专利名称：一种井冈霉素各组分的定性与定量检测方法
技术领域：
本发明涉及到一种井R霉素(Validamycin)相关产品中井R霉素定量检测的技术领域，更具体涉及一种井R霉素产品中井R霉素A及相关组分的定性与定量检测方法.可用于井R霉素相关产品各组分定性与定量检测及为生产高品质井R霉素产品提供依据。
背景技术：
井R霉素(Validamycin)是由吸水链球菌井R变种产生的水溶性抗生素葡萄糖苷类化合物，分子式C2tlH35O13N,分子量497.51，毒性低，纯品为白色无定型粉末，溶于水、二甲基甲酰胺，微溶于乙醇，不溶于丙酮、苯、乙酸乙酯、等有机溶剂，吸湿性强，在室温PH3-9水溶液中稳定。井冈霉素主要由井冈霉素A(Validamycin A, VA)、井冈霉素B(ValidamycinB, VM-B)、井冈霉素 C (Validamycin C，VM-C)、井冈霉素 D (Validamycin D, VM-D)、井网霉素 E (Validamycin E, VM-E)、井同霉素 F (Validamycin F，VM-F)、井网霉亚基胺 A(ValidoxylamineA, VxA-A)等组分组成。主要用于防治各类纹枯病，对稻曲病也有效，也可用于防治棉花、瓜类立枯病，其有效成分为井R霉素A (ISWA T, KAMEDAY, ASA IM, studieson validamycins, new antibiotics IV[J].Antibiotics.1971，24(2):119-123);VxA_A 是昆虫的海藻糖酶抑制剂，可开发为生物杀虫剂；井网胺和井网霉亚基胺是重要的糖苷霉抑制剂，是合成其他新酶抑制剂类降糖药的重要医药中间体和原药(金利群，井R霉亚基胺A的制备及其对海澡糖酶的抑制作用[D]。杭州:浙江工业大学，2003.)。井R霉素在我国已经形成了一个经济效益较高的生物技术产业，以井R霉素为原料开发附加值更高的医药品和安全性能更高的生物杀虫剂是十分必要的，具有社会和经济双重效益(上海农药研究所农抗组，《井R霉素》[M]，上海人民出版社，1977)。而获得这些高品质的井R霉素需要分离或纯化井R霉素各种组分，因此，采用有效的手段对井R霉素各组分进行定性和定量分析具有重要意义。目前，国内对井R霉素的定量分析方法有离子交换比色法、薄层荧光法(徐辉，薄层-荧光法测定井R霉素水剂，上海农学院报1998，16 (2):148-151.)、液相色谱法(GB/T9553-93)，前两者只能测定井R霉素总含量，不能将各组分分离并定量；GB/T9553_93所用的液相色谱法也只能将井冈霉素A分离并定量。日本在检测井冈霉素产品中的VA、VM-B, VM-C, VM-D, VM-E, VM-F, VxA-A方面也有相关报道，其检验方法采用100%的20mmol/L磷酸缓冲盐作为流动相，该方法虽然基本能分离井R霉素产品中的不同组分，但是各组分分离效果不够理想。其不足之处表现为:1、系统压力高达200bar以上，随着检测量的增加，压力会不断升高，高浓度高比例的缓冲盐很容易破坏色谱柱结构，导致色谱柱寿命极短；2、分析时间长达I小时，用于大量生产检验不够现实；3、由于时间长，峰形变差，而且随着时间的延长，很容易产生基线飘移，因此会造成定量不准确；4、响应值小，同样的进样浓度与进样量，其峰高与峰面积响应基本是本发明的三分之一。本发明灵敏度高、选择性好，井冈霉素产品中I VM-B, VM-C, VM-D, VM-E, VM-F, VxA-A均能达到基线分离；由于流动相中加入了 1% (体积比)甲醇作为流动相改性剂，缓冲盐浓度低，因此对系统压力、分析时间、基线飘移、色谱柱的寿命及准确度方面都有很大改善。所以此方法可以用于井R霉素产品的井冈霉素A及相关组分的定性与定量检测，也可用于井R霉素A及相关组分的分离、纯化与研究。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种井冈霉素产品中VA及VM-B、VM-C, VM-D, VM-E,VM-F、VxA-A等相关组分的定性与定量检测方法。本发明灵敏度高、选择性好，井R霉素产品中VA、VM-B、VM-C、VM-D、VM-E、VM-F、VxA-A均能达到基线分离；由于流动相中加入了 1%(体积百分数)甲醇作为流动相改性剂，缓冲盐浓度低，因此在系统压力、分析时间、基线飘移、色谱柱的寿命及准确度方面相对日本相关检测方法都有很大的改善。一种井R霉素A及六种相关组分的定性与定量检测方法，其步骤是:A、鉴别试验——定性:本鉴别试验可与井R霉素质量分数的测定同时进行。在相同的色谱操作条件下，井R霉素试样溶液中各组分色谱峰的保留时间与井R霉素标样溶液中井R霉素各组分色谱峰的保留时间，其相对差值应在1.5%以内。图6为运用本方法检测井R霉素标样的典型色图谱，各组分保留时间分别为:VA14.967min、VM-B3.616min、VM-C16.115min、VM-D8.555min、VM-E28.902min VM-F23.545min、VxA~A7.553min。因色谱柱的批次，流动相所用试剂批次、流动相pH值及仪器状态等细微差别，不同时间分析各组分的保留时间会略有差别。所述的井R霉素试样溶液与井R霉素标样溶液为B步骤中定量测定所配井R霉素试样溶液1、11与井R霉素标样溶液1、ΙΙ、ΠΙ。B、井R霉素各组分质量分数的测定—— —定量:1、试剂和溶液准备:试剂:新蒸二次蒸馏水，甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，无水磷酸氢二钾(分析纯)，浓硫酸(分析纯)。2.5mmol/L磷酸缓冲溶液:称取435.0mg无水K2HPO4于IOOOmL容量瓶中，加二次蒸馏水溶解，定容至IOOOmL,摇匀，用磷酸调至pH=7.0备用，使用前须用0.45 μ m的微孔滤膜过滤。0.05mol/L H2SO4溶液:取一支IOOmL容量瓶，加入约90mL 二次蒸馏水，用移液管移取浓硫酸0.28mL缓慢加入其中后用二次蒸馏水定容。井冈霉素标样(日本三井公司):已知井冈霉素A93.8%。2、仪器:高效液相色谱仪(Agilent-1100色谱系统):具可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、四元泵、真空脱气机。色谱数据处理工作站(Agilent)。色谱柱(日本YMC公司):250mmX4.6mm(id)不锈钢柱，YMC-PACK 0DS-AQ，粒径5μπι溶剂过滤器(津腾公司):滤膜孔径0.45 μ m。针头过滤器(津腾公司):滤膜孔径0.22 μ m。3、样品处理:井网霉素标样溶液:称取井网霉素标样(购于日本二井公司，VALIDAMYCINSTANDARD, Purity93.8%, LOT.N0.04 ①)110.0mg (精确至 0.1mg)至 50mL 容量瓶，加入2mL0.05mol/L H2S04, 二次蒸馏水定容，再分别移4、5、6mL至3个50mL容量瓶，二次蒸馏水定容，配成具一定浓度梯度的标样溶液1、标样溶液I1、标样溶液III。标样溶液1:井冈霉素A浓度约160.0 μ g/ml ；标样溶液I1:井冈霉素A浓度约200.0 μ g/ml ；标样溶液II1:井冈霉素A浓度约240.0 μ g/ml。试样溶液:分别称取适量(根据试样中井霉素A的含量选择合适的称样量，使稀释后的试样溶液中井R霉素A最终浓度与标样溶液II中井R霉素A浓度相当，准确至0.1mg)井冈霉素试样2次于2支50mL容量瓶中，二次蒸馏水定容。量取2mL此溶液于IOOmL容量瓶，二次蒸馏水定容，0.22 μ m过滤器过滤后备用，这样配得试样溶液1、试样溶液II。(试样溶液I与试样溶液II为同一试样分别取两次不同的称样量，配成井R霉素A浓度相当的平行试样溶液。做平行试样的目的是提高检测结果准确度，减小检测误差。)所述的井冈霉素(英文名称:Validamycin)分子式/ 结构式=C2tlH35O13N
权利要求
1.一种井R霉素各组分的定性与定量检测方法，其步骤是: A、鉴别试验定性: 本鉴别试验与井R霉素质量分数的测定同时进行，在相同的色谱操作条件下，井冈霉素试样溶液中各组分色谱峰的保留时间与井R霉素标样溶液中井R霉素各组分色谱峰的保留时间，其相对差值在1.5%以内，运用本方法检测井R霉素标样，各组分保留时间分别为:VA14.967min、VM-B3.616min、VM-C16.115min、VM-D8.555min、VM-E28.902minVM-F23.545min、VxA-A7.553min; B、井R霉素各组分质量分数的测定——定量: I)、试剂和溶液准备: 试剂:新蒸二次蒸馏水，甲醇，磷酸，无水磷酸氢二钾，浓硫酸； 溶液:2.5mmol/L磷酸缓冲溶液:称取435.0mg无水K2HPO4于I OOOmL容量瓶中，加二次蒸馏水溶解，定容至I OOOmL，摇匀，用磷酸调至pH=7.0备用，使用前用0.45 μ m的微孔滤膜过滤；0.05mol/L H2SO4溶液:取一支100 mL容量瓶，加入90mL 二次蒸馏水，用移液管移取浓硫酸0.28mL缓慢加入其中，并用二次蒸馏水定容； 2)、仪器: 高效液相色谱仪:具可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、四元泵、真空脱气机； 色谱数据处理工作站； 色谱柱:250_X 4.6m m 不锈钢柱，YMC-PACK ODS-AQ,粒径 5 μ m ; 溶剂过滤器:滤膜孔径0.45 μ m ; 针头过滤器:滤膜孔径0.22 μ m; 3)、样品处理: 井冈霉素标样溶液:称取井R霉素标样110.0 mg至50mL容量瓶，二次蒸馏水溶解，力口入2mL0.05mol/L H2S04, 二次蒸馏水定容，再分别移4、5、6mL至3个50mL容量瓶，二次蒸馏水定容，配成浓度梯度的标样溶液1、标样溶液I1、标样溶液III ; 标样溶液1:井冈霉素A浓度约160.0μδ/πι1 ； 标样溶液I1:井冈霉素A浓度约200.θμδ/πι I ； 标样溶液II1:井R霉素A浓度约240.θμδ/πι I ； 试样溶液:分别称取适量井R霉素试样2次于2支50mL容量瓶中，二次蒸馏水定容，量取2mL此溶液于IOOmL容量瓶，二次蒸馏水定容，0.22Mm过滤器过滤后备用，配得试样溶液1、试样溶液II，其井冈霉素A浓度约200.0Pg/m I; 4)、色谱操作条件: 流动相:2.5mmol/L磷酸缓冲液+甲醇=99+1 ； 流速:1.2mL/min ； 柱温:30°C ； 检测波长:2IOnm ； 进样体积:10 μ L ; 色谱柱:250_X4.6mm 不锈钢柱，YMC-PACK ODS-AQ,粒径 5 μ m; 5)、编制进样分析程序表: 编制进样程序表:进样顺序为标样溶液1、标样溶液I1、标样溶液II1、试样溶液1、试样溶液II，填写检测方法与样品信息；6)、测定: 在上述色谱条件下，待仪器基线平稳后，点击化学工作站中的开始按扭，色谱仪自动进样器自动抽取标样溶液I I Ομ 于定量环中定量,定量后的标样溶液I被流动相带入色谱柱进行分离，分离后的井R霉素各组分依次进入检测器流通池，检测器对井R霉素各组分采集数据并将色谱图及相关数据保存于电脑中，分析完毕的试样与流动相一起排入废液瓶中，这样完成标样溶液I进样分析，接着按标样溶液I1、标样溶液II1、试样溶液1、试样溶液II的顺序依次进样分析； 7)、数据分析: 从色谱工作站中调出标样溶液1、标样溶液I1、标样溶液III的图谱，进行较准、绘制标准曲线； 标准曲线回归方程Area=kXAmt +b, R2须大于或等于0.999,调出试样溶液1、试样溶液II的图谱，将试样溶液中井R霉素A的峰面积代入标准曲线回归方程计算出试样进样时井冈霉素A浓度Ca，则试样中井R霉素A的质量分数Xa (%)的计算式为: Xa= Ca X50X100X100/2/V 式中=Hi1——试样的质量，单位为毫克； Xa——井冈霉素A的质量分数，数值以％表示； Ca——试样进样时井网霉素A浓度，单位为微克/毫升； 试样中井R霉素A的质量分数为两次平行结果取平均值； 从试样图谱中查出试样中井R霉素A相关组分的峰面积Ax，用加热减量法测出试样的固形物百分含量S，粉剂试样其干物质含量即为其固形物百分含量S，则试样的纯度P为:P= Xa X100/ S式中: Xa为井R霉素A的质量百分含量； S为样品固形物质量百分含量； 井冈霉素A相关组分的质量分数X(%)的计算式为: X=Ax XP /Aa 式中: Aa为组分A峰面积， Ax为其它相关组分峰面积， P为试样纯度； 各组分质量百分数为两次平行结果取平均值； 8)、对井冈霉素产品中VA、VM-B、VM-C、V-MD、VM-E、VM-F、VxA-A七种组分进行定性并定量。
全文摘要
本发明公开了一种井冈霉素各组分的定性与定量检测方法，步骤A、鉴别试验B、井冈霉素各组分质量分数的测定1)、试剂和溶液准备:2)、仪器准备；3)、样品处理；4)、色谱操作条件5)、编制进样程序表；6)、测定仪器基线稳定后，点击化学工作站中的开始按扭，色谱仪自动进样器自动抽取标样溶液于定量环中定量，定量后的标样溶液被流动相带入色谱柱进行分离，分离后的井冈霉素各组分依次进入检测器流通池；7)、数据分析绘制标准曲线，记录各组分峰面积，接合标准曲线对井冈霉素各组分进行定量。本方法灵敏度高、选择性好，井冈霉素A及相关组分均能达到基线分离，能够对井冈霉素相关产品中各组分准确定性与定量。
文档编号G01N30/88GK103175906SQ20121030181
公开日2013年6月26日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者金海燕, 龚永华, 刘荷梅, 刘华梅, 李青, 叶绿笋, 刘强, 刘洋, 周莉, 胡凌云 申请人:武汉科诺生物科技股份有限公司