专利名称：一种预测优秀冰雪运动员身高的细胞生物学方法
技术领域：
本发明涉及一种预测优秀冰雪运动员身高的细胞生物学方法。适合于优秀冰雪运动员在基因和蛋白水平上的早期选材，属于体育科学与生命科学交叉的学科领域。
背景技术：
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是多功能生长因子，属于转化生长因子β (transforming growth factor-β , TGF- β )超家族，是一组具有结构类似、高度保守的功能蛋白，能够在体内诱导骨和软骨形成的因子，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期、软骨修复时表达，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。BMP的活性最早发现在20世纪60年代，直到20世纪80年代纯化并克隆人类BMP后，才发现这种蛋白有骨诱导作用。迄今为止，已有约20多种被发现。BMP信号通过丝/苏氨酸激酶受体I型和II型的亚型触发。已经发现3种I型受体与BMP配位体结合，也就是:1a、Ib型BMP受体和Ia型活化素受体。BMP还涉及调节细胞的增殖、分化和凋亡，但它们是以常位和异位诱导骨、软骨、韧带和腱形成能力为标志的。BMP参与骨骼的生长、发育及创伤的修复，主要表现为BMP的诱导成骨作用。正常骨形成需要3个必备条件:(I)特定的干细胞；(2)诱导因子；(3)允许骨形成的环境。BMP作用的靶细胞是未分化的、有活性的间充质细胞。它能诱导特定的、包括肌肉中和血管周围的间充质细胞，不可逆地分化为软骨和骨细胞。将BMP植入软组织内， 可诱导异位新骨的形成。在骨折后愈合的过程中，骨折的骨痂形成区BMP的表达水平显著增高。目前，骨形成蛋白已被成功地应用于骨延迟愈合的治疗、骨不连接、骨折和骨缺损的治疗。已有很多关于报道基因重组人的具有骨诱导活性的骨形成蛋白BMP2、BMP4、BMP5、BMP7。其中尤以BMP2和BMP7的报道最多，其成骨作用也较强。进一步的研究表明，BMP9在14种BMP中的成骨作用最强，其成骨作用甚至比目前已广泛证实的BMP2、BMP7的成骨作用更强大。BMP诱导间充质细胞向成骨样细胞分化的作用已经大量实验证实，还有实验发现BMP2能诱导提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性，通过调节细胞外基质的矿化，显著地诱导骨钙蛋白的表达，从而提高成骨细胞的成骨活性，而成骨细胞的活性又影响着优秀冰雪运动员骨的形成和增长，因此，可以通过检测优秀冰雪运动员成骨细胞中BMPs的表达水平来预测优秀冰雪运动员的最适身高，为冰雪运动员选材提供一个最适的细胞生物学标准。运动员的成长过程中伴随着身体形态的变化，对运动员身体形态尤其是身高的研究是体育科学研究中基础而又重要的一个环节。我国优秀冰雪运动员身高特征的研究结果将有助于完善、系统的科学研究体系的建立，同时对构建科学、系统的我国优秀冰雪运动员的高模型起到积极作用，并为今后的身体机能、技战术和心理的研究体系奠定一定的理论基础。自1998年长野冬季奥运会短道速滑由表演项目正式获准成为比赛项目以来，该项目的6枚金牌倍受冰雪强国瞩目。短道运动员的选材和育材也理所当然的受到关注。身高作为身体形态的一个主要方面，有哪些特点，顶尖选手和非项尖选手之间的身高是否有差别，根据项目的特点究竟哪种身高更为适宜，此前曾有过专门研究，但随着时间的推移，该项目水平的提高，运动员的身高又有哪些新的特点，需要我们进一步做出更科学的研究和推断，探讨当今世界优秀冰雪运动员的身高特征会对我国的该项目的选材和育材方面有一定的参考价值。由于我国对优秀冰雪运动员最适身高的研究起步比较晚，而且冰雪运动员的育材和选材大部分都是靠经验，没有建立在生命科学的基础上。近些年来，随着体育科学和生命科学的飞速发展及两者在理论、方法、技术和手段上的相互交叉和渗透，强有力地推动者冰雪运动员早期选材向着科学化和系统化的方向转型和发展。因此，有必要建立一套完善的、科学的、系统的细胞生物学方法，从细胞水平上有效地预测优秀冰雪运动员的最适身高。骨是骨干和骨骺的积聚物，骺软骨区形成成骨细胞，然后由软骨变成骨头，身体因此变高。骨形成蛋白是检测成骨细胞活性的特异性表面标记，通过免疫组化技术和流式细胞技术对成骨细胞中的骨形成蛋白进行检测，从而推断出软骨组织中特定基因表达量的差异情况，从细胞生物学水平上预测 基因表达与身高的联系。

发明内容
本发明提供了一种在细胞生物学水平上预测优秀冰雪运动员身高的方法。本发明从细胞生物学水平上预测了优秀冰雪运动员的最适身高，通过免疫组化技术和流式细胞技术检测优秀冰雪运动员成骨细胞中关键基因BMP2、BMP7和BMP9表达水平，进而从人体组织中特异蛋白水平上比较和预测与身高的联系。方法简单，易操作。
具体实施例方式下面以优秀冰雪运动员成骨细胞中的分子标记BMP2、BMP7和BMP9基因为例，通过检测其相对表达水平来详细说明本发明的具体实施。实施例:检测优秀冰雪运动员成骨细胞中的分子标记BMP2、BMP7和BMP9基因的表达水平选取普通人和优秀冰雪运动员的成骨细胞分别作为对照组和实验组，对细胞中的关键蛋白BMP2、BMP7和BMP9做免疫组化检测和流式检测。(一 )成骨细胞中关键蛋白的免疫组化检测设置空白对照组、对照组和实验组。空白对照组采用PBS作为一抗，羊抗兔IgG (中杉金桥Zf-0311)作为二抗；对照组和实验组采用兔抗人IgG作为一抗，羊抗兔IgG(中杉金桥Zf-0311)作为二抗；免疫组化具体方法如下:1、标本制备将细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片，待细胞在盖玻片上贴壁，PBS清洗三次，4%的多聚甲醛固定。2、染色I)石固定后的盖玻片在0.25% Tritonx-1OO通透15min ；
2)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；3)加一滴封闭用山羊血清于盖玻片上封闭30min ；4)倒掉或吸干液体；5)每张盖玻片加IOOul —抗，湿盒内孵育30 60min ；6)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；7)每张盖玻片加一滴二抗，孵育60min ；8)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；9)镜检。激光共聚焦显微镜下观察免疫组化结果。( 二)成骨细胞中关键蛋白的流式检测(I)微球准备:取适量微球并用PBS离心洗涤2次，1500r/minX10min,弃上清液，用PBS重悬，计数并调整微球浓度至I X IO7个/ml ；(2)结合:取2只流式管，并分别标记阴性对照、实验管，加入100 μ I微球悬液；再于实验管中加入一定量待检可溶性蛋白溶液，阴性对照管加等体积的PBS ;4°C，结合60min ;定量检测蛋白分子时，可把标准 蛋白进行倍比稀释，分别与微球结合；(3)封闭:用PBS洗涤I次，1500r/minX lOmin，弃上清液，加入封闭液(含1% BSA的PBS)500y 1，4°C，封闭30min，以封闭微球上剩余的活性基团；(4)检测抗体标记:用PBS离心洗漆2次，1500r/minX IOmin,弃上清液,于各管中加入目的蛋白荧光抗体IOyl ;4°C，避光反应30min(也可进行间接免疫荧光标记)。流失检测:用PBS洗涤2次，弃上清液，用500 μ IPBS重悬，上机检测；(5)收集10000个微球，定性检测时用荧光阳性率表示(出现荧光阳性信号，则表示样本中含待检可溶性蛋白分子；阳性率低且荧光强度弱，则表示样本中待检可溶性蛋白分子含量低，反之则含量高)；若进行定量检测时，用平均荧光强度表示，需绘制平均荧光强度与标准蛋白质含量的关系曲线，并利用标准曲线计算待检样本的含量。(三)检测结果实验组和对照组的测定结果比较其差异，实验结果显示，实验组中的优秀冰雪运动员成骨细胞中的ΒΜΡ2、ΒΜΡ7和ΒΜΡ9基因的表达量较对照组普通人成骨细胞中的ΒΜΡ2、ΒΜΡ7和ΒΜΡ9基因的表达量高。
权利要求
1.一种预测优秀冰雪运动员的身高的细胞生物学方法。
2.依据权利要求1所述的细胞生物学方法，其特征在于通过免疫组化技术和流式细胞技术定性和定量检测成骨细胞中骨形态发生蛋白2 (bone morphogeneticprotein2,BMP2)、骨形态发生蛋白7 (bone morphogenetic protein7,BMP7)和骨形态发生蛋白9(bonemorphogenetic protein9, BMP9)蛋白的表达水平来预测优秀冰雪运动员的身高。
3.依据权利要求2所述，通过免疫组化技术和流式细胞技术检测优秀冰雪运动员成骨细胞中BMP2、BMP7和BMP 9基因的表达量较普通人的高。
全文摘要
本发明公开了一种预测优秀冰雪运动员身高的细胞生物学方法。主要通过免疫组化技术和流式细胞技术定性和定量检测并比较优秀冰雪运动员和普通人成骨细胞中骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)中的BMP2、BMP7、BMP9的表达水平。结果显示，检测优秀冰雪运动员成骨细胞中BMP2、BMP7和BMP9的表达量较普通人的高。说明人成骨细胞中BMP2、BMP7和BMP9相对较高的表达量是最适身高的参考标准。本发明为建立该项目运动员潜能的早期预测、评定、选材和育材的科学体系打下坚实的理论和技术基础，突破一次性选材的理论和技术难关。
文档编号G01N33/68GK103226147SQ20131010815
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者姜龙江, 阚军常, 李万哲, 崔鹏, 白春雨, 关伟军 申请人:哈尔滨体育学院