专利名称：一种检测i型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生化医学检验技术领域，具体地说是一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法，可用于I型糖尿病的预测和诊断。
背景技术：
—般的，I型糖尿病是一种自体免疫疾病，机体受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素诱发而产生异常自身体液和细胞免疫应答，导致胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少，一旦发病需要依赖外源性胰岛素补充以维持生命，所以I型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病。此类糖尿病常见于儿童和青年患者，但是它可以在任何年龄段的人群中发生，并且此类糖尿病的患病率约占总糖尿病病例的10%。可见及早地对I型糖尿病进行诊断以及高危人群中进行预报具有重要的意义。对I型糖尿病的诊断主要通过检测其自身免疫性抗体，抗体主要包括以下几种:谷氨酸脱羧酶抗体(GAD)、胰岛细胞 抗体(ICA)酪氨酸磷酸酶抗体(ΙΑ-2Α)及胰岛素自身免疫性抗体(IAA)。目前测定GAD、IA-2、IAA常用的方法有放射免疫法、酶联免疫法；用于ICA测定的主要用间接免疫荧光法，另外也有用酶联免疫法及免疫组化法。放射免疫分析具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，并且样品用量少，常可测至皮摩尔量。本方法有时会出现交叉反应、假阳性反应、组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐，有时会影响结果等，还存在使用放射性标记物所引起的放射线辐射和污染等问题。

发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法。本发明的技术方案是按以下方式实现的，本发明利用293细胞培养产生的一种荧光酶一抗原融合蛋白，可以与病人血清中的糖尿病自身抗体发生特异性结合。然后加入蛋白A琼脂糖，沉淀融合蛋白-抗体复合物，离心后将未结合的融合蛋白从上清液中吸走。之后加入荧光素酶底物，利用荧光检测仪检测荧光强度，从而测定待测样品中糖尿病自身抗体的含量。一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒,该试剂盒包含有:荧光素酶和糖尿病抗原的融合蛋白。一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒包含有:荧光素酶-GAD65融合蛋白、荧光素酶-1A-2融合蛋白、荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白。
一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒包含有:
试剂1:1A:荧光素酶-GAD65融合蛋白，
IB:荧光素酶-1A-2融合蛋白，
IC:荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白；
试剂2:标准液；
试剂3:
3Α:空白对照液，
3Β:健康人血清对照液；
试剂4:蛋白A琼脂糖；
试剂5:Ranilla荧光底物。所述的试剂I的制备方法是:将Ranilla荧光基因与目的基因融合后转染到293细胞中，然后在含有10%血清的DMEM培养液中培养36 60h，将收获的细胞在冰浴中超声处理15 30 min,然后将细胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm转速离心15 45 min后取上清，得到融合蛋白，后分装冻干成该试剂盒中的试剂I。标准液是标准抗体NIBSC97/550。缓冲液是指0.01mol/L, ρΗ7.4磷酸盐缓冲液。Ranilla荧光素酶是指:海肾荧光素酶，指荧光素酶的报告基因来自于海肾。就像萤火虫荧光素酶一样。Ranilla荧光基因来自于海肾。目的基因是指糖尿病抗原基因。将这两种基因融合后进行表达，会产生融合蛋白，在本专利中分别为荧光素酶-GAD-65融合蛋白、荧光素酶-ΙΑ-2融合蛋白、荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白。一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒的检测方法的步骤是:
试剂盒:
试剂1:1A:荧光素酶-GAD65融合蛋白，
IB:荧光素酶-ΙΑ-2融合蛋白，
IC:荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白；
试剂2:标准液；
试剂3:
3Α:空白对照液，
3Β:健康人血清对照液；
试剂4:蛋白A琼脂糖；
试剂5 =Ranilla荧光底物；
实验之前，将试剂盒和缓冲液在室温下放置至少30min ；
(1)对试剂I用缓冲液进行一定倍数的梯度稀释，要保证抗原有一定的浓度，要求达到每微升中有IO7个荧光单位；
(2)加入15 30uL的病人血清、梯度稀释的试剂2标准液、健康人血清对照液于N只离心管中，并且设置N个试管作为平行组(标曲的浓度梯度可根据抗体的不同设定)；
(3)向每只管中加入40 SOuL的试剂I稀释液，另外加两只空管用来测荧光总强度；
(4)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括两只测荧光总强度空管；
(5)在室温下，孵育3 5h，让糖尿病自身抗体与抗原特异性结合；
(6)孵育之后，向每只管中加入40 80uL的蛋白A琼脂糖，不包括测总荧光强度空管，来捕捉抗原抗体复合物；
(7)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括测总荧光强度空管；
(8)于4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或于室温缓慢摇动抗原抗体混合物I 2h，使抗体与蛋白A琼脂糖偶连，
(9)孵育之后，向每只管中加入I 2mL的2 8°C冷藏的缓冲液，不包括测总荧光强度空管，然后在4°C下1500 3000rpm离心15 30min，将蛋白A琼脂糖偶连的抗原-抗体复合物离心至管底；
(10)离心后，将上清液小心吸去，沉淀用PBS将蛋白A琼脂糖-抗原-抗体复合物悬起离心洗涤2 5次；
(11)然后向离心管中加入50uL Ranilla荧光底物，立即测定荧光强度；
(12)分析结果:
以标准液的浓度为X轴，以结合率为Y轴做标准曲线，然后根据患者血清的荧光强度，计算结合率，从曲线上读取病人血清中自身抗体的浓度。结合率=(样品测定值-3B测定值)/总荧光强度 抗体浓度=标曲读取值*相对倍数
阴性1.0 U/mL 阳性:> 1.0 U/mL
三种抗体只要有一种检测为阳性，即可确定样品含有糖尿病自身抗体，样品来源人体患有I型糖尿病。本发明与现有技术相比所产生的有益效果是:
本发明在放射免疫技术的基础上使用荧光素融合蛋白作为标记物，做成试剂盒，加样程序简单，一次可分析大量标本，并且具有较高的特异性和灵敏度。本发明使用微量荧光检测仪检测，与传统的HPLC相比，操作简单，直接接受标准
0.2mL离心管进行隔离测定，无需开盖堵截污染途径，保证实验结果可靠和操作人员安全。另外可采用不小于25uL样品量进行测定，达到微量省试剂的要求，并且高灵敏度、高信噪t匕，测量值稳定可靠。
具体实施例方式下面对本发明的一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法作以下详细说明。本发明用293细胞培养产生的一种荧光酶一抗原融合蛋白，可以与病人血清中的糖尿病自身抗体发生特异性结合。然后加入蛋白A琼脂糖，沉淀融合蛋白-抗体复合物，离心后将未结合的融合蛋白从上清液中吸走。之后加入荧光素酶底物，利用荧光检测仪检测荧光强度，从而测定待测样品中糖尿病自身抗体的含量。
本发明的一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒的检测方法的步骤是:
(I)将Ranilla荧光基因与目的基因转染到293细胞中，然后在含有10%血清的DMEM培养液中培养55h ;将收获的细胞在冰浴中超声处理I min，然后将细胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm转速离心20 min后取上清,后分装冻干成检测试剂盒试剂I ;
试剂盒:
试剂1:1A:荧光素酶-GAD65融合蛋白，
IB:荧光素酶-1A-2融合蛋白，
IC:荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白；
试剂2:标准液；
试剂3:
3Α:空白对照液，
3Β:健康人血清对照液；
试剂4:蛋白A琼脂糖；
试剂5:RaniIIa荧光底物；
标准液是标准抗体NIBSC97/550。缓冲液是指0.01mol/L, pH7.4磷酸盐缓冲液。Ranilla荧光素酶是指:海肾荧光素酶，指荧光素酶的报告基因来自于海肾。就像萤火虫荧光素酶一样。Ranilla荧光基因来自于海肾。目的基因是指糖尿病抗原基因。将这两种基因融合后进行表达，会产生融合蛋白，在本专利中分别为荧光素酶-GAD-65融合蛋白、荧光素酶-1A-2融合蛋白、荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白。试剂盒的试剂组成及预处理:
试剂编号:1Α
试剂名称:荧光素酶-GAD65融合蛋白 试剂编号:1Β
试剂名称:荧光素酶-ΙΑ-2融合蛋白 试剂编号:1C
试剂名称:荧光素酶-ΙΑ-2 β融合蛋白
预处理方式:冻干粉:向每瓶中加入一定体积的缓冲液溶解混匀，2-8°C保存待用。
试剂编号:2 试剂名称:标准液
预处理方式:利用逐步梯度稀释标准液，以荧光强度为纵坐标，以标准抗体NIBSC97/550的浓度为横坐标，做标准曲线。
试剂编号:3A 试剂名称:空白对照液 试剂编号:3B
试剂名称:健康人血清对照液 预处理方式:2-8°C保存待用。
试剂编号:4
试剂名称:蛋白A琼脂糖
预处理方式:冻干粉，向每瓶中加入一定体积的缓冲液溶解混匀，2-8°C保存待用。
试剂编号:5
试剂名称=Ranilla荧光底物 预处理方式:2-8°C保存待用。(2)加入20uL的病人血清、梯度稀释的标准液、对照液于N只离心管中，并且设置N个试管作为平行组；
(3)向每只管中加入50uL的融合蛋白稀释液，另外加两只空管用来测荧光总强度；
(4)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括测总荧光强度空管；
(5)在室温下，孵育5h，让糖尿病自身抗体与抗原特异性结合；
(6)孵育之后，向每只管中加入50uL的蛋白A琼脂糖，不包括测总荧光强度空管，来捕捉抗原抗体复合物；
(7)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括测总荧光强度空管；
(8)4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温lh，使抗体与蛋白A琼脂糖结合；
(9)孵育之后，向每只管中加入ImL的2 8°C冷藏的缓冲液，不包括测总荧光强度管，然后在4°C下1500rpm离心30min，将蛋白A琼脂糖偶连的抗原-抗体复合物离心至管底；
(10)离心后，将上清小心吸去，沉淀用PBS将蛋白A琼脂糖-抗原-抗体复合物悬起离心洗涤2 5次；
(11)然后向离心管中加入50uL Ranilla荧光底物，立即测定荧光强度；
(12)分析结果:
以标准液的浓度为X轴，以结合率为Y轴做标准曲线，然后根据患者血清的荧光强度，计算结合率，从曲线上读取病人血清中自身抗体的浓度。结合率=(样品测定值-3B测定值)/总荧光强度 抗体浓度=标曲读取值*相对倍数
阴性1.0 U/mL 阳性:> 1.0 U/mL
三种抗体只要有一种检测为阳性，即可确定样品含有糖尿病自身抗体，样品来源人体患有I型糖尿病。按上述实施例分别对107位健康人和98位已经诊断为I型糖尿病的患者的血清进行检测，其结果如下:
1: 107位健康人血清的检测结果 抗体:GAD-65阴性率:100%
抗体:IA-2阴性率:99% 抗体:ΙΑ-2 β阴性率:99% 。2:98位I型糖尿病患者血清的检测结果 抗体:GAD-65 阳性率:75%
抗体:IA-2 阳性率:53%
抗体:ΙΑ-2β 阳性率:56%。3:利用2005双抗体固相法研究此方法，特异性和灵敏度结果如下: 此方法的特异性和灵敏度结果:
抗体:GAD-65 特异性(η=100):96% 灵敏度(η=50):87%
抗体:ΙΑ-2 特异性(η=100):100% 灵敏度(η=50):73%
抗体:ΙΑ-2β 特异性(η=100):98% 灵敏度(η=50):74%。
权利要求
1.一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有:荧光素酶和糖尿病抗原的融合蛋白。
2.一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有:荧光素酶-GAD65融合蛋白、荧光素酶-1A-2融合蛋白、荧光素酶-1A-2 β融合蛋白。
3.—种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒,其特征在于该试剂盒包含有: 试剂1:1A:荧光素酶-GAD65融合蛋白， IB:荧光素酶-ΙΑ-2融合蛋白， IC:荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白； 试剂2:标准液； 试剂3: 3Α:空白对照液， 3Β:健康人血清对照液； 试剂4:蛋白A琼脂糖； 试剂5:Ranilla荧光底物。
4.根据权利要求3所述的一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒，其特征在于所述的试剂I的制备方法是:将Ranilla荧光基因与目的基因融合后转染到293细胞中，然后在含有10%血清的DMEM培养液中培养36 60h，将收获的细胞在冰浴中超声处理15 30min，然后将细胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm转速离心15 45 min后取上清，得到融合蛋白，后分装冻干成该试剂盒中的试剂I。
5.一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒的检测方法，其特征在于该检测方法的步骤是: 试剂盒: 试剂1:1A:荧光素酶-GAD65融合蛋白， IB:荧光素酶-1A-2融合蛋白， IC:荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白； 试剂2:标准液； 试剂3: 3Α:空白对照液， 3Β:健康人血清对照液； 试剂4:蛋白A琼脂糖； 试剂5 =Ranilla荧光底物； 实验之前，将试剂盒和缓冲液在室温下放置至少30min ； (1)对试剂I用缓冲液进行一定倍数的梯度稀释，要保证抗原有一定的浓度，要求达到每微升中有IO7个荧光单位； (2)加入15 30uL的病人血清、梯度稀释的试剂2标准液、健康人血清对照液于N只离心管中，并且设置N个试管作为 平行组(标曲的浓度梯度可根据抗体的不同设定)； (3)向每只管中加入40 SOuL的试剂I稀释液，另外加两只空管用来测荧光总强度；(4)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括两只测荧光总强度空管； (5)在室温下，孵育3 5h，让糖尿病自身抗体与抗原特异性结合； (6)孵育之后，向每只管中加入40 80uL的蛋白A琼脂糖，不包括测总荧光强度空管，来捕捉抗原抗体复合物； (7)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括测总荧光强度空管； (8)于4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或于室温缓慢摇动抗原抗体混合物I 2h，使抗体与蛋白A琼脂糖偶连， (9)孵育之后，向每只管中加入I 2mL的2 8°C冷藏的缓冲液，不包括测总荧光强度空管，然后在4°C下1500 3000rpm离心15 30min，将蛋白A琼脂糖偶连的抗原-抗体复合物离心至管底； (10)离心后，将上清液小心吸去，沉淀用PBS将蛋白A琼脂糖-抗原-抗体复合物悬起离心洗涤2 5次； (11)然后向离心管中加入50uL Ranilla荧光底物，立即测定荧光强度； (12)分析结果。
6.一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒的检测方法，其特征在于该检测方法的步骤是: (1)将Ranilla荧光基因与目的基因转染到293细胞中，然后在含有10%血清的DMEM培养液中培养55h ;将收获的 细胞在冰浴中超声处理I min，然后将细胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm转速离心20 min后取上清,后分装冻干成检测试剂盒试剂I ; 试剂盒: 试剂1:1A:荧光素酶-GAD65融合蛋白， IB:荧光素酶-1A-2融合蛋白， IC:荧光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白； 试剂2:标准液； 试剂3: 3Α:空白对照液， 3Β:健康人血清对照液； 试剂4:蛋白A琼脂糖； 试剂5 =Ranilla荧光底物； (2)加入20uL的病人血清、梯度稀释的标准液、对照液于N只离心管中，并且设置N个试管作为平行组； (3)向每只管中加入50uL的融合蛋白稀释液，另外加两只空管用来测荧光总强度； (4)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括测总荧光强度空管； (5)在室温下，孵育5h，让糖尿病自身抗体与抗原特异性结合； (6)孵育之后，向每只管中加入50uL的蛋白A琼脂糖，不包括测总荧光强度空管，来捕捉抗原抗体复合物； (7)用漩涡振荡器混匀每支管并盖上盖，不包括测总荧光强度空管； (8)4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温lh，使抗体与蛋白A琼脂糖结合；(9)孵育之后，向每只管中加入ImL的2 8°C冷藏的缓冲液，不包括测总荧光强度管，然后在4°C下1500rpm离心30min，将蛋白A琼脂糖偶连的抗原-抗体复合物离心至管底； (10)离心后，将上清小心吸去，沉淀用PBS将蛋白A琼脂糖-抗原-抗体复合物悬起离心洗涤2 5次； (11)然后向离心管中加入50uL Ranilla荧光底物，立即测定荧光强度； (12 )分析结果。
全文摘要
本发明提供一种检测I型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法，属于生化医学检验技术领域，本发明是利用293细胞培养产生的一种荧光酶－抗原融合蛋白，可以与病人血清中的糖尿病自身抗体发生特异性结合。然后加入蛋白A琼脂糖，沉淀融合蛋白-抗体复合物，离心后将未结合的融合蛋白从上清液中吸走。之后加入荧光素酶底物，利用荧光检测仪检测荧光强度，从而测定待测样品中糖尿病自身抗体的含量。本发明使用微量荧光检测仪检测，与传统的HPLC相比，操作简单，无需开盖堵截污染途径，保证实验结果可靠和操作人员安全，达到微量省试剂的要求，并且高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。
文档编号G01N33/68GK103116030SQ20131003556
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者崔泰兴, 唐东起, 李世武, 吴琦, 苏红霞, 葛瑞蕾 申请人:山东东兴生物科技股份有限公司