专利名称：用于检测生育相关人睾丸和附睾表达305种精子定位蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及检测领域，更具体地涉及检测生育相关的、人睾丸和附睾表达的305 种精子定位蛋白的方法，包括用荧光、酶标、银标、生物素、同位素、芯片等标记技术定性和定量地检测精子定位蛋白的方法。本发明还涉及用于检测所述精子定位蛋白的蛋白质芯片及其应用
背景技术：
男性不育是引起不孕症的重要因素之一。据2000年世界卫生组织(WHO)报道全球不育症约占15%，男方因素约占一半；在欧州一些国家不育症高达30%。导致男子不育的原因非常复杂广泛，涉及生殖系统解剖结构和功能、激素调节、遗传物质、感染免疫等诸多因素的异常和障碍。现阶段对这些因素的研究大多停留在单基因水平和基因组水平。然而，机体真正生理机能的执行者是蛋白质，所以上述分子遗传学研究并不能反映基因转录后的调控、蛋白质表达水平的变化以及蛋白质的翻译后修饰等信息，并且细胞内mRNA水平和蛋白质的表达丰度并不完全一致，因此从蛋白质水平对男性不育机制进行研究显得特别重要。研究表明，男性不育症不是一种独立的疾病，而是多种疾病或多因素综合作用的结果。虽然导致男子不育的原因非常复杂广泛，然而目前常规精液检测手段却非常局限，导致人们无法从整体上系统地分析精浆中的蛋白质表达水平。综上所述，迄今为止，人们对人类精子成熟引起的男性不育相关蛋白的了解尚不深入，更缺乏此类蛋白检测方法，因此迫切需要开发出检测男性生育相关蛋白的有效方法禾口广品。

发明内容
本发明的目的就是提供一种有效检测男性生育相关蛋白的方法以及产品。在本发明的第一方面，提供了一组与人精子成熟、男性生育相关蛋白的捕获试剂的用途，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，其中，所述的捕获试剂用于制备检测男性个体的男性生育相关蛋白表达情况的芯片或试剂盒。在另一优选例中，所述的男性生育相关蛋白包括至少5、10、15、20、25、30、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250、300 种列于表 2 中蛋白。在另一优选例中，所述是试剂是蛋白质芯片。在另一优选例中，所述的检测是定性或定量检测。在另一优选例中，所述的检测是对男性个体的精浆样品进行检测。在另一优选例中，所述的检测是对男性个体的精子样品进行检测。在另一优选例中，所述的捕获试剂是抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体抗体。在另一优选例中，所述的抗体具有一种或多种可检测的标记物。
在另一优选例中，所述的标记物主要为免疫荧光、酶标、银标、生物素、同位素等。在另一优选例中，所述的男性个体是人，尤其是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。在本发明的第二方面，提供了一种可用于检测睾丸或附睾表达的精子结合蛋白的芯片，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的男性生育相关蛋白的检测点，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白。在另一优选例中，所述的检测点固定有所述的男性生育相关蛋白的捕获试剂(如抗体)。在另一优选例中，男性生育相关蛋白包括至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250、300 种列于表 2 中蛋白。在另一优选例中，所述的固相载体选自下组玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜、微球等载体。在本发明的第三方面，提供了一种使用上述芯片鉴别男性不育相关蛋白的方法， 其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，所述鉴别包括以下步骤a)将来自待检测对象的精浆样品与包含针对男性不育相关蛋白的捕获试剂的芯片接触；b)从样品中捕获男性不育相关蛋白并产生第一个信号；C)将第一序号与标准品(包括阳性对照和阴性对照)的信号进行比较，获得定性或定量地确定所述男性不育相关蛋白的表达量；d)根据表达量确定导致男性不育的候选蛋白。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。


图1.附睾和睾丸蛋白的二维凝胶电泳分离QD)和质谱鉴定。其中A.附睾组织蛋白的2D参考图谱；B.附睾管腔液蛋白的2D参考图谱；C. HEL-S-128m质谱鉴定结果。图2.显示了用pET32b(+)载体构建的重组表达载体模式图。图3.显示了 HEL-S-15*，HEL-S_65p，HEL-S_6a蛋白精子免疫荧光定位分别定位在精子全身，尾部和顶体。图4.显示了 HEL-S-15*蛋白具有明显的抑菌活性。图5.显示了 HEL-S_15#蛋白的抗菌活性。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了在人附睾、睾丸中表达、与男性生育相关的多种特异性蛋白，从而确立与不育发生相关的重要蛋白质群。在此基础上开发了检测男性生育相关蛋白的方法和芯片的检测工具，从而完成了本发明。利用本发明所揭示的男性不育发生相关的蛋白质群，有助于人们揭示关键蛋白的分子作用机制和相互作用关系，从而提供了寻找男性不育原因的创新途径。男性生育相关蛋白如本文所用，术语“男性生育相关蛋白”指在男性哺乳动物(尤其人)的睾丸和/ 或附睾中表达的，与男性生育相关的蛋白。一般所述的男性生育相关蛋白包括保护精子的蛋白、与精子运动能力有关的蛋白、与精子穿卵有关的蛋白。如本文所用，“哺乳动物”指胎生并籍由乳腺哺育后代的动物种类，属于脊椎动物的一种代表性的哺乳动物包括(但并不限于)，例如人、猴、羊、牛、兔、马、小鼠、大鼠等，特别地优选人。—类特别适用于本发明的男性生育相关蛋白是睾丸和/或附睾的分泌蛋白，这些分泌蛋白有些存在于精浆中，有些定位在精子上。本发明的研究提示，这些男性生育相关蛋白与精子的成熟等过程密切有关，对于精子的获得正常的功能是至关重要的。如本文所用，术语“本发明蛋白”、“本发明的生育相关蛋白”、或“本发明的男性生育相关蛋白”可互换使用，都指本发明首次揭示其与男性生育相关性的睾丸和/或附睾中表达的在精子上有定位的蛋白。代表性的本发明蛋白如表2所示。表1已知的在精子上有明确定位的男性生育相关蛋白
权利要求
1.一组与人精子成熟、男性生育相关蛋白的捕获试剂的用途，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，其特征在于，所述的捕获试剂用于制备检测男性个体的男性生育相关蛋白表达情况的芯片或试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性生育相关蛋白包括至少5、10、 15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300 种列于表 2 中蛋白。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的捕获试剂是抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述是试剂是蛋白质芯片。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是定性或定量检测。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是对男性个体的精浆样品中精子定位蛋白进行定性或定量检测。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是对男性个体的精子上的定位蛋白进行定性或定量检测。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性个体是人，尤其是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。
9.一种可用于检测睾丸或附睾表达的精子定位蛋白的芯片，其特征在于，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的男性生育相关蛋白的检测点，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白。
10.一种使用权利要求9所述的芯片鉴别男性不育相关蛋白的方法，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，所述鉴别包括以下步骤a)将来自待检测对象的精浆样品与包含针对男性不育相关蛋白的捕获试剂的芯片接触；b)从样品中捕获男性不育相关蛋白并产生第一个信号；c)将第一序号与标准品(包括阳性对照和阴性对照)的信号进行比较，获得定性或定量地确定所述男性不育相关蛋白的表达量；d)根据表达量确定导致男性不育的候选蛋白。
全文摘要
本发明涉及用于检测人生育相关的人睾丸和附睾表达305种精子定位蛋白方法。更具体地，本发明提供了人精子成熟能够引起不育相关的重要蛋白质群，还提供了检测人精子定位蛋白在精子上和精浆中的定性与定量方法，为男性不育原因的明确诊断提供新途径。
文档编号G01N33/68GK102262159SQ20101019537
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者李建远 申请人:李建远