专利名称：生物巯基荧光探针、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种生物巯基荧光探针及其制备以及在活性细胞或生物活体巯基含量测定中的应用。
背景技术：
巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团。在蛋白质中，巯基部分是与酶活性有关的最具反应性的官能团，两个巯基脱氢形成二硫键(-S-S-)，使相邻多肽得以连接，对于维持蛋白质完整结构十分重要。细胞中的巯基，尤其是谷胱甘肽(GHS)作为细胞内的亲核试剂和还原试剂，能保护细胞不受缺氧、毒素、诱变、放射性及致癌物的侵害。大量的生物现象均依赖于包括巯基在内的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应及辅酶A参与的反应等。游离的小分子巯基物质包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hey)、还原型谷胱甘肽(GSH)、二氢硫辛酸和辅酶A等。体内巯基分子的含量直接与多种疾病相关，如癌症、帕金森综合症、心血管疾病等，Cys缺乏和儿童生长缓慢、浮肿、嗜睡和肝脏损伤等病症相关，而血浆Hcy浓度升高则是动脉粥样硬化一个独立的风险因子。因此，发展快速、灵敏、简便的检测巯基的方法在生物化学和临床化学中均具有重要意义。传统的巯基检测方法有质谱法、高效液相色谱法(HPLC)、电化学法、分光光度法、比色法等，这些方法操作繁琐，灵敏度低，且不适合生物样本中巯基的检测。荧光测定法有成本低、可重复性好、灵敏度高、选择性强、可视化等优点，近年来成为研究焦点，取得了较大的进展。巯基荧光探针出了检测灵敏，还可作为生物结构研究指示系统，被广泛应用于研究蛋白结构和微环境性质、微量检测胆碱或谷胱甘肽S转移酶、组织化学染色、抗原-抗体反应检测及定位、疾病诊断、HPLC分析巯基化合物等领域。现有技术中的巯基荧光探针主要有以下几类:第一类为芳香卤代物、丹磺酰氮丙啶类、芘类等，具有良好的选择性和灵敏度，但是这些探针自身具有较强的荧光，用于活体细胞成像时会造成较低的 信噪比；第二类为苯并呋喃磺酰卤类探针，其自身荧光较弱，且需要在碱性及高温条件下与巯基反应，也不适合用于生物活体中巯基检测；第三类为乙酰卤衍生物类试剂，存在光稳定性差，荧光基团易失活等不足，无法满足生物活体巯基检测。因此，开发出能够用于活性生物巯基检测的荧光探针成为亟待解决的问题。为了提高信噪比，一个解决方案是降低荧光探针自身的荧光强度。当一个荧光分子(供体)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体)的激发光谱重叠时，供体荧光分子的激发能诱导受体荧光分子发出荧光，同时自身荧光强度衰减，利用这种荧光共振能量转移(FRET)效应，可实现受体荧光分子的荧光减弱或淬灭，有望应用于新的活性生物巯基荧光探针的设计中。

发明内容
本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提高活体细胞成像信噪比，提高光稳定性，本发明提供了一种生物巯基荧光探针，所述探针采用第一荧光基团做发射荧光的能量供体，第二荧光基团或淬灭基团做吸收荧光的能量受体，所述探针结构为R-S-S-R’，其中，R含有第一荧光基团，R’含有第二荧光基团或淬灭基团。优选地，所述探针为所述第一荧光基团和第二荧光基团或所述第一荧光基团与淬灭基团分别与如式I的化合物两边的-NH2连接，
权利要求
1.一种生物巯基荧光探针，其特征在于，所述探针采用第一荧光基团做发射荧光的能量供体，第二荧光基团或淬灭基团做吸收荧光的能量受体，所述探针结构为R-S-S-R’，其中，R含有第一荧光基团，R’含有第二荧光基团或淬灭基团。
2.权利要求1所述的生物巯基荧光探针，其特征在于，所述第一荧光基团与第二荧光基团或所述第一荧光基团与淬灭基团分别与如式I的化合物两边的-NH2连接，
3.权利要求1所述的生物巯基荧光探针，其特征在于，所述第一荧光基团选自异硫氰酸荧光素、罗丹明及其衍生物、羧基荧光素及其衍生物、花青素荧光染料、六氯-6-甲基荧光素或二苯基蒽及其衍生物的荧光基团。
4.权利要求1所述的生物巯基荧光探针，其特征在于，所述第二荧光基团选自异硫氰酸荧光素、罗丹明及其衍生物、羧基荧光素及其衍生物、花青素荧光染料、六氯-6-甲基荧光素或二苯基蒽及其衍生物的荧光基团。
5.权利要求1所述的生物巯基荧光探针，其特征在于，所述淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或4- (4- 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的淬灭基团。
6.权利要求1所述的生物巯基荧光探针，其特征在于，其结构如式II:
7.制备权利要求2所述生物巯基荧光探针的方法，包括: 在式I所示的二硫键骨架上的第二氨基上引入保护基团，形成半封闭二硫键骨架；
8.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的保护基团为叔丁氧羰基。
9.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，第一氨基与第一荧光基团的连接、第二氨基与第二荧光基团或淬灭基团的连接均为酰胺化反应。
10.权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述酰胺化反应中加入了催化剂DMAP和选自DCC、EDC、DIC或BDDC的缩合剂。
11.用于检测生物巯基的试剂盒，包括: 权利要求1-5任一项所述的生物巯基荧光探针；和 用于洗涤细胞或组织的缓冲液。
12.权利要求1-5任一项所述的生物巯基荧光探针在生物巯基检测或化学体系巯基检测中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种生物巯基荧光探针，所述探针采用第一荧光基团做发射荧光的能量供体，第二荧光基团或淬灭基团做吸收荧光的能量受体，所述探针结构为R-S-S-R’，其中，R含有第一荧光基团，R’含有第二荧光基团或淬灭基团。本发明还提供了所述生物巯基荧光探针的制备方法和应用。本发明利用生物巯基探针自身荧光强度衰减或淬灭，提高了成像信噪比，同时，与巯基反应后的荧光稳定性高；本发明的荧光探针的制备方法简单，可在常温、常压、中性pH条件下进行。
文档编号G01N21/64GK103102338SQ20121058666
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者蔡林涛, 龚萍, 杨月婷, 石碧华, 王碧, 张鹏飞, 郑明彬, 胡德红, 盛宗海, 刘朋, 高笃阳, 郑翠芳 申请人:深圳先进技术研究院