专利名称：重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子及酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及医学检测耗材，特别是一种重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微 粒子及酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
肝脏是人体最大的内脏器官，也是功能最复杂的器官之一，它担负着许多非常重 要的生理功能，如各种物质代谢的中枢、分泌胆汁、合成蛋白和凝血因子、解毒等功能，对维 持生命和内环境的稳定起重要的作用。目前，终末期肝病，如重型肝炎肝衰竭、肝硬化和肝 癌等均危及生命，且死亡率极高，一直是世界医学界难以解决的问题。据世界卫生组织报 道，全球约20亿人曾感染过乙肝，其中3. 5亿人为慢性乙肝感染者，每年约有100万人死于 乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化及原发性肝细胞癌。因此，重型肝炎肝衰竭早期预警和早期 诊断需求尤为迫切。CXC趋化因子配体10 (CXC chemokine ligand-10，CXCL10)是新近发现的一种重 要的趋化因子，属于CXC类非ELR亚族。CXCLlO主要介导Th型炎症反应，趋化T淋巴细胞 和单核细胞，与炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等有关。近年研究发现，CXCLlO在不同 类型肝病中表达升高，并且与疾病的发生、发展、治疗和预后等密切相关。CXCLlO是1985年由Luster等首次发现报道的，是利用分子生物学技术从活化 U937细胞株的基因表达产物中筛选出来的，其相关蛋白被命名为CXCL10，又名IFN-γ诱导 蛋白 10 (IFN- y -inducibleprotein 10，IP-10)。人类 CXCLlO 基因定位于染色体 4q21，含 有3个内含子和4个外显子，共98个氨基酸残基，相对分子质量约为10000。CXCLlO属于趋 化因子CXC家族，氨基酸的同源性为20% -70%，其N末端含有4个保守的半胱氨酸(Cys) 残基，此区域为受体活化的重要区域。由于分子中第一个半胱氨酸前没有ELR(GlU-LeU-Arg 序列)构型而将CXCLlO归入非ELR-CXC趋化因子。CXCLlO主要由单核细胞、内皮细胞、肝 实质细胞、树突状细胞(DC)、NK细胞、成纤维细胞等产生。除IFN-γ外，其他在感染和炎症 中显著升高的刺激物，如IFN-α ,TNF-α、脂多糖(LPS)、双链RNA (ds_RNA)以及某些病毒也 能诱导CXCLlO的表达。另外，CXCLlO在胸腺、脾和淋巴结的基质中呈现组成性低水平表达。CXCLlO对T细胞、B细胞、单核巨噬细胞、DC、NK细胞、嗜碱性粒细胞等显示有较强 的趋化和功能活化作用，促进适应性免疫反应的形成及炎症发生。此外，CXCLlO也可在血 管生成、造血作用、淋巴器官形成、伤口愈合及胚胎发育的调节中发挥作用。CXCLlO的特殊作用由其特异性受体CXCR3介导。该受体为CXCLlO的唯一受体，其 基因定位于染色体Xpl3，cDNA全长1104bp，编码368个氨基酸，相对分子质量约为41kDa。 CXCR3是由7个跨膜亚单位组成的膜结合分子，属于G蛋白偶联受体超家族。CXCR3主要 表达于活化的T细胞、NK细胞表面，其配体主要有CXCL10、IFN-Y诱导的单核因子(Mig， CXCL9)和 T 细胞 α 趋化因子(I-TAC，CXCLl 1)。CXCLlO与靶细胞上的相应受体CXCR3的胞外N端结合，介导受体蛋白胞内C端丝氨酸/苏氨酸磷酸化，通过一系列跨膜信号转导通路，使CXCR3阳性靶细胞向炎症病灶迁 移、活化，在许多疾病的发生发展中发挥重要作用。最新的研究发现，在重型肝炎肝衰竭患者血清中人趋化因子配体10含量会急剧 升高，因此选用人趋化因子配体10作为重型肝炎肝衰竭早期预警和早期诊断具有重要临 床意义，而研制高灵敏度的性能稳定的人趋化因子配体10的检测试剂盒，将使这一重要研 究发现的理论价值转化为实际的临床实用价值，为广大肝病患者带来福音。

实用新型内容本实用新型提供一种重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子和酶联免疫检测 试剂盒，将生命科学与纳米材料的联合应用，本试剂盒内酶标板不包被，而是用捕捉抗体包 被微磁珠粒子，包被的微粒子作为试剂使用，更利于定量操作，方便稳定，而且灵敏度更高。重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子，其特征在于，在纳米级大小的磁粒表 面包被有抗IFN-Y诱导蛋白10的单克隆抗体。重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的酶联免疫检测试剂盒包括外盒，盒内支架，其 特征在于盒内支架的中心位置设置有2 3个主凹槽，所述主凹槽中放置着盛装上述微粒 子的微粒子管。所述主凹槽周围还设置有若干用于放置试剂瓶的副凹槽，副凹槽中放置的试剂瓶 分别盛有IFN-Y诱导蛋白10标准抗原的阳性对照管，PBS溶液为阴性对照管，微粒子洗涤 液管，HRP标记IFN-Y诱导蛋白10多抗管、显色剂管、酶促反应终止液管。所述盒内支架上还设置放置磁力架的凹框。本实用新型，提供一种重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子，用抗IFN-Y诱 导蛋白10的单克隆抗体包被纳米级大小的磁珠微粒，检测时，检测反应的每个需要更换反 应液的环节，都可以利用磁珠的磁力吸附作用，将反应管放置在磁力架上富集磁珠，并吸弃 不再有用的反应液，操作非常方便且精确；另一方面，便于定量，在早期预警检测中，能够对 待测血清中存在的IFN-Y诱导蛋白10进行半定量非常有利于更精确地预测患者的病情程 度。为了进一步提高上述微粒子的使用便捷度，方便随时随地使用，本实用新型还提 供了试剂盒，试剂盒的外盒内设有盒内支架，用于固定住盒内的各种试剂瓶，其中，盒内支 架的中心位置设有1 3个主凹槽，用于放置盛装上述微粒子的微粒子管。本实用新型进一步在主凹槽周围设置了若干副凹槽，用于固定盛装检测反应相关 试剂的试剂管，使试剂盒真正具有便民性，随时随地可以检测。本实用新型的试剂盒在一些情况下，还可以在盒内支架上设置放置磁力架的凹 框，便于向手头没有磁力架的顾客们提供检测操作中必须的磁力架。

图1.本实用新型重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子的结构示意图。图2.重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的酶联免疫检测试剂盒内部结构俯视示意 图。其中1-磁粒、2-抗IFN-γ诱导蛋白10的单克隆抗体、3-外盒，4-盒内支架、5-主凹槽、5a-微粒子管6副凹槽、7-IFN- γ诱导蛋白10标准抗原的阳性对照管、8-PBS溶液为 阴性对照管8，9-微粒子洗涤液管、10-HRP标记IFN-γ诱导蛋白10多抗管、11-显色剂管、 12-酶促反应终止液管、13-磁力架、14-凹框。
具体实施方式
如图1所示，本实用新型重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子，其特征在于， 在纳米级大小的磁粒1表面包被有抗IFN-Y诱导蛋白10的单克隆抗体2。检测时，将包 被着单克隆抗体的微粒子吸取到反应管或酶标板的反应孔中，与待测血清进行酶联免疫反 应，反应的每个需要更换反应液的环节，都可以利用磁珠的磁力吸附作用，将反应管放置在 磁力架上富集磁珠，并吸弃不再有用的反应液；另一方面，本实用新型的微颗粒便于定量， 在早期检测中，能够对待测血清中存在的IFN-Y诱导蛋白10进行半定量，有利于更精确地 预测患者的病情程度。为了进一步提高上述微粒子的使用便捷度，方便随时随地使用，本实用新型还提 供了试剂盒，包括外盒3，盒内支架4，其特征在于盒内支架4的中心位置设置有2 3个主 凹槽5，所述主凹槽5中放置着盛装上述微粒子图1的微粒子管。本实用新型进一步在主凹槽5周围设置了若干副凹槽6，用于固定盛装检测反应 相关试剂的试剂管，剂瓶分别盛有IFN-Y诱导蛋白10标准抗原的阳性对照管7，PBS溶液 为阴性对照管8，微粒子洗涤液管9，HRP标记IFN-Y诱导蛋白10多抗管10、显色剂管11、 酶促反应终止液管12。使试剂盒真正具有便民性，随时随地可以检测。本实用新型的试剂盒在一些情况下，还可以在盒内支架4上设置放置磁力架13的 凹框14，便于向手头上没有磁力架的顾客们提供检测操作中必须的磁力架。制备实验例制备微粒子(1. 1)吹打或振荡 Dynabeads M-280Tosylactivated(Invitrogen Co，USA)大约 1分钟，达到均一混合的悬浊液。吸取定量的磁珠，并按照下面描述的步骤清洗吹打或振 荡Dynabeads M-280 Tosylactivated大约1分钟，充分悬起，但要避免引起泡沫；立即吸 取一定体积的磁珠到检测试管中；把试管放在磁体架(Dynal MPC)上2分钟或直到磁珠移 到试管的一侧，并且液体变得很清澈；小心的移走上清，不要触碰到磁珠；从磁体架上移走 试管，用大量的 Buffer B(0. IM borate buffer ρΗ9· 5)或 Buffer A(0. lMNa-phosphate buffer pH7. 4)小心的重悬磁珠，轻轻混合2分钟；如上再次吸走上清后，用相同体积的 Buffer B (或Buffer Α)重悬磁珠或加入达到想要的浓度。(1. 2)用Buffer B (或Buffer Α)溶解IFN- γ诱导蛋白10单抗。本实施例采用 每IO7Dynabeads (大概20 μ g/mg)加入3 μ g抗体(或其它配子)。(1. 3)充分重悬Dynabeads (从磁体上移走试管并振荡或用超声)。加入抗体继续 振荡1分钟。最后包被的浓度为每毫升l-2X109Dynabeads。(1. 4)慢慢轻摇，在37°C孵育16-24小时。对于温度敏感的抗体/蛋白要用低温。 长时间的孵育能确保共价键的结合。注意在孵育的过程中不要让磁珠沉积。(1. 5)孵育后，把试管放在磁体上2分钟，或直到磁珠沉积在管壁的一侧，移走上 清。通常有30-80%的抗体会结合到磁珠上。
5[0032](1.6)清洗包被好的磁珠四次· +4°C, Buffer C(PBS ρΗ7· 4(phosphate buffered saline)with 0. 1% (w/v) BSA)洗5分钟，两次；· +20°C,Buffer D(0. 2M Tris ρΗ8·5，含 0· 1% (w/v)BSA)洗 24 小时或 37°C 4 小 时(Tris可去除游离的tosyl-groups)，一次；· +4°C, Buffer C 洗 5 分钟，一次。(1. 7)至此，Dynabeads M_280Tosylactivated 已经包被好，可以被使用。(1. 8)在Buffer C中储存已知浓度的包被了的Dynabeads。通常包被好的磁珠在 +4°C可储存数月。可以加入0. 02%叠氮化钠作为细菌抑制剂。注意储存的缓冲液必须含有稳定蛋白。使用实验例包被抗体的微珠ELISA法检测人血清IFN- γ诱导蛋白10样本要求人血清，要求清亮、无沉淀、无黄疸；样本1周以内检测可在4°C条件下 贮存；样本1周以上检测需在-20°C条件下冻存，且避免反复冻融。(2. 1)在微孔板每个孔中迅速加入90ul IFN- Γ诱导蛋白10单抗包被微珠及待测 血清10ul，2-8°C震荡孵育30分钟。(2. 2)洗涤把板架放在磁体上2分钟至磁珠吸附于管壁，吸掉上清。使用PBS buffer清洗磁珠三次(可参照1. 1清洗流程)。用IOOul BufferA重悬磁珠。(2. 3)加入IOOul HRP标记IFN-Γ诱导蛋白10多抗，在37°C温箱或水浴震荡反 应15分钟。(2.4)重复 2. 3 洗涤。(2. 5)显色每孔加入底物液50ul，保持震荡，室温避光准确反应10分钟(从第一 孔加入时开始计时)。(2. 6)终止每孔加入2M硫酸50ul。轻微震荡混勻。(2. 7)将板架放于磁板上，使磁性微珠吸于板条侧壁。(2. 8)读值轻轻取下板架，将酶标仪设定在双波长450nm/630nm，测量各孔A值。 应在终止反应后15分钟内读值。
权利要求重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子，其特征在于，在纳米级大小的磁粒表面包被有抗IFN γ诱导蛋白10的单克隆抗体。
2.重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的酶联免疫检测试剂盒包括外盒，盒内支架，其 特征在于盒内支架的中心位置设置有2 3个主凹槽，所述主凹槽中放置着盛装权利要求 1所述的微粒子的微粒子管。
3.根据权利要求2所述的重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的酶联免疫检测试剂盒，其 特征在于所述主凹槽周围还设置有若干用于放置试剂瓶的副凹槽，副凹槽中放置的试剂 瓶分别盛有IFN-Y诱导蛋白10标准抗原的阳性对照管，PBS溶液为阴性对照管，微粒子洗 涤液管，HRP标记IFN-Y诱导蛋白10多抗管、显色剂管、酶促反应终止液管。
4.根据权利要求2或3所述的重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的酶联免疫检测试剂 盒，其特征在于所述盒内支架上还设置放置磁力架的凹框。
专利摘要本实用新型“重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断的微粒子及酶联免疫检测试剂盒”，属于医学检测耗材。所述微粒子，其特征在于，在纳米级大小的磁粒表面包被有抗IFN-γ诱导蛋白10的单克隆抗体。所述试剂盒，包括外盒，盒内支架，其特征在于盒内支架的中心位置设置有2～3个主凹槽，所述主凹槽中放置着盛装权利要求所述的微粒子的微粒子管。所述主凹槽周围还设置有若干用于放置试剂瓶的副凹槽，副凹槽在放置有检测中常用试剂的试剂瓶。本实用新型为实现将IFN-γ诱导蛋白10用于临床检测肝衰竭提供了实用的工具，并具有便于定量，操作方便的优点。
文档编号G01N33/576GK201765232SQ20102025048
公开日2011年3月16日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者吴凡, 段钟平, 白丽, 翟原 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司