沙鼠血清中的粗提IgG；(5)将所述沉淀物重新用生理盐水溶解，重复(3)和(4)步骤进行进一步纯化；(6)将纯化后的大沙鼠IgG用生理盐水溶解后，装入透析袋用0.01M pH7.2 PBS进行透析过夜，透析后获得的大沙鼠IgG抗原置于-20℃的冰箱内备用；b、兔抗大沙鼠IgG抗体的制备(1)选取两只各2.5公斤左右的健康新西兰实验兔备用；(2)用1ml注射器吸取由a步骤制得的大沙鼠IgG抗原1ml，沿兔背脊柱两侧行皮下多点注射进行初次免疫；(3)间隔半个月后进行第二次免疫，免疫量及方法同上；(4)然后再每隔15天免疫一次，剂量及方法同上，共免疫四次；(5)末次免疫15天后，由股静脉采集实验兔血液1mL，分离血清进行抗体检测，检测方法为免疫环状沉淀试验和红细胞凝集试验；(6)当抗体滴度已达到环状沉淀试验要求的1∶32时，则对实验兔进行腹腔加强免疫三天后进行颈动脉采血；(7)采集的血液，静置待血清析出后至少2000转/分钟的离心速度进行离心操作即可获得兔抗大沙鼠免疫血清。
2、 根据权利要求1所述的兔抗大沙鼠免疫血清，其特征在于将纯化后的大 沙鼠IgG用生理盐水溶解后，装入透析袋用0. 01M pH7. 2 PBS进行透析过夜， 其间至少换液三次以除去IgG中的NH/及S(V离子。
全文摘要
一种兔抗大沙鼠免疫血清，包括a.大沙鼠血清IgG抗原的制备采集大沙鼠血液，离心分离大沙鼠血清；将血清中加入饱合硫酸铵溶液，冷藏，再高速离心操作去除血清中的杂物及纤维蛋白；取上清液再补加饱合硫酸铵，冷藏，再进行高速离心弃上清液留取沉淀物，即为大沙鼠血清中的粗提IgG；经纯化后的大沙鼠IgG装入透析袋透析过夜；b.兔抗大沙鼠IgG抗体的制备选取实验兔；吸取上述大沙鼠IgG抗原，沿兔背脊柱两侧行皮下多点注射免疫四次；采集实验兔血液，分离血清进行抗体检测；当抗体滴度达到1∶32时，对实验兔进行颈动脉采血；静置待血清析出后进行离心操作即可获得兔抗大沙鼠免疫血清。本发明工艺步骤简单，使用方便。
文档编号G01N33/531GK101210921SQ20071018005
公开日2008年7月2日 申请日期2007年12月24日 优先权日2007年12月24日
发明者张渝疆, 翔 戴, 王信惠, 阿布利米提, 阿扎提 申请人:新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心