专利名称：变性梯度凝胶电泳检验dna聚合酶在pcr中的错配率的制作方法
技术领域：
聚合酶链反应(PCR)技术是目前分子生物学领域基本技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段，它在遗传学、法医学等领域有着广泛的应用。另外PCR扩增技术在分子克隆和DNA分析中有着以下几方面应用(1)核酸探针制作、(2)DNA文库建立、(3)DNA序列测定(4)突变分析等。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，任意位点的单碱基突变的DNA片段和原始的DNA片段能被分开，经过序列测定和比较就可以找出突变的位点。变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE)中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离，因为在含有呈线形增加梯度变性剂(尿素和甲酰胺)的混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迁移。
目前在分子生物学的许多研究领域要求在PCR过程中能够得到高保真的产物，以便为后续的研究减少实验误差，比如基因的定点突变研究和细胞内的基因突变分析等就对PCR过程有着更为严格的要求。在这类研究中，大多研究者在PCR过程中采用了Pfu DNA聚合酶代替了传统的Taq DNA聚合酶取得了较理想的结果。虽然大家都已公认，在PCR过程中Pfu DNA聚合酶比传统的TaqDNA聚合酶有着较好的保真性，但有关具体的在PCR过程中DNA聚合酶的保真率(反之即错配率)的检测方法尚未报道，本研究基于这一方面，提出了一种检测方法，即采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)的检测方法。
因为任何一种DNA聚合酶不可能具有100％保真性，所以某特定菌株的PCR产物过变性梯度凝胶电泳分离后的条带就不单一。在错配率计算上，以某一特定菌株的基因组DNA经PCR扩增后，用变性梯度凝胶电泳分离后的条带数应该为1个为参照，根据变性梯度凝胶电泳中各个样品的条带数的多少来分析不同DNA聚合酶的错配率。条带数目越多，说明在PCR扩增中的掺入错误率越高，这种DNA聚合酶的错配率就越大。
采用玻璃珠DNA胶回收试剂盒(上海生工，产品号SK111)，按照操作说明对DNA粗提液进行纯化，将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板，使用Applied Biosystem的GeneAmp PCR system 2700型基因扩增仪，采用对大多数细菌和古细菌的16SrRNA基因片段具有特异性的引物对F357GC和R518，它们的序列分别为F357GC(5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCGCCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG GAG-3′)，R518(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)，扩增片段长约230bp。100μL的PCR反应体系组成如下100ng的模板、30pmol每种引物、200μmol dNTPs(每种10mmol/L)、10μL的10倍PCR buffer(without MgCl2)、1.5mmol/L的MgCl2、5U的Taq DNA聚合酶或者Pfu DNA聚合酶(每个菌株样品分别采用Taq DNA聚合酶或者PfuDNA聚合酶进行扩增)、800ng的牛血清白蛋白BSA和适量的双蒸水补足100μL。PCR反应采用降落PCR策略，即预变性条件为94℃5min，前20个循环为94℃1min，65℃-55℃1min和72℃3min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，后10个循环为94℃1min，55℃1min和72℃3min最后在72℃下延伸7min。PCR反应的产物用1.7％琼脂糖凝胶电泳检测。
采用Bio-Rad公司Dcode的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离步骤如下(1)制备含有变性剂(尿素和甲酰胺的混合物)的10％的聚丙烯酰胺凝胶，其中变性剂的浓度从30％到50％(100％的变性剂为7M的尿素和40％的去离子甲酰胺)，(2)在每个加样孔加样含有10％的加样缓冲液的样品20-25μL，(3)在120V的电压下，60℃电泳6h，(4)电泳完毕后，将凝胶在EB中染色30min，(5)将染色后的凝胶置于YLN-2000凝胶影像分析系统下观察并拍照。
通过观察各个样品经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后的PCR产物的电泳条带数目，计算不同DNA聚合酶的错配率。实验结果参照说明书附图
。
由附图可见，目前普遍使用的Taq DNA聚合酶的错配率比Pfu DNA聚合酶的错配率大，必须根据研究的不同需要来选择合适的DNA聚合酶。
权利要求
1一种检测DNA聚合酶在聚合酶链反应PCR中对原始DNA模板序列扩增时的碱基错配率的方法，包括以下步骤a)选择用于实验的生物材料--纯的微生物菌株；b)将用于步骤a)中的实验菌株经划线分离，单菌落的液体培养，菌体细胞的离心收集和菌株基因组DNA的提取后，获得该菌株的基因组DNA；c)将步骤b)获得的基因组DNA纯化后作为模板，选用特定引物进行PCR扩增；d)将步骤c)获得的PCR扩增产物作为样品，选择合适的电泳条件，在一定胶浓度和特定变性剂范围的变性胶中电泳；e)将步骤d)后的变性胶经染色液染色一段时间后，观察每个泳道的电泳条带数的多少；f)根据每样品的电泳条带数目来检测用于该样品的DNA聚合酶在PCR扩增过程中的错配率。
2权利要求1的方法，其中步骤a)中的实验菌株可以为任何一种或几种微生物的纯菌株。本发明选用的实验菌株为Escherichia coli或Staphylococcus aureus或Agrobacterium tumerfaciens三株菌株。
3权利要求1的方法，其中步骤c)中基因组DNA的纯化方法为采用上海生工的玻璃珠DNA胶回收试剂盒，按照用户使用说明来进行。
4权利要求1的方法，其中步骤c)中的特定引物为F357和R518，并且在一个引物F357的5′端加GC-clamp，其序列为5′CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC C 3′。
5权利要求1的方法，其中步骤d)中的合适的电泳条件为使用Bio-Rad公司的DCode基因突变检测系统在120V，60℃下电泳6小时。
6权利要求1的方法，其中步骤d)中变性胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺等变性剂，变性剂浓度范围为从30％到50％，胶浓度为10％。
7权利要求1的方法，其中步骤e)中的染色液为溴化乙锭浓度为0.5μg/mL 1倍的TAE缓冲液，染色时间为30分钟。
8权利要求1的方法，其中步骤e)中观察电泳条带采用的是YLN-2000凝胶影像分析系统。
9权利要求1的方法，其中步骤f)中错配率检测方法为所选纯菌株的基因组DNA采用无错配率的DNA聚合酶在PCR扩增后的产物经变性梯度凝胶电泳后的条带数目应该为1个，根据各样品的PCR产物经变性梯度凝胶电泳后的条带数目来检测每个不同样品在PCR扩增过程中使用的DNA聚合酶的错配率，电泳条带数目越多，说明DNA聚合酶的错配率就越大。
全文摘要
本发明涉及一种用于聚合酶链反应(PCR)的DNA聚合酶的错配率的检测方法。具体步骤如下(1)选择特定的菌株作为实验用菌株；(2)对菌株进行纯化分离，挑单菌落液体培养菌体；(3)提取特定菌株的基因组DNA纯化后用作PCR反应的模板；(4)选择特异性引物，用不同的待检测的DNA聚合酶进行PCR扩增；(5)用变性梯度凝胶电泳对上述PCR产物进行分离；(6)电泳完毕后，染色，计数各样品条带的数目得出不同DNA聚合酶的错配率。这一发明对有些相关研究，特别是基因突变分析等对DNA聚合酶的要求很高的研究工作提供了检测DNA聚合酶的错配率的手段，为这类研究提供了一种保证实验正确性的方法。
文档编号G01N33/558GK1438483SQ0310454
公开日2003年8月27日 申请日期2003年2月18日 优先权日2003年2月18日
发明者齐鸿雁, 罗海峰, 张洪勋, 薛凯, 王晓谊 申请人:中国科学院生态环境研究中心